CC BY
26
Эпидемиология и Вакиинопрофилактика 26 (25)/2005
І ІЬРГІ ІІ-КІИВА
Конструирование противоменингококковых вакиин на основе синтетических пептидов белков поверхностной мембраны менингококка серогруппы В
■ О.В. Котельникова1, О.В. Чибискова1, К.М. Феоктистов1,
И.С. Королева3, В.А. Несмеянов1, А.П. Аллилуев2,
Д.О. Короев1, О.М. Вольпина1, В.Т. Иванов1
1 Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
2 Медииинский факультет РУДН
3 ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора», Москва
| I опытки разработать эффективную вакцину для профилактики менингококковой инфекции, вызываемой менингококком серогруппы В, предпринимаются исследователями многих стран уже более тридцати лет. В отличие от групповых полисахаридов менингококков А и С, которые оказались высокоэффективными вакцинами для профилактики инфекции указанных серогрупп, очищенный В-полисаха-рид был слабо иммуногенен для людей [2]. Кроме того, попытки получения его в иммуногенной форме вызвали опасение ряда ученых спровоцировать аутоиммунный процесс из-за сродства этого полисахарида со структурой углеводных цепей гликопротеидов клеток центральной и периферической нервных систем [7]. Это обстоятельство послужило причиной интенсивного изучения других антигенных компонентов клеточной стенки менингококков группы В. Таких компонентов сейчас насчитывается более сорока [2]. Среди них особый интерес представляют белки наружной мембраны 1-го и 2/3-го классов, или порины, определяющие серосубтип и серотип этого возбудителя, а также опалесцирующие белки и ряд других с подтвержденной протективностью [13].
В человеческой популяции циркулируют десятки вирулентных штаммов менингококков серогруппы В, различающихся набором серотиповых и серосубти-повых маркеров, что диктует необходимость включения в вакцину целых наборов этих маркеров для обеспечения ее поливалентности [6, 10]. Однако отмечено, что в целом ряде случаев вместо интеграции
иммунного ответа имеет место его угнетение [9]. Оказалось, что для создания поливалентной В-вакци-ны целесообразно использовать не наборы белков наружной мембраны, а их фрагменты, полученные методом синтеза [8, 11, 12]. Причем синтезировать целесообразно именно консервативные участки этих белков, общие для всего вида нессерий, и на их основе конструировать поливакцину [16, 17].
Целью настоящей работы стала оценка протек-тивных свойств синтетических пептидных фрагментов белков наружной мембраны менингококков и их конъюгатов с капсульным полисахаридом менингококка серогруппы А.
Материалы и методы
Антигены. Пептидные фрагменты консервативных участков белков РогА, ОраВ и №рА наружной мембраны менингококков серогруппы В были получены твердофазным методом путем наращивания цепи с С-конца в ручном варианте на п-алкоксибен-зильном полимере [14].
Выбор фрагментов белков (табл. 1) был осуществлен таким образом, чтобы синтезированные пептиды относились к наиболее консервативным участкам этих белков и содержали в своей последовательности теоретически рассчитанные мотивы для связывания с антигенами главного комплекса гистосовместимости II класса, то есть включали бы потенциальные эпитопы для Т-хелперов, а также потенциальные В-эпитопы белка [3 - 5].
і іергі іекіива
Таблица 1.
Аминокислотная послєловатєльность синтетических пептилов
Белок Аминокислотная последовательность Пептид*
РогА АБОАЮРШОБММОУАБОЕСІЕКШОО 118 - 143
АОЕОЕБЕМСОКТКМБТТЕІА 273 - 292
^УАНСЕОЕ^СККСЕЫТБУООИАС 306 - 332
БСАШЕКІ^ТСІСМУТОІМ 346 - 363
ОраВ АТСАЫМТБТУБОУЕкМРт-Ы 30 - 51
ОКЕОКЕКРУІСУРІУАУСНУКНОУ 131 - 150
№рА ЕкЕАУОУТкУКЫУКАРБТОЕКЕУ 4 О - 6 Ю
* Номера аминокислот, соответствующие их положению в составе белка.
