CC BY
35
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
DOI: 10.23868/202011006
РОЛЬ АУТОФАГИИ В ОТВЕТЕ КЛЕТОК ЭПИТЕЛИАЛЬНОГО РАКА ЯИЧНИКА НА ВОЗДЕЙСТВИЕ ЦИСПЛАТИНОМ И РАЗВИТИЕ ЦИСПЛАТИНОВОЙ УСТОЙЧИВОСТИ
А.М. Мазитова, Ю.А. Топчу, Л.А. Мингазова, Э.М. Биктагирова, З.И. Абрамова, Р.Т. Габбасов
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
Поступила: 18.11.2019 Принята к печати: 14.07.2020 Опуликована on-line: 02.12.2020
ROLE OF AUTOPHAGY IN RESPONSE OF EPITHELIAL OVARIAN CANCER CELLS TO CISPLATIN TREATMENT AND CISPLATIN RESISTANCE
A.M. Mazitova*, Iu.A. Topchu*, L.A. Mingazova, E.M. Biktagirova, Z.I. Abramova, R.T. Gabbasov
Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
e-mail: [email protected]
При заболевании раком яичника доказана обратная корреляция между выживаемостью пациента и степенью метастазирова-ния. Одним из основных методов лечения рака яичника является химиотерапия на основе платиновых препаратов, в число которых входит цисплатин. Однако у большинства пациентов с раком яичника развивается устойчивость к цисплатину. Целью работы было исследование роли макроаутофагии в ответе клеток эпителиального рака яичника линии Caov-3 на воздействие цисплати-ном, а также в развитии цисплатиновой устойчивости in vitro.
Уровень аутофагии оценивали методом иммуноблотинга путём детекции количества маркеров аутофагии LC3-I и LC3-II. Было показано, что воздействие цисплатином индуцирует аутофагию в клетках эпителиального рака яичника линии Caov-3 in vitro, а также увеличивает скорость клеточной миграции на двумерном субстрате. Добавление в среду фармакологического ингибитора аутофагии вортманнина привело к понижению цисплатин-индуцированной миграции клеток Caov-3. В клетках с развившейся цисплатиновой устойчивостью наблюдалось повышение базового уровня маркеров аутофагии.
Полученные данные указывают на роль аутофагии в развитии устойчивости клеток эпителиального рака яичника к платиносодер-жащим препаратам, а также на возможное участие цисплатин-ин-дуцированной аутофагии в метастазировании опухолей яичника.
Ключевые слова: рак яичника, аутофагия, клеточная миграция, лекарственная устойчивость.
Ovarian cancer survival rate is inversely associated with the extent of tumor metastasis. One of the main treatment approaches against ovarian cancer is employment of platinum based therapies, including cisplatin. Majority of ovarian cancer patients develop cisplatin resistance. We aimed to investigate roles for macroau-tophagy in response of epithelial ovarian cancer cells to cisplatin, including changes in cell motility, as well as in development of cis-platin resistance.
Cisplatin treatment induced autophagy in Caov-3 cells in vitro, as well as resulted in increased cell motility. Pharmacologic inhibition of autophagy by wortmannin eliminated the effect of cisplatin on cell motility. We further selected Caov-3 cells with acquired cis-platin resistance and observed elevated baseline expression of au-tophagy markers in the resistant cells.
Our data indicate a role for autophagy in development of cisplatin resistance by the EOC cells, as well as a potential role for cisplatin-induced autophagy in ovarian tumor metastasis.
Keywords: ovarian cancer, autophagy, cell motility, drug resistance.
