CC BY
43
УДК: 616.36-008.811.6: 615.015.4:547.532) -092.4/.9
РОЛЬ ДЕЗОКСИХОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ В
ИНГИБИРОВАНИИ АКТИВНОСТИ МОНООКСИГЕНАЗНОЙ, ГЛЮКУРО- И ГЛУТАТИОНКОНЪЮГИРУЮЩЕЙ СИСТЕМ ПЕЧЕНИ
КРЫС ПРИ ХОЛЕСТАЗЕ
М.И. Бушма (ст.н.сотрд.м.н.), Т.И. Хомич (ст.н. сотр., к.б.н.), И.В. Зверинский
(к.б.н.)
Гродненский государственный медицинский университет Институт оиохимии нанб, г. Гродно
Перевязка общего желчного протока (8 дней) и введение дезоксихолевой кислоты (ДОХ; в/ж, 250 мг/кг/ день, 8 дней) сопровождаются сходными однонапраленными изменениями в печени крыс, заключающимися в ингибиро-вании активности монооксигеназной, глюкуро- и глутатионтрансферазной систем. В механизме выявленных нарушений важную роль играет снижение активности основных ферментных систем антиоксидантной защиты печени: глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы и каталазы.
Ключевые слова: холестаз, дезоксихолевая кислота, биотрансформация ксенобиотиков в печени, антиокси-дантная система.
The common bile duct ligatiom (8 days) and the intoxication of rats with deoxycholic acid (intragastrically, 250 mg/ kg/day,8 days) are accompanied by similar unilateral changes in the liver involving inhibited activities of the monooxigenase, glucuro- and glutathione transferase systems. An importrant role in the mechanisms of disturbances found in cholestasis plays the decreased activities of the enzyme systems of the liver antioxidant protection: glutathione peroxydase, superoxide dismutase and catalase.
Key words: common bile duct ligation, deoxycholic acid, xenobiotic biotransformation, antioxidative system.
Введение.
Ингибирование лекарственно-метаболизирую-щей функции печени обнаружено при всех формах холестаза [11,14]. Механизмы этого эффекта сложные и многогранные. Считают, что основную роль в его развитии играет эндотоксемия (накопление в крови холатов и других составных компонентов желчи, а также промежуточных продуктов нарушенного обмена веществ, появляющихся в связи с заболеванием печени).
Целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка нарушений ксенобиотико-мета-болизирующей функции печени крыс в условиях прекращения тока желчи (перевязка общего желчного протока) и интоксикации ДОХ. Основой научной идеи настоящей работы явилось предположение о том, что накапливающаяся в печени при холестазе ДОХ играет важную роль в ингибирова-нии ксенобиотико-метаболизирующей функции печени.
Методы исследования.
Проведено две серии опытов.
I серия. Опыты проведены на 42 крысах-сам-
цах массой 170-200 г. Наркотизированным диэти-ловым эфиром животным перевязывали общий желчный проток. Контролем служили ложноопери-рованные крысы.
II серия. Опыты проведены на 20 крысах-самцах массой 200-230 г. ДОХ вводили в/ж с помощью зонда (250 мг/кг/день, в слизи крахмала в течение 8 дней). Контрольным животным вводили равный объем слизи крахмала. Крыс I и II серии декапитировали через 8 дней от начала опыта (через 24 часа после последнего введения ДОХ).
Функцию ксенобиотико-метаболизирующей функции печени оценивали по содержанию цитох-ромов Ь5 и Р450 (суммарно); скорости окисления NADPH; деметилирования аминопирина, этилми-орфина и гидроксилирования анилина; активности NADPH-цитохром Р 450 и NADPH-цитохром Ь5 редуктаз; УДФ-глюкозодегидрогеназы, УДФ-глю-куронил- и глутатион^-трансфераз, как описано ранее [1].
