CC BY
63
РОЛЬ АНТИТЕЛ К ПЕПТИДНЫМ ФРАГМЕНТАМ БЕЛКОВ НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ МЕНИНГОКОККА В ЗАЩИТЕ ОТ МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ
А.П, Аллилуев
Кафедра микробиологии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, 117198 Москва, Россия
О.В. Котельникова, О.Е. Лахтина,
О.В. Чибискова, В.А. Несмеянов, О.М. Вольпина,
Д.О. Короев, М.П. Филатова
Лаборатория иммунохимии, лаборатория синтеза белка Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Ул. Миклухо-Маклая, 10/16, 1.17198 Москва, Россия
И.С. Королева
Лаборатория эпидемиологии менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Ул. Новогиреевская, За, 111123 Москва, Россия
Синтетические пептидные фрагменты консервативных участков белков наружной мембраны менингококка способны вызывать образование специфических антител у мышей. Показана способность антител к изученным пептидам связываться с эпитопами наружной мембраны менингококков различных серогрупп. Специфические антитела к некоторым пептидам обладали протективной активностью в опытах пассивной защиты от менингококковой инфекции. Антитела к этим пептидам выявлялись в крови мышей после заражения их живой культурой менингококка и в крови больных людей с бактериологически подтвержденным диагнозом менингококкового менингита.
Ключевые слова: менингококк, синтетические пептиды, антителообразование, прогек-тивность.
Для оценки уровня антител в сыворотках при характеристике менингококко-вых вакцин (MB) используются два основных серологических метода — иммуно-ферментный анализ (ИФА) и реакция иммунного бактериолиза (РИБ).
Широко распространенный стандартный метод ИФА высоко чувствителен, хорошо воспроизводим и предоставляет информацию о типе антител (IgG и IgM субклассы). Однако результаты ИФА являются только косвенным показателем защитного иммунитета, поскольку некоторые антитела, обладающие способностью обеспечивать защиту организма от инфекции, не обнаруживаются этим методом [11]. Напротив, в других случаях выявляемые антитела не обладают прогективными
свойствами. Сложность трактовки результатов, полученных этим методом, заключается в гетерогенности популяции антител, а также в различной их авидности [12]. Кроме того, по данным некоторых авторов [8] результаты, полученные этим методом, плохо коррелируют с бактерицидными титрами. Комплемент-зависимый бактериолиз (РИБ) обеспечивает необходимые данные о функциональной активности антител. Поскольку наличие бактерицидных антител коррелировало с защитой против инфекции [5], этот метод, в настоящее время, используется как основной для оценки протективности новых вакцин. Однако связь между титрами антител, полученными с помощью этого анализа, и защитой от болезни остается спорной [9]. Кроме того, РИБ менее чувствительна при выявлении антител и более трудоемка, чем антиген-связывающие анализы, и не позволяет характеризовать подклассы антител в испытуемых сыворотках. Бактерицидный анализ используют, в основном, для подтверждения функциональной активности антител, выявляемых в ИФА, по отношению к бактериям.
Целью работы было показать на различных моделях способность синтезированных пептидов к продукции специфических антител и оценить роль этих антител в защите от менингококковой инфекции.
Методика исследования.
При синтезе пептидов использована аминокислотная последовательность белков РогА, ОраВ и №рА менингококка штамма Н44/76 и аминокислотная последовательность белка ОраВ менингококка штамма 22491, соответствующая консервативным участкам поверхностных белков МВ [6; 7; 12].
Выбраные для синтеза участки белков включают теоретически рассчитанные участки, ответственные за стимуляцию у мышей образования антител, т.е. Т-хелперные эпитопы мышей [1]. При теоретическом анализе последовательности белка РогА были выявлены потенциальные участки, ответственные за стимуляцию образования антител у людей, а также МНС-связывающие участки в последовательности пептидов, которые являются определяющими, в их способности индуцировать образование антител [10].
Способность пептидов к антителогенезу оценивали методом ИФА в двух модификациях: при посадке на плашку соответствующего пептида или цельной микробной клетки менингококков различных штаммов [2]. Кроме того, наличие антител определяли в реакции иммунного бактериолиза [РИБ] с менингококком штамма Н44/76 (В: 15:Р1.7,16) [2]. Все использованные для работы пептиды обладали про-тективной активностью при заражении мышей ни только менингококком различимых штаммов серогруппы В, но и серогрупп А и С [4]. Для определения уровня антител мышей линии СВА иммунизировали пептидами однократно подкожно с полным адъювантом Фрейнда [ПАФ] в дозе 100 мкг на мышь. Кровь забирали на 30-й день после иммунизации.
Результаты исследования.
