CC BY
18
Реферат
ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ СОСУДИСТОЙ СТЕНКИ В УСЛОВИЯХ РАЗВИТИЯ АЛЛОКСАНОВОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА У КРОЛИКОВ Атаман Ю.А.
Ключевые слова: артерии, вены, аллоксан, сахарный диабет, окисление.
В опытах на кроликах показано, что однократное внутривенное введение животным аллоксана (100 мг/кг) вызывает уменьшение потребления кислорода изолированными полосками грудной и брюшной аорты, легочной артерии, задней полой вены. Угнетение тканевого дыхания в стенке венозных сосудов наблюдали на 3, 7 и 14 сутки, а в изученных артериях - на 7 и 14 сутки после введения препарата.
Summary
OXIDATIVE ACTIVITY OF THE VASCULAR WALL UNDER THE DEVELOPMENT OF ALLOXAN DIABETES IN RABBITS
Ataman Yu.O.
Key words: arteries, veins, alloxan, diabetes, oxidation, rabbits.
The experiments on rabbits has shown the single intravenous injection of alloxan in a dose of 100 mg/kg leads to the reduction of oxygen consumption by the isolated thoracic and abdominal aorta, pulmonary artery and vena cava posterior strips. Inhibition of tissue respiration is observed in the venous wall for 3, 7 and 14 days, and in the studied arteries for 7 and 14 days after drug injection.
УДК 611.018.21:616.5-001.17-003.93
РОЛЬ АЛЛ0ФИБР0БЛАСТ0В В ПРОЦЕССАХ РЕГЕНЕРАЦИИ РАН
Абрафикова Л.Г., Петренко Т.Ф., Кощий C.B., Гончарук Е.И. Институт проблем криобиологии и криомедицины HAH Украины
В работе представлены данные по изучению влияния аллофибробластов на процессы регенерации экспериментальных ран у животных. Исследована возможность применения различных носителей для фибробластов. Изучена динамика изменений острофазовых белков в сыворотке крови экспериментальных животных.
Ключевые слова: аллофибробласты, клеточная терапия, скорость заживления ран, острофазовые белки.
Кожа млекопитающих содержит много регио- ки, изготовленные из биологических полимеров нальных стволовых клеток, что и обуславливает (коллаген, хитозан и др.), специальный полу-ее высокую регенеративную возможность. Не- жидкий гель [8]. В ИПКиК HAH Украины был раз-большие травматические повреждения кожи, как работай носитель для клеток на основе метил-
правило, быстро заживают. Тяжелые травмы кожи требуют специального лечения [6]. В целом ряде случаев классические методы лечения ран не дают желаемого результата. Альтернативой традиционным методам лечения являются методы клеточной терапии.
Применение кератиноцитов, диплоидных клеток, фибробластов, клеток печени, легкого для лечения ран дает хорошие результаты. Такие трансплантанты хорошо приживлялись и стимулировали эпителизацию ран [4]. Перспективным направлением в лечении долго незаживающих ран является применение алло- или аутофиб-робластов. При нанесении суспензии клеток на раневую поверхность возникает проблема их иммобилизации во избежание потери клеточного материала.
Целью данной работы являлся выбор носителя для аллофибробластов, обеспечивающий фиксацию клеток на раневой поверхности, и выяснение роли фибробластов в процессах регенерации ран.
Для удобства нанесения клеток на раны используют различные носители: пористые плен-
целлюлозы [5].
По данным литературы гель на основе метил-целлюлозы нетоксичен, физиологически инертен, обладает биологической устойчивостью, большой сорбционной, эмульгирующей, смачивающей и адгезивной способностью [2]. Метил-целлюлоза используется в бессывороточных средах для суспензионного культивирования клеточных культур [10] как иммобилизирующее клетки вещество при выращивании смешанных колоний гемопоэтических клеток [9].
В качестве покрытия при хирургических вмешательствах широко используется «Геласпон» (Германия), представляющий собой пористую пленку из биологического полимера.