Введение
Заболеваемость раком яичников (РЯ) в 2018 г. превысила 295 000 случаев, летальный исход был зафиксирован у более 184 000 женщин в мире [1]. Относительная 5-летняя выживаемость при РЯ в мире не превышает 40% [2]. Это связано с затруднённой ранней диагностикой и невысокой эффективностью стандартного лечения: максимального хирургического удаления опухоли и химиотерапии, в первую очередь препаратами платины, в число которых входит цисплатин [3]. Более 90% случаев РЯ являются эпителиальными [2]. Несмотря на то, что поначалу клетки эпителиального рака яичника (ЭРЯ), как правило, проявляют чувствительность к цисплатину, в большинстве случаев опухоли рецидивируют в цисплатин-устойчивую форму [3].
Выживаемость при ЭРЯ напрямую связана со степенью метастазирования опухоли. Пятилетняя выживаемость пациенток без метастазов (менее 1/5 диагностированных случаев) составляет до 90% [4], с множественными метастазами в брюшной полости — менее 20% [5].
Термином «аутофагия» называют совокупность внутриклеточных молекулярных процессов, при которых повреждённые или неиспользуемые внутриклеточные компоненты окружаются фагосомой с двойной мембраной и подвергаются лизосомальной деградации. Аутофагия может приводить к одной из форм программируемой
клеточной гибели [6]. Описаны три типа аутофагии: макро-аутофагия, микроаутофагия и шаперон-опосредованная аутофагия [6]. В настоящей работе под термином «ауто-фагия» мы подразумеваем макроаутофагию. В физиологических условиях аутофагия способствует выживанию клетки во время стрессов, таких как недостаток кислорода или питательных веществ. В процессе злокачественной трансформации клетки аутофагия поначалу играет цито-протекторную роль, в частности, нейтрализует активные формы кислорода, которые способны привести к повреждениям ДНК. По мере дальнейшей малигнизации трансформированные клетки, вероятно, используют аутофагию для адаптации к агрессивным условиям, к которым, кроме гипоксии и метаболического стресса, можно отнести и действие химиотерапевтических препаратов [7]. Показано, что индукция аутофагии может способствовать метастазиро-ванию различных солидных опухолей [8].
Повышение уровня аутофагии в ответ на культивирование в среде с содержанием цисплатина было показано на ряде раковых клеточных линий [9-11]. Для цисплатин-устойчивых раковых клеток, в том числе и рака яичника, было описано повышение базового уровня аутофагии [12, 13]. Следует отметить, что многие работы, рассматривающие взаимосвязь между аутофагией и цисплатиновой устойчивостью при ЭРЯ, выполнены на клеточных линиях БКОУЗ и А2780 [12,
14, 15], молекулярный профиль которых недостаточно соответствует молекулярным особенностям клеток эпителиального рака яичников [16].
Целью работы было исследование роли макроау-тофагии в ответе клеток эпителиального рака яичника линии Caov-3, в том числе изменение скорости их миграции, на воздействие цисплатином, а также в развитии цисплатиновой устойчивости in vitro.
Материал и методы
Дизайн эксперимента
Эксперименты были выполнены на клеточной линии высокоагрессивного ЭРЯ человека Caov-3. Роль ауто-фагии в ответе клеток на воздействие цисплатином оценивали по эффекту цисплатина (2,5; 5,0; 10,0 мкМ) на синтез маркеров аутофагии LC3-I и LC3-II методом иммуноблотинга. Влияние цисплатин-индуцированной аутофагии на клеточную миграцию определяли по скорости миграции клеток в царапину, нанесенную в клеточном монослое. Для исследования роли аутофагии в развитии лекарственной устойчивости была получена сублиния Caov-3, резистентная к цисплатину, устойчивость клеток к цисплатину анализировали по показателю кратности резистентности.
Клеточная линия
Перед началом работы была проведена верификация клеток линии Caov-3 по амплификации коротких тан-демных повторов (GORDIZ, Россия). Клетки Caov-3 культивировали в питательной среде DMEM, содержащей 4,5 г/л глюкозы, 10% фетальной бычьей сыворотки и по 1% пенициллина, стрептомицина и L-глутамина, в COg-инкубаторе при стандартных условиях (5% CO2, 37 °С). Для культуральной работы использовали реактивы фирмы Панэко (Россия).