Для конъюгации пептидов использовали очищенный полисахарид менингококка серогруппы А (ПсА), полученный на предприятии МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.
Конъюгация пептидов с полисахаридом. Сухой, окисленный перйодатом ПсА растворяли в свежеприготовленном карбонатном буфере рН 9,0 до концентрации 2 мг/мл, добавляли пептид, предварительно растворенный в том же буфере (концентрация раствора 2 мг/мл). Раствор перемешали и оставили при комнатной температуре на 5 дней в темноте. Конъюгат отделяли от низкомолекулярных продуктов реакции ультрафильтрацией на мембране ХМ-50. Концентрат лиофиль-но высушивали с использованием системы БрееСУас. Качественный и количественный состав конъюгата определялся при помощи аминокислотного анализа.
Иммунизация животных. Мышей линии СВА/1_а/Б1о иммунизировали свободными пептидами подкожно в дозе 100 мкг с полным адъювантом Фрейнда. Конъюгированные пептиды вводили мышам без адъюванта однократно внутривенно в дозах от 3-х до 100 мкг на мышь в пересчете на пептидный компонент. Нативный А-полисахарид вводили мышам внутривенно в оптимальной дозе - 5 мкг.
Бактериальные культуры. Лиофилизированные культуры N. тєпіпдіїісСіз серогруппы А (штамм А208), серогруппы В - штаммы Н44/76(В:15:Р1.7, 16), В15(В:15:Р1.7), 2394(В:2а:Р1.2) - и серогруппы С (штамм 0638), полученные из ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
Оценка протективности. Заражение мышей живой вирулентной культурой проводили через 1 месяц после иммунизации, как описано ранее [1]. Показателем защищенности от менингококка служил уровень бактериемии у мышей, определяемый путем подсчета колониеобразующих клеток (КОЕ) в их крови через 4 часа после заражения [3].
Оценка иммуногенности. Наличие специфических антител у мышей к полисахаридному компоненту конъюгатов оценивали на 4-й день, а к пептиду -на 30-й день после иммунизации животных. Уровень антител в сыворотках мышей, а также в крови людей,
болеющих менингококковым менингитом различной этиологии, оценивали методом твердофазного ИФА при сорбции на плашку цельной микробной клетки [2] или очищенного полисахарида [3], а также в реакции иммунного бактериолиза (РИБ) [15].
Механизмы формирования иммунитета при иммунизации пептидами изучали с помощью метода адаптивного переноса иммунных лимфоцитов [1] и пассивной защиты мышей иммунными сыворотками. Сыворотки реципиентам вводили внутривенно в объеме 0,2 мл от мышей-доноров через 1 месяц после их иммунизации пептидами.
Результаты исследования
При иммунизации мышей некоторыми пептидами формируются антитела, способные сорбироваться на поверхности микроба (цельноклеточный вариант ИФА) и обладающие бактерицидными свойствами (РИБ) (табл. 2). Однако антитела к двум из шести изученных пептидов (фрагменты белков ОраВ 30 - 51 и №рА 40 -62), несмотря на высокие титры антител в ИФА, не обладали бактерицидными свойствами и не защищали мышей-реципиентов от заражения менингококком серогруппы В (штамм Н44/76). Антитела к пептидным фрагментам белка РогА были обнаружены в сыворотках мышей, иммунизированных этими пептидами, и обладали как протективной, так и бактерицидной активностью.
Между тем в опытах прямого заражения мышей вирулентными штаммами менингококков (табл. 3) иммунизация пептидами 30 - 51 и 40 - 62 вызывает выраженный протективный эффект, что позволяет предположить наличие клеточного компонента защиты животных от этой инфекции.
Другим доказательством участия антител к пептидам в защите организма от менингококковой инфекции различных серогрупп может служить нарастание антител к этим пептидам в крови людей при заболевании менингококковым менингитом различной этиологии (рис. 1).