В представленной работе была изучена возможность применения губки «Геласпон» и ме-тилцеллюлозы в качестве носителей для аллофибробластов и исследовано влияние аллофибробластов на процессы регенерации в экспериментальных ранах у лабораторных крыс линии «Вистар».
Материалы и методы
Биоптаты кожи крыс брали с внутренней стороны задней лапы, предварительно удаляли шерсть, место забора обрабатывали спиртом (70%). Биоптат помещали в стерильный раствор Хенкса с антибиотиками (100 ЕД/мл пенициллина,100 мг/мл стрептомицина). Затем биоптат кожи измельчали на фрагменты размером 1 - 2 мм2. Полученные кусочки помещали в чашки Петри дермальной частью вниз, добавляли культу-ральную среду, содержащую 90% питательной среды ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Чашки Петри с эксплан-тантами инкубировали в условиях насыщающей влажности при 370 С в воздушной среде с 5 % С02 . При образовании монослоя в чашках, клетки снимали при помощи смеси версена с трипсином (4:1) и переносили в культуральные флаконы. Культуру клеток пассировали по мере формирования монослоя. Посевная концентрация фибробластов составляла 2 - 5*104 кп/см2 поверхности культурального флакона.
Изучение влияния губки «Геласпон» и метил-целлюлозы (МЦ) на функциональную активность аллофибробластов. Клетки инкубированные в ростовой среде с добавлением метил-целлюлозы в конечной концентрации 1,5 %. Время инкубации составляло 24 часа. По истечению данного времени клетки отмывали от среды с МЦ путем добавления ратвора Хенкса с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 1000 об/мин. Супернатант удаляли и добавляли стандартную ростовую среду. Высевали в культуральные флаконы и инкубировали. Кусочки губки «Геласпон» раскладывали в чашки Петри диаметром 3,5 см. Суспензию клеток фибробластов в ростовой среде наносили на губку с последующей инкубацией в стандартных условиях. За ростом клеток наблюдали визуально в инвертированном микроскопе.
Экспериментальный раздел работы с животными выполнен на базе вивария ИПК и К НАН Украины. Эксперименты с животными проводили согласно „Загальних принцитв експериметчв на тваринах", одобренных I Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, 20.09.04 г.), а также в соответствии с положениями «Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985 г.).
Асептическое воспаление кожи и подкожной клетчатки моделировали на крысах линии Wistar путём подкожного введения 0,5 мл 9% раствора уксусной кислоты в область спины. Все оперативные вмешательства на животных, включая декапитацию, проводили под ингаляционным эфирным наркозом.
Аппликацию суспензии клеток в МЦ осуществляли при помощи пипетки Пастера, прдвари-тельно смешивая суспензию клеток с 3 % МЦ. Губку «Геласпон» перед аппликацией пропитывали суспензией клеток в течение 40 - 60 мин.
Размеры накладываемой губки соответствовали размерам ран. Количество клеток, вносимых на 1 см2 составляло 1*105 клеток. Суспензию клеток готовили на растворе Хенкса.
Динамику изменения площади раневой поверхности определяли методом планиметрии Поповой Л.Н. [7]. Планиметрию раны осуществляли до начала лечения, а затем на 7-й, 14-й и 21-й дни эксперимента. Площадь ран рассчитывали при помощи компьютерной программы Axio Vision Rel 4.7. Скорость заживления раны (СЗР) или индекс Поповой, выраженный в процентах, рассчитывали по формуле:
C3P=(S-Sn)x100/Sxt,
где S — величина площади раны при предшествующем измерении, Sn — величина площади раны в настоящий момент, t — число дней между первым и последующим измерением [7].
Биохимические методы. Исследования острофазовых белков воспаления в сыворотке крови экспериментальных животных проводили на базе клинической лаборатории ХГДБ № 16. Определяли содержание церулоплазмина и глико-протеидов. В исследованиях использовали унифицированые методы лабораторной диагностики [3], приборы и стандартные наборы реактивов фирмы «Филист-Диагностика», контрольные сыворотки фирмы «Филист-Диагностика», Днепропетровск.
