CC BY
45
УДК 616.65-002 - 006
РОЛЬ АПОПТОЗА В ПАТОГЕНЕЗЕ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Л.М. Гориловский, М.Б. Зингеренко
Москва
Общепринято представление о том, что скорость роста опухоли определяется ее пролифе-ративной активностью (Напалков и др., 1996; Farber E., 1995; Sporn M., 1996).
Однако хорошо известно, что опухоли с одинаковым митотическим индексом могут обладать разной скоростью роста, и многие исследователи подчеркивают, что прямая связь между митотической активностью и скоростью роста опухоли отсутствует (Алов И.А., 1972; Казанцева И.А., 1980; Райхлин Н.Т., 1993; Райхлин Н.Т. и соавт., 1996, 2002; Buchsel P. et al., 2002). Поэтому ряд авторов сделали предположение, что наряду с пролиферацией в опухолях имеются и механизмы элиминации опухолевых клеток, т. е. апоптоз — генетически запрограммированный процесс естественной смерти клеток, при этом уничтожение клеток путем апоптоза, в отличие от некроза, обеспечивает минимальное повреждение тканей (Ken J., 1972; Wyllie A. et al., 1991, 980; Bursch W., 1991; Levine A. et al., 1991; Lengauer et al., 1998).
Слово «апоптоз» по-гречески означает «опадание листьев с деревьев». Этот термин используют для обозначения гибели клеток, которая является результатом активных запрограммированных внутриклеточных процессов и сопровождается сморщиванием клеток, уменьшением их объема.
Апоптоз — генетически детерминированный процесс, в основе которого лежит фрагментация ДНК клетки под воздействием активированных ферментов — эндонуклеаз. В норме апоптоз — ключевой физиологический механизм клеточного
обновления. Роль катализаторов и ингибиторов апоптоза играют различные клеточные белки.
Характеристика апоптоза представлена в таблице (Ярилин А.А. и соавт., 1996).
Таким образом, апоптоз представляет собой активный процесс вследствие экспрессии ряда специфических генов, которые запускают сигнальный каскад реакций с участием протеинки-наз, протеаз и эндонуклеаз, конечным результатом которых является деструкция клетки с образованием апоптозных телец (Хансон К.П., 1998; Фильченков А.А. и соавт., 1999; Hindermann W. et al., 1997; Hirvikoski P. et al., 1999; Grossman D. et al., 2001).
После открытия феномена апоптоза и получения доказательств его универсальности для всех клеток эукариотических организмов стало очевидным, что апоптоз может иметь прямое или опосредованное отношение к патогенезу злокачественных новообразований (Beakelandt M. et al., 2000; Ehrmann J. et al., 2000; Gonzalez-Campora F. et al., 2000).
Поскольку злокачественная трансформация клеток сопровождается их неконтролируемой пролиферацией и замедлением апоптической гибели, то следовало бы ожидать, что интенсивная гибель опухолевых клеток ассоциируется с лучшим прогнозом заболевания, и наоборот (Vakkala M. et al., 1999; Korkolopoulou P. et al., 2000; Macluskey M. et al., 2000; Schwandner O. et al., 2000).
Полагают, что при рефрактерных формах и рецидивах опухолей, где вероятна большая доля гипоксичных клеток, резистентность к современным протоколам горомонохимиолучевого
Характеристика апопотоза
Причинный фактор
Сигнал, воспринимаемый мембранными рецепторами, или отсутствие физиологического сигнала
Скорость развития Причины гибели клетки
Локализация первичного повреждения Изменение размера клетки
Изменение ядра
Изменения в цитоплазме
Изменение клеточной мембраны Состояние ДНК
Энергозависимость Зависимость от синтеза макромолекул Примеры проявления у животных
Методы определения: морфологический тинкториальный
цитофлюометрический
электрофоретический
1-12 ч
Деградация ДНК, нарушение генов, энергетики клетки Обычно в ядре
Уменьшение (сморщивание)
Конгломераты хроматина, прилежащие к мембране, пикноз, фрагментация
Конденсация цитоплазмы, уплотнение гранул Потеря микроворсинок, образование пузырей Разрывы с образованием сначала крупных, затем мелких фрагментов Существует
Обычно зависит от синтеза РНК и белка
Метаморфоз, отрицательная селекция лимфоцитов, гормональная атрофия, интерфазная радиационная гибель лимфоцитов
Сморщивание клеток Ослабление окрашиваемости ДНК-тропными красителями Уменьшение размера клеток, гиподиплоидность, дифференцированное окрашивание комбинацией красителей Формирование «лесенки» при электрофорезе ДНК
лечения может быть следствием дефектности апоптического метаболического пути в опухолевых клетках (Хансон К.П., 1998; Reed J., 1997; Demoura S. et al., 1999).