Иммуноблоттинг
Клетки культивировали до образования субконфлю-ентного монослоя (80-90%), лизировали в течение 30 мин. на льду в буфере RIPA (25 мМ Трис-HCl, pH 7,6; 150 мМ NaCl; 1% NP-40; 1% дезоксихолат натрия; 0,1% SDS), содержащем ингибиторы фосфатаз и протеаз (Thermo Fisher Scientific, США), лизат центрифугировали в течение 30 мин. при 15 000 об/мин. и +4 °С, супер-натант переносили в чистые пробирки. Общую концентрацию белка измеряли колориметрическим методом с использованием набора Pierce™ bCa Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) и универсального планшетного ридера (TecanInfinite F PLEX, Швейцария) при длине волны 560 нм. Пробы для электрофореза готовили в буфере Laemmli: 0,278 М Трис-HCl, pH 6,8; 4,4% SDS; 40% глицерин; 1,43 M бета-меркаптоэтанол; 0,02% бромфеноло-вый синий. Образцы прогревали 5 мин. при +95 °C. Белки разделяли в 15% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях при напряжении 120 V. Перенос на PVDF-мембрану производили в течение 2 ч. в буфере для переноса (25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 20% (v/v) метанол) при напряжении 100 V. После окончания переноса мембрану блокировали в 3% сухом обезжиренном молоке в TBST-буфере (50 mM Трис; 150 mM NaCl, pH 7,5; 0,1% Твин 20) в течение 1 ч. при комнатной температуре, инкубировали в растворе первичных антител (разведение согласно протоколу фирмы-производителя) в течение ночи при +4 °C, трижды промывали в буфере TBST, инкубировали в течение 1 ч. при комнатной температуре в растворе вторичных
антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, трижды промывали в TBST и проявляли с помощью системы гель-документирования ChemiDoc™ XRS+ (Bio-Rad, США] с применением хемилюминесцентного субстрата Clarity ECL Substrate (Bio-Rad]. Для проведения иммуноблотинга использовали антитела, связывающиеся с обеими формами белка LC3 (LC3-I и LC3-II) (#4108, Cell Signaling, США]. Загрузочный контроль, GAPDH, выявляли при помощи соответствующих антител (#PA1-987, Thermo Fisher Scientific, США].
Анализ миграции клеток
Клетки высевали в 6-луночный планшет в культуральной среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. При достижении субконфлюэнтности 85-90% на монослой наносили скарификацию (дефект] стерильным 1 0 мкл наконечником для автоматической пипетки. Лунки промывали PBS, добавляли цисплатин или вортманнин (6 мкМ и 100 нМ, соответственно] или оба вещества, разведённые в среде DMEM. Клетки инкубировали 24 ч. в С02-инкубаторе (5%, 37 °С]. В начале и в конце эксперимента лунки фотографировали в пяти случайно выбранных полях зрения при помощи микроскопа EVOS FLoid Cell Imaging Station (Thermo Fisher Scientific, США]. Скорость клеточной миграции оценивали по усредненному показателю пройденного расстояния в пикселях.
Получение клеток Caov-3,
устойчивых к цисплатину
Клетки Caov-3 высевали в количестве 3х105 на лунку в 2 мл питательной среды DMEM в 6-луночные планшеты, культивировали до образования субконфлюентного монослоя (70-80%], добавляли цисплатин в концентрации 0,5 мкМ, инкубировали в течение 72 ч., меняли среду с цисплатином на среду без цисплатина и инкубировали еще 72 ч. При жизнеспособности клеток более 50% и отсутствии очевидных морфологических изменений, культивирование клеток в среде с содержанием циспла-тина повторяли. В следующем цикле концентрацию цисплатина увеличивали в 1,5 раза. В таком режиме клетки культивировали в течение 6 мес., после чего определяли их жизнеспособность. Контролем служили клетки родительской линии, которые культивировали в тех же условиях. Устойчивость клеток к цисплатину проверяли по показателю кратности резистентности — соотношению показателя полумаксимального ингибиро-вания IC50 устойчивой линии к IC50 родительской линии.