Результаты
Клетки фибробластов, посеяные в культу-ральную среду с добавлением 1,5% МЦ, находились в суспензионном состоянии. Единичные клетки оседали на дно культурального флакона и распластывались. При замене среды с МЦ на стандартную культуральную среду клетки фибробластов прикреплялись к субстрату, распластывались и пролиферировали. Формирование монослоя наблюдали в теже сроки, что и у контрольных образцов.
При культивировании клеток на губке «Геласпон» наблюдали ее деградацию через 72 часа. На дне культурального флакона формировался монослой. Монослой формировался в те же сроки, что и в контрольных образцах.
Полученные данные дают нам основание предположить, что МЦ и губка «Геласпон» могут быть использованы в качестве носителей аллофибробластов при лечении ран. Клетки в МЦ и губке «Геласпон» находились в активном функциональном состоянии, близком к таковому в коже.
При нанесении МЦ на раны гель образовывал пленку в течение 5 - 10 мин по всему периметру раневой поверхности.
Губка «Геласпон» после аппликации и легкого прижатия к раневой поверхности, плотно прилегала к раневой поверхности.
На первом этапе были проведены исследования влияния пористой губки «Геласпон» и геля МЦ на процессы заживления ран у крыс (табл. 1).
Табл. 1. Скорость заживления ран при использовании фибробластов на раличных носителях
Вариант Скорость заживления ран, %
7 сутки 14 сутки 21 сутки
X ± Sx X ± Sx X ± Sx
I 7,38±0,82 5,72±2,63 11,87±0,65
II 8,89±0,721 11,54±0,6212 14,03±0,6312
III 9,27±1,0515 3,51±0,1515 14,29±0,5215
IV 0,66±0,5313 7,87±0,5313 13,15±0,231
V 2,98±0,8314 9,69±0,5414 13,83±0,091
Примечание: I - контроль, без лечения; II - нанесение МЦ; III - нанесение фибробластов в МЦ; IV-нанесение пленки «Геласпон»; V - нанесение фибробластов в пленке «Геласпон».
1 - различия достоверны по сравнению с контролем соответствующих сроков,2 - различия варианта II достоверны по сравнению с вариантом III соответсвующих сроков,3 - различия варианта IV достоверны по сравнению с вариантом III соответсвующих сроков,4 - различия варианта V достоверны по сравнению с вариантом IV соответсвующих сроков, 5 - различия варианта V достоверны по сравнению с вариантом III соответсвующих сроков.
Установлено, что нанесение МЦ на рану способствовало незначительному заживлению. Скорость заживления ран (СЗР) в контроле через 7 суток после их формирования составляла 7,38±0,82 %, что было в 1,5 раза ниже, чем при использовании МЦ. При нанесении губки «Геласпон» скорость заживления на 7 сутки составляла 0,66±0,53 %, что в 11,2 раз была ниже, чем в контроле. В последующие 14 суток (с момента формирования ран) СЗР при использовании МЦ составляла 11,54±0,62 %, что достоверно выше (в 2 раза), чем у животных в контрольной группе в эти же сроки наблюдения, а при использовании губки «Геласпон» 7,87±0,53 % , что достоверно ниже, чем в контроле ( в 1,4 раза). К 21 суткам наблюдения (с момента формирования ран) СЗР у животных с нанесением МЦ составляла 14,03±0,63%, что было достоверно выше, чем контроле. У животных СЗР под пленкой «Геласпон» составляла 13,15±0,23 %, что было незначительно ниже, чем в СЗР в контроле, но различия были достоверны.