Наличие антител в сыворотках мышей оценивали тремя способами (табл. 2): с помощью ИФА при сорбции на плашку соответствующего пептида или цельной микробной клетки менингококка штамм Н44/76, а также в РИБ. Видно, что методом пептидного ИФА специфические антитела удается выявить не ко всем исследованным препаратам. На пептиды 273-292, 346-363 и 30-51 в данной постановке опыта антитела не обнаруживались. Титр антител к остальным пептидам сильно варьировал от 1:160 до 1:10 240.
Все тестируемые сыворотки, кроме сывороток к пептидам 30-51 и 131-150, обладали бактериолитическим действием в РИБ.
Таблица 1
Наличие специфических антител в сыворотках мышей, иммунизированных пептидами (2-кратная иммунизация)
Белок Иммуноген Титрангител Пассивная зашита, %*
ИФА РИБ
РогА 118-143 1:2 560 1:320 41
273-292 < 1:10 1:40 62
306-332 1: 1280 1:40 62
346-363 < 1:10 1:80 52
ОраВ 30-51 <1:10 <1:10 0
131-150 1:10240 <1:10 0
№рА 40-62 1:2560 - 0
контроль <1:10 <1:10 0
Примечание: * — процент защиты интактных мышей от заражения менингококком серогруппы В (штамм Н44/76) при переносе им сывороток иммунных мышей, иммунизированных пептидами.
Участие антител в защите от менингококковой инфекции оценивали по снижению уровня бактериемии в крови зараженных мышей-реципиентов после введения им сыворотки мышей, иммунизированных различными пептидами, с последующим заражением реципиентов менингококком (штамм Н44/76) (метод пассивной защиты). Контролем служили реципиенты интакгной сыворотки или сыворотки мышей после введения ПАФ (табл. 1). Для иммунизации доноров были выбраны пептиды, с показанной ранее (в опытах прямого заражения мышей живой менингококковой культурой) протективной активностью в опытах прямой защиты мышей живой вирулентной культурой менингококка серогруппы В (штамм Н44/76) [4]. Сыворотка мышей, иммунизированных пептидом 30-51 и 131-150 белка ОраВ, не защищала мышей от заражения. Даже наличие достаточно высокого уровня антител к пептиду 40-62 (титр 1: 2560) также не вызывало защиты мышей, что говорит об отсутствии протективной роли этих антител. Результаты этого опыта согласуются с данными по отсутствию протективной активности у некоторых пептидов при наличии специфических антител к ним в крови иммунизированных мышей и у людей при заболевании менингококковым менингитом [4]. Отсутствие протективной активности антител к этим пептидам в опытах прямого заражения мышей менингококком при наличии специфических антител в сыворотках этих животных и заболевание людей на фоне высоких титров антител к этим пептидам заставляет предположить ведущую роль клеточных механизмов в защите от заболевания при иммунизации данными пептидами.
Еще одним доказательством участия антител к пептидам в защите организма от менингококковой инфекции может служить нарастание их в крови людей и лабораторных животных при заражении менингококком. У мышей, инфицированных менингококком серогруппы В (штамм 44/76), наблюдается нарастание антител к изученным пептидам.
Для сравнения способности синтетических пептидов к формированию антител и нарастанием антител к этим пептидам у мышей после заражения живой вирулентной культурой менингококка (в дальнейшем — «переболевшие» животные)
животных иммунизировали пептидом 306-332 белка Рог А в дозах 12-25-50 и 100 мкг на мышь. Ранее [3] была показана высокая протективная активность этого пептида в опытах на мышах. Для заражения мышей была использована микробная культура менингококка серогруппы В (штамм Н44/76) в дозах 0,25-106- 2,5- 10б-25-10° м.к. Доза 25• 106 м.к. являлась сублетальной. Дальнейшее увеличение заражающей дозы микробов вызывало 100% гибель мышей. Контролем в обоих случаях служила сыворотка мышей, после инъекции ПАФ Кровь у всех животных брали на 30-й день после однократного введения пептида или микробов (рис. 1).
А Б
350 ----------------------------
ООО —---------------------------
250 ----------------------------
200--^Н-------------------------
150-----------------------------
... I
о----Н1--,--Шш---------,--ИИШ__
25 2,5 0,25 к
доза микробов, млн
Рис. 1. Зависимость уровня антител от дозы при иммунизации мышей пептидом (А) и при заражении живой культурой менингококка (Б)
Оптимальная доза пептида составляла 50 мкг, что соответствовало дозе 0,25-106 м.к. микробов, титры антител при использовании этих доз пептида и микробов составляли в обоих случаях 1:640, что свидетельствует об адекватности использованных доз при иммунизации и заражении мышей и позволяет, в дальнейшем, проводить сравнительный анализ этих групп животных.