Статистический анализ
Статистический анализ данных клеточной миграции проводили при помощи компьютерной программы Graph Pad Prism 6. Использовали непараметрический ANOVA тест (критерий Краскела-Уоллеса]. Статистически значимыми считали результаты со значением p<0,05.
Результаты и обсуждение
Эффект цисплатина на индукцию
аутофагии в клетках ЭРЯ
Уровень аутофагии оценивали методом иммунобло-тинга путём детекции количества белка LC3, который присутствует в клетке в двух формах: свободной — LC3-I и связанной с мембраной фагофоры — LC3-II.
А
Caov-3
Рис. 1. Индукция аутофагии в клетках ЭРЯ цисплатином: А — IC50 цисплатина для клеточной линии Caov-3, инкубирование в среде с различными концентрациями цисплатина в течение 72 ч., значение среднего со стандартным отклонением; Б — индукция аутофагии в клетках Caov-3 цисплатином, инкубирование в среде с цисплатином в течение 12 ч., соотношения значений уровня синтеза LC3-II/LC3-I для данной концентрации представлены под фотографиями иммуноблотов
Б
А Б
Рис. 2. Результат оценки миграционной активности клеток ЭРЯ на двумерном субстрате при культивировании в среде с цисплатином: А — квантификация миграции клеток Caov-3, значение среднего из трёх независимых экспериментов со стандартным отклонением; Б — примеры микрофотографий дефекта монослоя в начале и в конце эксперимента; фронт мигрирующих клеток отмечен белым пунктиром; шкала — 125 мкм; *** — p<0,001, **** — p<0,0001
LC3-I и LC3-II используются как маркеры аутофагии, уровень белка LC3-II пропорционален количеству ауто-фагосом в клетке, повышение соотношения количества связанной формы белка LC3-II к цитозольной форме LC3-I говорит об активации аутофагии [17].
Литературные данные подтверждают индукцию ауто-фагии под действием различных классов лекарственных препаратов [18], в том числе цисплатина [9, 10, 13]. Предполагают, что в присутствии цитотоксичных препаратов аутофагия может играть цитопротекторную роль и повышать жизнеспособность клеток [19]. Индукция аутофагии цисплатином была показана на клеточных линиях нескольких видов рака, в том числе ЭРЯ [12, 13]. В нашем исследовании концентрация IC50 цисплатина для клеточной линий Caov-3 равнялась 6,87 |jM (рис. 1А). Оценка изменения уровня маркеров аутофагии при инкубации клеток данной линии в среде, содержащей различные концентрации цисплатина (меньше, приблизительно равной и больше, чем IC50; см. рис. 1Б), выявила дозоза-висимое повышение соотношения LC3-II/LC3-I в клетках линии Caov-3 после инкубации в течение 12 ч., что свидетельствует об индукции аутофагии и согласуется с более ранними публикациями [20, 21].
Влияние цисплатин-индуцированной
аутофагии на подвижность клеток ЭРЯ
При определении влияния индуцированной циспла-тином аутофагии на клеточную миграцию был проведен классический анализ миграции клеток в механически
нанесенный дефект монослоя. Для проверки участия в данном процессе аутофагии в эксперимент был включен фармакологический ингибитор аутофагии вортман-нин — ингибитор PI3K, блокирующий секвестрацию — начальный этап аутофагии [22].