Из сформулированных «правил прогрессии» наиболее важным представляется положение, в соответствии с которым «одни опухоли приобретают злокачественные свойства сразу, а другие — через промежуточные стадии», поэтому существенно, на каком из этапов наиболее значимым становятся нарушения процессов апоптоза (Umar A. et al., 1996; Yamasaki H. et al., 1996).
Следует отметить, что четкость и точность, присущие нормальному клеточному циклу и процессу клеточного деления в предстательной железе, достигаются с помощью большого числа регуляторов, повреждение каждого из них может приводить к неконтролируемому апоптозу.
Помимо экстрацеллюлярных сигналов, способных модифицировать этот процесс (ростовые факторы, факторы клеточной пролиферации, индукторы дифференцировки, стероидные гормоны), имеется достаточно сложная внутриклеточная система контроля репликации (Kastan M., 1997). В нормальных условиях благодаря специальной системе контроля клеточного цикла митоз задерживается, если ДНК повреждена, и в то же время эти повреждения еще не репа-рированы. Повреждение упомянутой системы контроля клетки с дефектным геномом способствует дальнейшему накоплению ошибок (Weinberg R., 1996; Flamm W., et al., 1997; Nurse P., 1997).
Большинство исследователей прямо указывают на то, что только сравнительное изучение индекса апоптоза, равно как содержания и метаболизма андрогенов, а также отдельных белков, ассоциированных с апоптозом (p53, Bc1—2), может быть полезным для понимания механизмов возникновения злокачественной опухоли, прогноза, ее течения и оптимизации схем лечения, в том числе и при раке простаты (Абра-менко И.В. и соавт., 2003; Nakanishi H. et al., 1997; Zhang G. et al., 1998; Koomagi R. et al., 2000; Rodel C. et al., 2000).
Полагаем, что идентификация морфологи -ческих и биохимических маркеров апоптоза должна в перспективе способствовать более глубокому пониманию патогенеза, улучшению дифференциальной диагностики и созданию принципиально нового направления в терапии рака простаты.
Апоптоз в нормальной
предстательной железе
Апоптоз изучен у 23 мужчин, которым выполнялась биопсия предстательной железы с целью обнаружения злокачественного новообразования, однако никаких заболеваний в ней выявить не удалось. Средний возраст составил 59,8 ± 3,9 года. Для количественной оценки апоптоза в ультратонких, полутонких и парафиновых срезах подсчитывали общее количество клеток и количество клеток с апоптозно-изме-ненными ядрами, но еще сохранившейся цитоплазмой и количество апоптозных тел после фрагментации ядра и распада клеток. В этих же срезах подсчитывали число митозов. Апоптоз
Рис. 1. Схема морфологических проявлений апоптоза в предстательной железе: а — отделение от окружающих клеток, уплотнение цитоплазмы, образование ее выпячиваний, конденсация и маргинальная агрегация хроматина; б — образование пузырьков, формирующих апоптозные тела; в — конденсация хроматина по периферии ядерной оболочки; г — фрагментация ядра и клетки, образование апоптозных тел; д — фагоцитоз макрофагами и соседними эпителиальными клетками апоптозных тел, окруженных мембранами.
считали на 100 клеток (т. е. в процентах), митоз — на 1000 клеток (т. е. в промилле). Всего в каждом опыте подсчитывали 200—300 клеток.
Морфология апоптических клеток в предстательной железе представлена на рис. 1.
При световой микроскопии в нормальной предстательной железе основная масса клеток имела обычный вид, ядра округлой или неправильной формы, иногда в них были видны ядрышки. Больше в центре и меньше — по периферии располагались множественные апоптоз-ные тела.
Самыми ранними проявлениями апоптоза на морфологическом уровне были резко очерченные уплотнения ядерного хроматина в виде гомогенной массы, прижатые к внутренней поверхности ядерной мембраны, и некоторая конденсация цитоплазмы.
Позднее ядро распадалось на дискретные фрагменты, а цитоплазматические протуберанцы разделялись плазматической мембраной.
Таким образом, клетка превращалась в совокупность окруженных мембраной апоптозных тел, различных по составу, однако повреждения мембран клетки не происходило. Апоптозные тела фагоцитировались макрофагами или сосед-
ними клетками, где утилизировались с помощью лизосом.
Ультраструктурные проявления апоптоза в неизмененной предстательной железе отражали следующие этапы его развития: начальный этап агрегации конденсированного хроматина в виде отдельных скоплений под ядерной мембраной; образование скоплений конденсированного хроматина в виде полулуния, при этом ядерная мембрана сохранялась; фрагментация ядра на отдельные сегменты, содержащие конденсированный хроматин, в то время как окружающая цитоплазма была уплотненной, в ней были видны митохондрии, лизосомы, отдельные мембранные структуры; фрагментация клетки, образование апоптозных тел, окруженных уплотненной цитоплазмой распадающейся клетки.