В условиях целого организма об активности этих систем судили по содержанию в плазме крови субстрата этой системы - антипирина [6], дли-
тельности наркотического действия субстрата. УДФ- глюкуронилтрансферазы - хлоралгидрата [10] и экскреции с мочой глюкуроновой кислоты
[15].
Состояние антиоксидантной системы печени оценивали по активности в гомогенате глутатион-пероксидазы [5], супероксиддисмутазы [4] и ка-талазы [3], содержанию восстановленного глута-тиона [12]. Активность АлАТ и содержание билирубина определяли в сыворотке крови [2].
Результаты и обсуждение. Установлено, что через 8 дней после перевязки общего желчного протока в сыворотке крови крыс, получивших 0,85% раствор №С1, регистрируется более чем семикратное возрастание уровня билирубина за счет как не-конъюгированной, так и
дегидрогеназы). Экскреция с мочой общей глюкуроновой кислоты при холестазе возрастает на 63 % за счет как неконъюгированной, так и конъюги-рованной форм. Коэффициент отношения конъюги-рованной к общей глюкуроновой кислоте снижается, что может свидетельствовать о снижении скорости глюкуроконъюгации эндогенных веществ. Длительность наркотического действия хлоралгидрата (субстрат УДФ- глюкуронилтрансферазы) удлиняется на 34 % (табл. 1).
Каталитическая активность микросомальной глутатион^-трансферазы субстрат- 1-хлор-2-4-ди-нитробензол (ХДНБ) при холестазе ингибируется в большей степени, чем соответствующей изофор-мы цитозольного фермента (табл. 1).
конъюгированной фракций. Активность ферментных систем микро-сомального окисления, глюкуро- и глутатион-конъюгации ксенобиотиков в этих условиях значительно ингибируется. Содержание цитохромов Р450 и Ь5, активность их редуктаз, скорость окисления NADPH, демети-лирования аминопирина, этилморфина и гидрокси-лирования анилина снижаются на 17-73% в сравнении с ложноопери-рованными животными. При этом часть цитохро-ма Р450 превращается в каталитически неактивную форму - цитохром Р420. Содержание неме-таболизированного антипирина (субстрат цитох-рома Р450) в плазме крови крыс с холестазом возрастает на 21 % (табл. 1).
Активность УДФ-глюкуронилтрансферазы ингибируется параллельно с падением скорости биосинтеза ее субстрата - УДФ-глюкуроновой кислоты (снижение активности УДФ-глюкозо-
Таблица 1. Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) и содержание билирубина в сыворотке крови; функция монооксигеназной, глюкуро- и глутатионконъюгирующей систем печени крыс с холестазом (перевязка общего желчного протока, 8 дней) и при введении дезоксихо-левой кислоты (ДОХ; в/ж, 250 мг/кг/день, 8 дней).
Показатель Ложная операция Перевязка желчного протока Контроль ДОХ
АлАТ, ммоль/л _ _ 2,06±0,14 (100) 4,69±0,56 (228)*
Билирубин (мкмоль/л): общий, 12,38± 0,83 (100) 90,61±2,10 (732)* _ _
неконъюгированный, 7,76±1,88 (100) 25,34±4,26 (327)* _ _
конъюгированный 2,61± (100) 63,73± 2,56 (2441)* _ _
Монооксигеназная система
Цитохром Р450, нмоль/мг белка 0,72 ±0,04 (100) 0,25± 0,08 (35)* 0,82 ±0,05 (100) 0,38± 0,09 (46)*