Было изучено наличие антител к четырем синтезированным пептидам 118-143, 273-292, 306-332 и 346-363 у иммунизированных этими пептидами мышей и зараженных менингококком (табл. 2). Уровень антител определяли при сорбции на плашку соответствующего пептида.
Таблица 2
Нарастание антител к синтетическим пептидам у мышей, иммунизированных пептидами и заражённых менингококком
Тестируемые антитела Иммунизация пептидом Заражение Р^тепіі^ШсНв
118-143 1:2560 1:640
273-292 <1:10 1:2560
306-332. 1:1280 1:320
346-363 <1:10 1:640
На 30-й день после иммунизации/заражения антитела в сыворотках мышей, иммунизированных пептидами 273-292 и 346-363, определяемые методом ИФА при сорбции на плашку пептида, не были обнаружены. Не выявлялись они и при иссле-
довании сывороток иммунизированных мышей в динамике не на один из взятых сроков с 7-го до 120-го дня ни после одно-, ни после двукратной иммунизации. На 30-й день после заражения мышей микробами антитела выявлялись ко всем четырем пептидам, а для пептидов 118-143 и 306-332 их уровень существенно не отличался от титра антител при иммунизации этими пептидами. Отсутствие антител к некоторым пептидам заставило искать другие методы их выявления. Одним из таких методов бьш выбран вариант ИФА при сорбции на плашку цельной микробной клетки.
Антитела к пептидам 273-292 и 346-363 были обнаружены при изучении тех же сывороток в ИФА при сорбции на плашку микробных клеток («цельно-клеточный» ИФА) как с гомологичным, так и с гетерологичными штаммами менингококка (табл. 3).
Таблица 3
Наличие антител к поверхностным структурам менингококка в сыворотках мышей, иммунизированных пептидами
Титр антител к штамму Титр антител при иммунизации пептидами
118-143 273-292 306-332 346-363 30-51 131-152 40-62
Н44/76 1: 80 1:160 1:640 1:320 - 1:80 1:160
15 1:1280 1:320 1:640 1:640 - - -
2394 1:640 1:160 1:160 1:160 <1:10 1:320 1:320
125 1:40 1:160 1:80 1:40 1:40 1:160 -
Причины этого явления пока не ясны. Можно предположить, что конфигурация этих пептидов в составе белка на поверхности микробной клетке отличается от таковой свободного пептида, что позволяет им соединяться с соответствующими антителами, образуя комплекс антиген-антитело. При постановке цельноклеточной ИФА анализ антител к синтезированным пептидам показал, что специфические антитела, циркулирующие у мышей после иммунизации соответствующим пептидом, способны связываться с поверхностной мембраной менингококков серогруппы В различной серотиповой принадлежностью, что подтверждает принадлежность выбранных пептидов к консервативным участкам белка.
Результаты этого раздела работы показали для некоторых препаратов отсутствие корреляции между наличием антител, выявляемых в ИФА при сорбции пептида на плашку, и их протективными свойствами.
В работе было проанализировано 43 сыворотки людей с диагнозом менинго-кокковый менингит различной этиологии, в различные сроки от 1 до 20-го дня от момента госпитализации на наличие антител к пептидным фрагментам белков РогА (118-143, 273-292, 306-332, 346-363), ОраВ (30-51, 131-150) и №рА (40-62). Анализ сывороток больных показал различный уровень антител к синтезированным пептидам при поступлении в больницу, т.е. в начале заболевания. В некоторых случаях заболевание происходило на фоне высоких титров антител к отдельным пептидам. Отсутствие каких-либо антител в момент заболевания и нарастание их в процессе болезни может являться косвенным доказательством участия их в защите от данной инфекции. В табл. 4 приведены данные о нарастании специфических антител в сыворотках людей в процессе болезни. Не во всех случаях происходит нарастание антител к пептидам даже при их низком исходном уровне, что, возможно, объясняется нарушением иммунного статуса данного человека.
Таблица 4
Нарастание специфических антител к синтезированным пептидам в сыворотках людей при заболевании менингококковым менингитом
Больные менингококком % больных людей с нарастанием антител к пептидам
118- 143 273- 292 306- 332 346- 363 30-51 131 -150 40-62
Группа В 56* 25 11 22 33 25 50
Группа А 20 60 40 60 40 40 50
Г руппа С 0 40 50 17 50 33 33
Примечание: * — % лиц с нарастанием титра антител в процессе болезни в 4 раза и более
Таким образом, в результате проведенных исследований показано нарастание специфических антител к некоторым синтетическим пептидам при заболевании менингококковым менингитом как у мышей, так и у человека.