В работе было проанализировано 10 сывороток крови от больных менингококковым менингитом различной этиологии: 6 человек с бактериологически подтвержденным диагнозом - менингит серогруппы В, 3 человека - менингит серогруппы А и 1 человек - менингит серогруппы С.
Сыворотки крови получали от больных, доставленных в Инфекционную клиническую больницу е2,
[Эпидемиология и Вакцинопрофилактика <6 (25)/2005
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика 26 (25)/2005
I 1ЕРГ1 1ЕК1ИВА
Таблица 2.
Протективные свойства сывороток крови мышей после иммунизации пептилами или вызлоровления от менингококковой инфекции
Иммуноген Титр антител Уровень бактериемии*
белок пептид ИФА РИБ
РогА 118 - 143 1:2560 1:320 59
178 - 192 1:10240 1:640 72
273 - 292 1:40 1:40 68
306 - 332 1:2560 1:40 38
346 - 363 1:80 1:80 48
ОраВ 30 - 51 1:640 < 1:10 100
№рА 40 - 62 1:2560 < 1:10 100
Микроб Н44/76 1:320 1:160 32
Контроль < 1:10 < 1:10 100
* Число КОЕ в крови мышеи после переноса им иммуннои сыворотки с послелуюшим заражением вирулентным штаммом менингококка.
Таблица 3.
Протективные свойства пептилов в отношении менингококка серогрупп А, В и С
Белок Пептид Число КОЕ в крови мышей после заражения менингококками серогрупп
В А С
РогА 118 - 143 40 ± 3 5 ± 4 60 ± 7
273 - 292 65 ± 9 51 ± 3 -
306 - 322 32 ± 4 22 ± 6 26 ± 4
346 - 363 62 ± 6 7 ± 5 63 ± 12
ОраВ 30 - 51 53 ± 6 18 ± 8 87 ± 9
131 - 150 65 ± 7 9 ± 5 -
№рА 40 - 62 46 ± 7 9 ± 5 55 ± 5
Адъювант 100 ± 7 100 ± 6 100 ± 9
в день госпитализации и в различные сроки от 7-го до 20-го дня болезни. Анализ сывороток крови больных показал, что нарастание у больных антител в процессе заболевания к вариабельному участку белка РогА (178 - 192), несущему маркер штамма Н44/47, выявлено только у трех из шести человек с диагнозом «менингит серогруппы В», а к консервативному (306 - 332) - у семи, включая больных менингитом серогрупп А и С.
Обязательным условием для разрабатываемой вакцины должна быть ее способность обеспечивать защиту животных от заражения штаммами менингококка серогруппы В, различающимися серотиповыми и серосубтиповыми маркерами, и менингококков других серогрупп. В связи с этим была оценена про-тективная активность синтезированных пептидов при заражении мышей менингококком серогруппы В - штамм Н44/76(В:15:Р1.7, 16), а также серогрупп А (штамм А208) и С (штамм 0638). Все синтезированные пептиды вызывали у иммунизированных мышей защиту от заражения указанными вирулентными штаммами менингококков (см. табл. 3). Однако напряженность иммунитета, индуцируемого исследованными пептидами в отношении изученных штаммов менингококка, различается. Так, пептиды 306 - 322 и 273 - 292 РогА вызывали одинаковую защиту при заражении всеми штаммами. Остальные пептиды всех трех белков оказались более эффективными при заражении мышей менингококком серогруппы А.
Способными защищать мышей от заражения менингококком серогруппы С оказались четыре пептида из пяти. Максимальной протективностью обладал пептид 306 - 322: у мышей, иммунизированных этим препаратом, число КОЕ снизилось до 26 ± 4. Проте-ктивность пептидов 118 - 143, 346 - 363 и 40 - 62 оказалась существенно ниже: число КОЕ снизилось до 60 ± 7, 63 ± 12 и 55 ± 5 соответственно.