Цитохром Ь5, нмоль/мг белка 0,52± 0,02 (100) 0,38± 0,02 (73)* 0,54 ±0,07 (100) 0,35 ±0,05 (65)*
NADPH-цитохром Р 450 редуктаза, нмоль/мин/мг белка 0,23± 0,01 (100) 0,19 ±0,01 (83)* 0,26± 0,02 (100) 0,20 ±0,01 (77)*
NADPH-цитохром Ь5 редуктаза, нмоль/мин/мг белка 4,40 ±0,54 (100) 3,05± 0,18 (69)* 4,40± 0,23 (100) 2,51± 0,30 (57)*
Окисление NADPH нмоль/мин/мг белка 4,99 ±0,39 (100) 2,40± 0,26 (48)* 2,71 ±0,21 (100) 1,73 ±0,30 (64)*
№диметилирование аминопирина, нмоль/мин/мг белка 9,67 ±0,54 (100) 4,32± 0,39 (45)* 11,33± 0,28 (100) 3,83± 1,04 (34)*
№диметилирование этилморфина, нмоль/мин/мг белка 10,46 ±1,09 (100) 2,79± 0,36 (27)* _ _
Р-гидроксилиро-вание анилина, нмоль/мин/мг белка 0,55 ±0,03 (100) 0,25± 0,02 (46)* 0,67± 0,09 (100) 0,24± 0,04 (36)*
Антипирин, мкг/мл плазмы 15,52±0,25 (100) 18,50± 0,82 (121)* _ _
Результаты исследований, представленных в таблице 1, свидетельствуют об ингибирова-нии при холестазе в печени крыс каталитической активности ферментных систем микросо-мального окисления, глюкуро- и глутатион-конъюгации ксенобиотиков. Причем в большей степени нарушается функция мембранос-вязанных ферментов, что видно при сопоставлении активности мик-росомальной и цитозоль-ной глутатион^-транс-фераз (см. табл. 1).
Одной из возможных причин ингибирования ксенобиотико- метабо-лизирующей функции печени крыс с холеста-зом может быть снижение активности ферментов антиоксидантной защиты гепатоцитов. Результаты исследований, представленных в таблице 2, свидетельствуют в пользу данного предположения.
Установлено, что через 8 дней после пере-
Продолжение табл. 1
Показатель Ложная операция Перевязка желчного протока Контроль ДОХ
Глюкуроконъюгирующая система
УДф- глюкуронилтранс-фераза, нмоль/мин/мг белка 7,11±0,75 (100) 5,11± 0,61 (72)* 3,46± 0,22 (100) 2,59± 0,29 (75)*
УДФ-глюкозоде-гидрогеназа, нмоль/мин/мг белка 11,46± 0,74 (100) 7,28 ±0,50 (64)* 14,33± 1,17 (100) 10,42± 0,69 (73)*
Глюкуроновая кислота в моче (мг/ 15 часов); общая, 3,33± 0,23 (100) 5,42± 0,28 (163)* 3,48± 0,23 (100) 3,87 ±0,57 (111)
неконъюгированная, 0,79± 0,09 (100) 1,71 ±0,19 (216)* 0,77± 0,12 (100) 1,24 ±0,16 (161)*
конъюгированная, 2,53± 0,18 (100) 3,80± 0,28 (150)* 2,60± 0,24 (100) 3,00 ±0,44 (115)
конъюгированная/ общая 0,75± 0,01 (100) 0,68± 0,03 (91)* 0,77± 0,03 (100) 0,70 ±0,02 (90)*
Хлоралгидратный наркоз, мин 109,90± 7,19 (100) 147,80± 7,30 (134)* _ _
Глутатионконъюгирующая система
Микросомальная глутатион-8-трансфераза, нмоль ХДНБ/мин/мг белка 123,89 ±6,82 (100) 85,24 ±5,99 (69)* 78,11 ±6,98 (100) 53,62 ± 9,22 (69)*
Цитозольная глута-тион 8-трансфе-раза: мкмоль ХДНБ/мин/мг белка, 0,77± 0,04 (100) 0,71± 0,03 (88) 0,60 ±0,06 (100) 0,46± 0,1 (76)
нмоль СБФ/мин/мг белка 11,78 ±0,77 (100) 13,66± 1,25 (116) 7,99 ±0,37 (100) 6,61± 0,75 (83)
Примечание. В скобках - % изменения величин показателей по отношению к ложноопериро-ванным или контрольным крысам, принятым за 100 %. * - Р<0,05. СБФ- сульфобромфталеин.