Через 24 ч. инкубации клеток в среде с цисплатином было выявлено, что скорость миграции клеток увеличилась по сравнению с контролем (рис. 2А; примеры микрофотографий дефекта монослоя — рис. 2Б). Инкубирование клеток в среде, содержащей только ингибитор аутофагии вортманнин, не привело к статистически значимым изменениям в миграции клеток Caov-3 по сравнению с контролем (инкубация клеток в среде без цисплатина и вортман-нина). При культивировании клеток в среде, содержащей цисплатин и вортманнин, было отмечено значительное снижение миграционной способности клеток по сравнению с клетками, которые подвергали воздействию только цисплатина. Полученные результаты подтверждают, что аутофагия участвует в ответе клеток ЭРЯ на воздействие цисплатином, в том числе может влиять на миграцию, индуцированную данным препаратом, и позволяют предположить, что аутофагия, индуцированная цисплатином, может способствовать метастазированию ЭРЯ.
Оценка уровня аутофагии в клетках
ЭРЯ, устойчивых к цисплатину
В полученных клетках Caov-3R, устойчивых (resistant- устойчивые) к циспластину, концентрация IC50 циспластина в 2,43 раза превысила
Caov-3
LC3-I LC3-II
GAPDH
5b
LC3-II/LC3-I 2,1
#
CP
6,5
Рис. 3. Уровень синтеза маркеров аутофагии в клетках ЭРЯ с развитой устойчивостью к цисплатину: А — 1С50 в клетках родительской линии Саоу-3 (5,04 мкМ) и клетках резистентной линии Саоу-ЗЯ (12,25 мкМ); средние
Б
А
120%-
чР о4.
зГ iod%-
о
к
<и
80%-
Л
(-
ы о
X 60%-
ю
О 50%.
С 40%-
О OJ
S 20%-
эе
0%-|---,-^.ТТ..,
0.1 1 10 100
Цисплатин (цМ)
IC50 родительской линии и составила через 72 ч. инкубирования 12,25 мкМ в опыте и 5,04 мкМ в контроле (рис. 3А). В резистентных клетках было обнаружено троекратное повышение базового уровня синтеза LC3-II относительно LC3-I (рис. 3Б). Наши результаты согласуются с ранее опубликованными данными [12, 13] и подтверждают участие аутофагии в развитии устойчивости клеток ЭРя к цисплатину.
Заключение
В отличие от некоторых ранее опубликованных работ, настоящее исследование проведено на клеточной линии Caov-3, отражающей молекулярные особенности клеток ЭРЯ [16]. Показана прямая корреляция между цисплатин-индуцированной ауто-фагией и миграцией клеток ЭРЯ in vitro. Важным результатом является получение резистентной клеточной линии, на которой можно будет изучать молекулярные механизмы влияния аутофагии
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Bray F., Ferlay J., Soerjomataram I. et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. A Cancer J. Clinicians 2018; 68(IV): 387-506.
2. Reid B.M., Permuth J.B., Sellers T.A. Epidemiology of ovarian cancer: a review. Cancer Biol. & Med. 2017; 14(I): 9-32.
3. Cortez A.J., Tudrej P., Kujava K.M. et al. Advances in ovarian cancer therapy. Cancer Chemother. Pharmacol. 2018; 81(I): 17-38.
4. Bast R.C., Jr, Hennessy B., Mills G.B. The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation. Nature reviews Cancer 2009; 9(6): 415-28.
5. Freedman R.S., Deavers M., Liu J. et al. Peritoneal inflammation — A microenvironment for Epithelial Ovarian Cancer (EOC). J. Transl. Med. 2004; 2(1): 23.
6. Рябая О.О., Егорова А.В., Степанова Е.В. Роль аутофагии в механизмах гибели опухолевых клеток. Успехи современной биологии 2015; 135(II2): 177-88. [Ryabaya O.O., Egorova A.V., Stepanova E.V. The Role of Autophagy in Mechanisms of Tumor Cell Death. Advances in Modern Biology 2015; 135(II2): 177-88].
7. Peracchio С., Alabiso O., Valente G. et al. Involvement of autophagy in ovarian cancer: a working hypothesis. J. Ovarian Res. 2012; 5: 22.