Таким образом, продемонстрировано, что высокая консервативность выбранных пептидных фрагментов обеспечивает защиту иммунизированных мышей от заражения менингококками не только различных серотипов и серосубтипов, но и серогрупп.
Перспектива поисков создания менингококковой поливакцины повлекла за собой новый вариант ее конструкции. Была предпринята попытка конъюгации пептидных фрагментов с капсульным полисахаридом менингококка серогруппы А и изучения иммунологической и протективной активности полученных соединений.
Мышей иммунизировали различными дозами конъюгатов в интервале от 100 до 3 мкг пептида на мышь, а затем заражали гомологичным (В Н44/76) или гетерологичным (А208) штаммом менингококков. Контрольную группу мышей иммунизировали очищенным нативным А-полисахаридом в оптимальной дозе 5 мкг (табл. 4). Все конъюгаты обладали выраженной протективной активностью в отношении микробов обеих серогрупп. После заражения мышей менингококком серогруппы В прослеживается чет-
I 1ЬРГ1 11-К1ИВХ
Рисунок 1.
Наличие антител к вариабельному и константному участкам белка РогА у больных менингококком различных серогрупп
Таблица 4.
Зависимость протективной активности конъюгатов от лозы вволимого препарата
Антиген Доза*, мкг Заражение менингококком серогруппы
В А
число мышей число КОЕ Р число мышей среднее число КОЕ Р
Контроль - 15 100 ± 16,1 8 100 ± 26,7
346 + ПсА 100 5 к ± <Э 5 > 0,05 - - -
50 8 >ч0 1-0" ± <э 4 < 0,05 9 74,7 ± 20,3 > 0,05
25 5 24,3 ± 7,0 < 0,05 - -
12 10 7,5 ± 4,8 < 0,05 10 20,7 ± 4,7 < 0,05
118 + ПсА - 8 100 ± 4,2 8 100 ± 33,7
50 8 79,8 ± 54,8 > 0,05 - - -
25 8 63,1 ± 11,9 < 0,05 9 21,8 ± 9,9 > 0,05
12 8 41,7 ± 11,3 < 0,05 - - -
6 8 28,6 ± 11,9 < 0,05 - - -
131 + ПсА - 10 100 ± 36,6 - 5 100 ± 37,6
25 10 81,3 ± 28,4 > 0,05 5 4,0 ± 3,2 < 0,05
12 10 28,4 ± 7,3 > 0,05 5 4,0 ± 2,4 < 0,05
3 14 15,0 ± 4,4 < 0,05 5 3,2 < 0,05
ПсА 5 7 98 ± 5,2 > 0,05 7 2,3 ± 2,2 < 0,05
* Лоза кажлого из компонентов.
[Эпидемиология и Вакиинопрофилактика <6 (25)/2005
Эпидемиология и Вакиинопрофилактика 26 (25)/2005
I IhPCI 1ШИВА
кая зависимость эффекта зашиты от дозы вводимого конъюгата, причем для всех конъюгатов оптимальной оказалась наименьшая из использованных доз (соответственно 12, 6 и 3 мкг). Более высокая протектив-ность конъюгатов в отношении менингококка серо-группы А, выявляемая в некоторых случаях, может объясняться сочетанным действием пептидного и полисахаридного компонентов этого препарата, тогда как зашита от менингококка серогруппы В обусловлена только пептидным компонентом.
Очишенный ПсА не зашишал мышей от заражения менингококком серогруппы В, но прекрасно зашишал их от заражения менингококком серогруппы А (см. табл. 4).
Результаты исследования показали значительное снижение оптимальной дозы вводимого пептида (соответственно 3, 6 и 12 мкг для изученных конъюгатов) по сравнению с дозой свободных пептидов, вводимых с адъювантом (50 мкг) [1]. Кроме того, конъ-югаиия пептидов с капсульным полисахаридом менингококка серогруппы А дала возможность избежать применения адъюванта при иммунизаиии животных пептидами и увеличить их протективную активность.