вязки общего желчного протока в печени крыс снижается активность глутатионпероксидазы, супе-роксиддисмутазы и каталазы на 14-48 % в сравнении с ложнооперированными животными (табл. 2). Снижение каталитической активности основных внутриклеточных ферментов антиоксидантной защиты при холестазе является предпосылкой для активации свободнорадикальных процессов в печени при этом состоянии. Накапливающиеся в больших количествах реакционноспособные пери-кисные соединения повреждают мембранные образования гепатоцитов. Это подтвержается увеличением активности АлАТ в сыворотке крови (нарушение целостности плазматической мембраны) и снижением активности ферментов микросомаль-ного окисления, глюкуро- и микросомальной глу-татион^-трансфераз (повреждение мембран эн-
доплазматического ретикулума).
Известно,что при развитии холестаза после перевязки общего желчного протока в плазме крови животных значительно возрастает содержание желчных кислот, особенно гидрофобных [13].
Исходя из выше изложенного, мы предположили, что одним из возможных патогенетических факторов ингибирования ксенобиотико- метаболи-зирующей и антиоксидантной систем печени крыс при холестазе может выступать ДОХ.
Установлено, что введение интактным крысам ДОХ (в/ж, 250 мг/кг/день в слизи крахмала) в течение 8 дней сопровождается нарушением целостности плазматической мембраны гепатоцитов (судя по увеличению в сыворотке крови активности АлАТ (табл. 1).
Функция монооксигеназной, глюкуро- и глута-
тионконъюгирующей систем печени при этом значительно ингибируется. Содержание цитохромов
Р450 и Ь5, активность их редуктаз, скорость окисления NADPH, деметилирования аминопири-на и гидроксилирования анилина снижаются на 23
- 66%. Активность УДФ-глюкуронилтрансферазы и УДФ-глюкозодегидрогеназы ингибируется на 25
- 27%. Экскреция с мочой неконъюгированной глю-куроновой кислоты возрастает, в то время, как коэффициент соотношения конъюгированная/общая глюкуроновая кислота снижается. Активность мик-росомальной глутатион^-трансферазы снижается, а цитозольной - не изменяется (табл. 1).
Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что при перевязке общего желчного протока и интоксикации ДОХ в печени крыс развиваются сходные количественные и качественные морфо-функциональные изменения: ингибируется функция мембраносвязанных ферментных систем микросомального окисления, глюкуро- и глутатионконъюгации ксенобиотиков. Закономерность выявленных нарушений, по-видимому, свидетельствует о важной роли ДОХ в развитии нарушений структуры и функции печени крыс при холестазе.
В механизме мембраноповреждающего действия ДОХ (эндо- и экзогенного происхождения), сопровождающегося ингибированием активности мембраносвязанных ферментных систем биотрансформации ксенобиотиков в печени, по-видимому, основную роль играют её прооксидантные, детер-гентные и фосфолипазоподобные свойства [7- 9].
Выводы.
1. Через 8 дней после перевязки общего желчного протока у крыс ингибируется активность мо-нооксигеназной, глюкуро- и глутатионконъюгиру-ющей систем печени.
2. Введение интактным крысам ДОХ (в/ж, 250 мг/кг/день, 8 дней) сопровождается аналогичными изменениями.
3. В механизме выявленных нарушений ксенобиотикометаболи-зирующей функции печени важную роль играет ингибирование активности ферментов анти-оксидантной системы органа: глутатионперок-сидазы, супероксиддис-мутазы и, особенно, ка-талазы.
Литература
1. Бушма М.И., Легонькова Л.Ф., Абакумов Г.З., Заводник Л.Б. Влияние длительного введения ундевита и его комбинации с кордиамином на гидроксилирующую, глюкуро- и глутатион-конъюгирующую системы и перекисное окисление липидов печени интактных крыс // Вопросы питания. - 1994. - № 6. - С. 12-15.