8. Mowers E., Sharifi M., Macleod K. Autophagy in cancer metastasis. Oncogene 2017; 36: 1619-30.
9. Takahashi A., Kimura T., Takabatake Y. et al. Autophagy guards against cisplatin-induced acute kidney injury. Am.J. Pathol. 2012; 180: 517-25.
10. Chen J., Zhang L., Zhou H. et al. Inhibition of autophagy promotes cisplatin-induced apoptotic cell death through Atg5 and Beclin 1 in A549 human lung cancer cells. Mol. Med. Rep. 2018; 17(V): 6859-65.
11. Fan Z., Huangfu X., Liu Z. Effect of autophagy on cisplatin caused bladder cancer cell apoptosis. Panminerva Med. 2016; 59: 1-8.
значения, полученные в трёх независимых экспериментах, со стандартными отклонениями; Б — повышение соотношения уровня синтеза 1_С3-11/1_С3-1 в цисплатин-резистентных клетках ЭРЯ
на функциональные особенности клеток ЭРЯ при воздействии цисплатином.
Благодарности
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18-31500317. Авторы выражают признательность к. б. н. И.Г. Серебрийскому за комментарии на этапе планирования работы и обсуждение полученных результатов, к. б. н. А А. Киселёвой за конструктивную критику полученных результатов, их оформление, коррекцию текста рукописи и Т.М. Габбасову за коррекцию текста рукописи.
Вклад авторов
Дизайн экспериментов: РГ, ЗА; проведение экспериментов: АМ, ЮТ, ЛМ, ЭБ; анализ данных: РГ, АМ, ЮТ; подготовка рисунков: АМ, ЮТ, РГ, ЛМ; работа над текстом: РГ, ЗА. А. Мазитова и Ю. Топчу внесли в работу равный вклад.
12. Bao L., Jaramlllo M.C., Zhang Z. Induction of autophagy contributes to cisplatin resistance in human ovarian cancer cells. Mol. Med. Rep. 2014; 11(I): 91-8.
13. Wang J., Wu G.S. Role of autophagy in cisplatin resistance in ovarian cancer cells. J. Biol. Chem. 2014; 289: 17163-73.
14. Zhu J., Zheng Y., Zhang H. et al. Low concentration of chloroquine enhanced efficacy of cisplatin in the treatment of human ovarian cancer dependent on autophagy. Am.J. Transl. Res. 2017; 9(IX): 4046-58.
15. He J., Yu J.J., Xu Q. Down regulation of ATG14 by EGR1-MIR152 sensitizes ovarian cancer cells to cisplatin-induced apoptosis by inhibiting cyto-protective autophagy. Autophagy 2015; 11(II): 373-84.
16. Domcke S., Sinha R., Levine D.A. et al. Evaluating cell lines as tumour models by comparison of genomic profiles. Nat. Commun. 2013; 4: 2126.
17. Klionsky D.J., Abdelmohsen K., Abe A. et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy 2016; 12: 1-222.
18. Han W., Pan H., Chen Y. et al. EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors Activate Autophagy as a Cytoprotective Response in Human Lung Cancer Cells. PLoS One 2011; 6: 18691.
19. Green D.R., Galluzzi L., Kroemer G. Mitochondria and the autophagy-inflammation-cell death axis in organismal aging. Science 2011; 333: 1109-12.
20. Wu T., Liang X., Wang M.C. et al. Autophagy facilitates lung adenocarcinoma resistance to cisplatin. Drug Des. Devel. Ther. 201 5; 9: 6421-31.
21. Chen X., Zhang L., Ding S. et al. Cisplatin combination drugs induce autophagy in HeLa cells and interact with HSA via electrostatic binding. RSC Adv. 2017; 7: 22270-9.
22. Yang Y.P., Hu L.F., Zheng H.F. et al. Application and interpretation of current autophagy inhibitors and activators. Acta pharmacol. Sinica 2013; 34(5): 625-35.