Таким образом, представленные материалы свидетельствуют о высокой степени консервативности конъюгированных пептидов и их протективной активности в отношении менингококков различных се-рогрупп, что делает перспективным использование таких препаратов в качестве поливалентной вакии-ны против менингококковой инфекиии.
Работа выполнялась в рамках МНТП «Вакиины нового поколения и диагностические системы буду-шего», госконтракт °43.269.11.0103.
Выводы
1. Синтезированы пептидные фрагменты консервативных участков трех поверхностных белков (РогА, ОраВ и №рА) менингококка серогруппы В, обладаюшие протективными свойствами в отношении менингококков трех серогрупп - А, В и С.
2. Синтезированные пептиды в результате конъюга-иии с капсульным полисахаридом менингококка се-
рогруппы А способны защищать мышей от заражения живой вирулентной культурой менингококков серогрупп А и В без применения адъюванта.
3. Созданы предпосылки для конструирования поливалентной менингококковой АВС-тривакиины, эффективный В-компонент которой до настоящего времени отсутствует в перечне исследуемых в мире вакиин.
Литература
1. Агафонова С.А., Аллилуев А.П., Котельникова О.В. // Иммунология. 1997, <1, С. 39 - 41.
2. Дельвиг А.А., Семенов Б.Ф., Розенквист Э., Робинсон Д.Г. Neisseria meningitidis: от антигенной структуры к новому поколению вакиин. - М: Медииина, 2000.
3. Короев Д.О., Котельникова О.В., Вольпина О.М. и др. // Биоорган. химия. 2000. Т. 26. С. 323 - 329.
4. Короев Д.О., Вольпина О.М., Жмак М.Н. и др. // Биоорган. химия. 2001. Т. 27. С. 21 - 26.
5. Короев Д.О., Обозная М.Б., Жмак М.Н. и др. // Биоорган. химия. 2002. Т. 28. С. 291 - 297.
6. Cadieus N., Plante V., Rioux C. et al. // Infect. Immunol. 1999. V. 67. P. 4955 - 4959.
7. Finne S., Bitter-Suerman, Goridis C., Finne U. // J. Immunol. 1987. V. 138. P. 4402 - 4407.
8. Malorny B., Morelli, Kusecek B. et al. // J. Bacteriol. 1998, V. 180. P. 1323 - 1330.
9. Martin D., Cadieux N., Hamel J., Brodeur B. Highly conserved Neisseria meningitidis surface protein confers protection against experimental infection. // J. Exp. Med. 1997. V. 185. P. 1173 - 1183.
10. Martin D., Brodeur B. R., Hamel J. et al. // J. Biotechnol. 2000. V. 83. P. 27 - 31.
11. Moe G.R. Tan S., Granoff D.M. // Infect. Immunol. 1999. V. 67. P. 5664 - 5675.
12. Poolman J.T. // Development of a meningococcal vaccine. Infect. Agents Dis. 1995. V. 4. P. 13 - 28.
13. Saukkonen K., Abdillahi H., Poolman J.T., Leinonen M. Protective efficacy of monoclonal antibodies to class 1 and 3 outer membrane proteins of N. meningitidis B:15:P1, 16 in infant rat infection model: new prospects for vaccine development // Microb. Pathol. 1987. V. 3. P. 261 - 267.
14. Udenfriend S., Meienhofer J. The Peptides. Analysis, synthesis, biology. // London: Academic Press Inc. 1987. V. 9. P. 27 - 30.
15. McGuinness B., Barlow A.K., Clarke I.N. // J. Exp. Med. 1990. V. 171. P. 1871 - 1882.
16. Дельвиг А.А., Семенов Б.Ф. // ЖМЭИ. 1997. С. 92 - 96.
17. Wiertz E.J.H.J., van Gaans-van den Brink J.A.M., Schreuder G.M.T.H. // J. Immunol. 1991. V. 147. P. 2012 - 2018.