2. Колб В.Г., Камышников В.С. Справочник по клинической химии. -Мн.: "Беларусь", 1982. - 366 с.
3. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. - 1988. -№ 1. - С. 16-19.
4. Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Т.В. Простой и чувствительный метод определения активности СОД, основанный на реакциях окисления кверцетина // Вопр. мед. химии. - 1990.
- Вып. 2. - С. 88-91.
5. Моин В.М. Простой и специфический метод определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах // Лаб. дело. -1986. - № 12. - С. 724-727.
6. Bradie B.B., Axelrod J., Solerman R., Levy B.B. The estimation of antipirine in biological materials // J. Biol. Chem. - 1949. - Vol. 179, № 1. - P. 25-30.
7. Koganezawa M., Shimada I. Inositol 1,4,5-triphosphate transduction cascade in taste reception of the fleshfly // J. Neurobiol. - 2002. -Vol. 1, № 1. - P. 66-83.
8. Lechner S., Muller L.U., Schlottmann K., Jung B., McClelland M., Ruschoff J., Welsh J., Scholmerich J., Kullmann F. Bile acids mimic stress induced upregulation of thioredoxin reduclase in colon cancer cell lines // Carcinogenesis. - 2002. - Vol. 23, № 8. - P. 12811288.
9. Matsui K., Nishioka M., Ikeyoshi M., Matsumura Y., Mori T., Kajiwar T. Cocumbler root lipoxygenase can aclon acyl groups in phosphatidylcholine // Biochim. Biophys. Acta. - 1998. - Vol. -1390, № 1. - P. 8-20.
10. Merrill J.C., Bray T.M. The effect of dietary protein quantity on the activity of UDP-glucuronyltrasferase and physiological significance in drug metabolism // Can. J. Physiol. Pharmacol. -1982. - Vol. 60, № 12. - P. 1556-1561.
11. Park E.J., Ko G., Sohn D.H. Biotransformation of theophylline in cirrhotic rats induced by biliary obstruction // Arch. Pharm.Res.
- 1999. - Vol. 22, № 1.- P. 60-67.
12. Sedlak G., Lindsay R.H. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman's reagent // Anal. Biochem. - 1968. - Vol. 25, № 1. - P. 192-205.
13. Shefer S., Kren B.T., Salrn G., Stea C. J., Nguyen L.B., Chen T., Tinct G.S., Batta A.K. Regulation of bile acid synthesis by deoxycholic acid in the rat: different effects on cholesterol 7, alpha-hydroxylase and sterol 27-hydroxylase // Hepatol. - 1 995
- Vol. 22, Pt. 1. - P. 1215-1221.
14. Tanaka M., Nakura H., Tateishi T., Watanabe M., Nakaya S., Kumai T., Kobayashi S. Ursodeoxycholic acid prevents hepatic cytochrome P 45 0 isozyme reduction in rats mith deoxycholic acid - induced liver injury // J. Hepatol. - 1 999. - Vol. 31, № 2. -P. 263-270.
15. Yuki H., Fishman W.H. A carbazole method for the differential analysis of glucuronate, glucosiduronate and hyaluronate // Biochim. Biophys. Acta. - 1963. - Vol. 69. - P. 576-578.
Таблица 2. Активность глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы и каталазы в печени крыс с холестазом (перевязка общего желчного протока, 8 дней).
Показатель Ложная операция Перевязка протока
Глутатионпероксидаза, 6,50 0,12 4,97 0,23
мкмоль/мин/мг белка (100) (76)*
Супероксиддисмутаза, 2,11 0,12 1,81 0,08
ЕД/мин/мг белка (100) (86)*
Каталаза, мкмоль/мин/г 51,73 0,76 27,13 5,02
печени (100) (52)*
Примечание. В скобках - % изменения величин показателей по отношению к ложноопериро-ванным крысам, принятым за 100%. * - Р<0,05.