ЛИТЕРАТУРА
1. Волъпина О.М., М. А. Титова, М.Н. Жмак и др. Предсказание структуры пеп-титов, способных индуцировать образование антител у мышей // Биоорган, химия. — 2002. — Т. 28. — №5. — С. 387-395.
2. Дельвиг А.А., Семёнов Б.Ф., Розенквист Э., Робинсон Д.Г. Neisseria meningitidis: от антигенной структуры к новому поколению вакцин. — М.: Медицина, 2000.
3. Короев Д.О., О.В. Котельникова, О.М. Волъпина и др. Индукция противоме-нингитного иммунитета с помощью синтетических пептидов. I. Иммуноактивные синтетические фрагменты РогА из Neisseria Meningitidis // Биоорган. Химия. — 2000. —№5. —С. 323-329.
4 .Котельникова О.В.*, О.В. Чибискова, Феоктистов К.М и др. Конструирование противоменингококковых вакцин на основе синтетических пептидов белков поверхностной мембраны менингококка серогруппы В // Эпид. и вакцинопрофи-лактика. — 2005. — Т. 6. — № 25. — С. 28-32.
5. Frash С.Е. Vaccines for prevention of meningococcal deseases // Clin. Microbiol. Rev. — 1989. — Vol. 2. — Suppl. — P.134-138.
6.Malorny B„ Morelli G.,Kusecek В et al. Sequence Diversity, Predicted Two-Dimentional Protein Structure, and Epitope Mapping of Neisserial Opa Proteins // J. of Bacteriol. —1998. — Mar. — P. 1323-1330.
7. Мое G.R., Tan S., Granoff D.M. Differences in surface expression of NspA among Neisseria meningitides group В strains // Infect, and Immun. — 1999. — P. 5664-5675.
8. Rouppe Van der Voort E., Van Dijken H„ Kuipers B. et at. Human B- and T-cell responses after three doses of hexavalent PorA meningococcal outer membrane vesicle vaccine. Abstracts of the 10th Pathogenetic Neisseria Conference / Eds Zollinger W.D., Frasch C.E., Deal C.D. — Baltimore, Maryland, USA, 1996. — P. 185-186.
9. Poolman J.T., Van der Ley P., Wiertz E.J.H.J., Hoogerhout P. Second generation meningococcal OMP-LPS vaccines // NIPH Ann. — 1991. — Vol. 14. — P. 233-241.
10. Rammensee H.-G., Friede T., Stevanovivc S. MHC ligands and peptide motifs: first listing // Immunogenetics. — 1995. — Vol. 41. — P. 178-228.
11. Shapiro E.D., Capobianco L.A., Berg A.T., Zitt M.Q. The immunogenicity of Hemophilus influenzae type b polysaccharide-Neisseria meningitidis group B outer membrane complex vaccine in infants and young children // J. infect. Dis. — 1989. — Vol. 160. —P. 1064-1067.
12. Tai J.Y., Michon F., Fusco P.C., Blake M.S. Preclinical evaluation of a combination vaccine against groups A, B and C meningoccocci in both mice and nonhuman primates. Abstracts of the 10th Pathogenic Neisseria Conference / Eds. Zollinger W.D., Frasch C.E., Deal C.D. — Baltimore, USA, 1996. — P. 214-215.
13. Van der Ley P. A., Heckels J. E., Virji M. et al. Topology of outer membrane porins in pathogenic Neisseria spp. // Infect. Immun. — 1991. — Vol. 55. — P. 2963-2971.
ANTIBODY RESPONSES TO PEPTIDE FRAGMENTS OF PROTEINS OF MENINGOCOCCUS EXTERNAL MEMBRANE FOR PROTECTIVE ACTIVITY AGAINST MENINGOCOCCUS INFECTION
A.P. Alliluev
The Department of Microbiology Peoples’ Friendship University of Russia Miklukho-Maklaya st., 8, 117198 Moscow, Russia
O.V. Kotelnikova, O.E. Lahtina, O.V. Chibiskova, V.A.Nesmeyanov, M.P. Filatova, O.M. Volpina, D.O. Koroev
Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS Miklukho-Maklaya St., 16/10, 117871 Moscow, Russia
I.S. Koroleva
Lab. Epidemiology of Meningococcus infection and Bacteriology Meningitis
CRDIE
Novogireevskaya St., 3a, 111123 Moscow, Russia
Synthetic peptide fragments of conservative sites of proteins of meningococcus external membrane are capable to cause production of specific antibodies in mice. It was shown that these antibodies can contact epitopes of external membrane of different meningococcus serological groups. In experiences of passive protection against meningococcus infection specific antibodies to some peptides possessed protective activity. After infection of mice with alive meningococcus culture the antibodies to these peptides were detected. The same antibodies were detected in blood of patiens with a bacteriologically confirmed diagnosis of meningococcal meningitis.