Одним из типичных признаков апоптоза принято считать деградацию ДНК до нуклеосомных фрагментов, что легко регистрируется по накоплению низкомолекулярных фрагментов ДНК, образующихся под действием эндогенных эндо-нуклеаз, либо наличие однонитевых разрывов как в межнуклеосомных областях, так и в ко-ровых участках ДНК (Banner C. et al., 1995; Razin S. et al., 1995; Wyllie A. et al., 2000; Bimboim H. et al., 2001), что отмечено и в предстательной железе, как процесс обновления эпителиальных клеток (Ferguson D. et al., 1981; McCall C. et al., 1991; Gavrieli Y. et al., 1992; Kerr J. et al., 2003).
Апоптоз при раке предстательной железы
Апоптоз при аденокарциноме предстательной железы изучен в 92 опухолях. Клетки с морфологическими признаками апоптоза были обнаружены во всех исследованиях, однако интенсивность его была различной.
Клетки имели ядра преимущественно с маргинальным расположением конденсированного хроматина, плотной цитоплазмой. В части клеток наблюдались фрагментация ядра и цитоплазмы, образование апоптозных тел, лежащих свободно или в остатках цитоплазмы. Апоптоз отмечался преимущественно в органоидах, расположенных в центральном отделе клетки. Апоптоз, как правило, был выше в зоне вокруг некроза опухоли, где наиболее выражена гипоксия и связанные с ней нарушения метаболизма
0
□ I
□ II
л
I
Рис. 2. Количественная оценка апоптоза (%) и митозов (%) в клетках иизкодифференцированной (I) и высокодифференцированной (II) аденокар-циномы предстательной железы: а — клетки с признаками апоптоза в ядре; б — апоптозные тела; в — общее количество клеток с признаками апоптоза в ядре и апоптозных тел; г — митозы.
клеток (Alison M. et al., 1997; Agol V. et al., 1998; Bowen J. et al., 1998).
При электронно-микроскопическом исследовании обнаружены клетки на разных стадиях апоптоза. В части клеток наблюдалась начальная агрегация конденсированного хроматина под ядерной мембраной в одном или нескольких участках, иногда в виде полулуний, в то же время наблюдались клетки, в которых ядерная мембрана разрушалась, ядро, а затем и вся клетка подвергались фрагментации и образовывались апоптозные тела, лежащие свободно или окруженные остатками плотной цитоплазмы, иногда содержащей митохондрии и другие органеллы.
При трансмиссионной электронной микроскопии обнаружено обилие специализированных межклеточных контактов в виде десмосом, служащих одним из дифференциально-диагностических ультраструктурных признаков плоскоклеточной метаплазии переходного эпителия.
Десмосомы, сформированные в области параллельных контактов, подтверждали метаплас-тическое происхождение многослойного плоскоклеточного эпителия и объясняли его ограниченную адаптивную способность.
Подсчет количества клеток с признаками апоптоза и митозами суммирован на рис. 2.
Как видно на рисунке, в высокодифференцированной аденокарциноме общее количество клеток с признаками апоптоза и апоптозных тел в 4,5 раза выше, чем в низкодифференцирован-ной (р < 0,01). При раздельном подсчете еще сохранившихся клеток, но уже с маргинальной агрегацией конденсированного хроматина и апоптозных тел эта разница в количестве апоптозных тел еще больше. Подсчет митозов позволил установить, что пролиферативная активность клеток в низкодифференцированной опухоли незначительно выше, чем в высокодифференциро-ванной.
Идентификация апоптоза в карциноме предстательной железы методом 1БЕЬ выявила наличие иммунореактивных ядер во всех 46 исследованных случаях. Индекс апоптоза (параметр, который характеризует долю клеток, обладающих морфологическими признаками апоптоза) варьировал в различных опухолях от 0,9 до 12,8%. составляя в среднем 5,7 ± 1,1%.
Величина индекса апоптоза коррелировала с рядом клинических признаков заболевания. Этот показатель был выше у больных с высокодифференцированной аденокарциномой (9,3 ± 1,2%), чем с умеренно- (5,6 ± 0,8%) и низкодифферен-цированной (2,3 ± 0,25%) опухолью. В свою очередь низкий индекс апоптоза коррелировал с выраженностью изменений в объеме опухоли. Так, корреляционный индекс апоптоза <1% при локализованном раке оказался низким — гху = 0,11 ± 0,001 (р < 0,05), в то время как при местнораспространенном — высоким (гху = = 0,89 ± 0,002, р < 0,001), что указывает на плохой прогноз.
Таким образом, в регуляции скорости роста опухолевых клеток принимают участие по крайней мере два противоположных механизма, один из которых связан с пролиферацией опухолевых клеток, другой — с их элиминацией через генетически запрограммированную клеточную смерть (апоптоз).
Поступила 01.10.2007
8
6
4
2