Нанесение на раневую поверхность МЦ с фибробластами не привело к достоверным изменениям СЗР по сравнению с СЗР при внесении только МЦ. Эти показатели на 7 сутки наблюдения составляли 9,27±1,05 % и 8,89±0,72 %, соответственно. При нанесении на рану губки «Геласпон» с фибробластами скорость заживления раны увеличилась в 4,5 раза, по сравнению с СЗР в группе животных с нанесением губки без фибробластов. На 14 сутки наблюдения в группах животных, которым на рану наносили фибробласты в МЦ или в губке «Геласпон» СЗР составляла 13,51 ±0,15 % и 9,69±0,54 %, соответственно, что достоверно выше, чем в контрольной группе, и достоверно выше, чем при нанесении на рану МЦ или губки «Геласпон» без клеток. На 21 сутки наблюдалась та же тенденция, что и на 14 сутки.
При сравнении СЗР при нанесении фибробластов в МЦ и в губке «Геласпон» установлено, что на 7 сутки после начала лечения СЗР составляла 9,27±1,05 % и 2,98±0,83 % соответственно. Фибробласты, нанесенные в МЦ значительно ускоряли процесс заживления ран, СЗР
при таком лечении была в 3,1 раза выше, чем при использовании губки «Геласпон». К 14 суткам разница между СЗР в группе животных которым наносили фибробласты в МЦ составляла 3,82 % по сравнению с группой животных, которым наносили фибробласты на губке «Геласпон». И совсем небольшие, но достоверные, различия между этими группами отмечали на 21 сутки. Репаративные процессы в ране под губкой «Геласпон» с фибробластами протекали значительно меделннее, чем при использовании в качестве носителя МЦ на протяжении всего срока наблюдения.
Раневой процесс сопровождается изменением ряда биохимических показателей крови. Главным органом, реагирующим на процессы, протекающие в ране, является печень. Белки, синтезирующиеся в печени и поступающие в крове-ток, определяют в известной степени течение воспалительного процесса. Для наблюдения за течением процессов регенерации нами были выбраны несколько медленно реагирующих маркеров острофазового процесса, что позволило судить об эффективности метода клеточной терапии. Одними из реактантов острой фазы являются гликопротеиды. Условно к реактан-там относятся церулоплазмин и серомукоиды. Повышение этих острофазовых белков отмечается через 24 - 48 часов после повреждений тканей различной этиологии.
Повышение концентрации острофазовых белков связано со стремлением организма к восстановлению нарушеного гомеостаза и созданию условий для репаративных процессов.
Известно, что концентрация гликопротеидов начинает возрастать через 24 часа от начала воспаления. В сыворотке животных контрольной группы к моменту формирования ран уровень гликопротеидов (Гл) возрастал в 1,6 раз по сравнению с сывороткой интактных животных (табл. 2).
К 7 суткам уровень Гл возрастал в 2,0 раза. На 14 - 21 сутки концентрация этого острофазового белка постепенно снижался, достигая нормы к 25 суткам.
При аппликации на раны МЦ и губки «Гелас-пон» без фибробластов уровень Гл в сыворотке на 7 сутки достоверно не отличался от показателей Гл в сыворотке нелеченых животных. К 14 суткам уровень Гл достоверно снижался в подопытных группах, которым наносили фибробла-сты, независимо от применяемого носителя. На
Табл. 2.
Содержание гликопротеидов в сыворотке крови при различных способах лечения ран у лабораторных крыс
21 сутки норма Гл была отмечена только у животных, которым наносили фибробласты в МЦ. У животных, на раны которых наносилась губка «Геласпон» с фибробластами, показатель Гл был незначительно выше нормы, но различия достоверны.
Вариант Содержание гликопротеидов, г/л
0 сутки 7 сутки 14 сутки 21 сутки
X ± Sx X ± Sx X ± Sx X ± Sx
I 0,34±0,13
II 0,53±0,021 0,69±0,0231 0,51±0,031 0,46±0,0261
III 0,67±0,0212 0,47±0,0212 0,42±0,0212
IV 0,49+0,017123 0,40+0,01123 0,33±0,0212,3
V 0,68±0,0351 0,48±0,0212 0,40±0,0212
VI 0,42±0,01124 0,38±0,02124 0,37±0,04124
Примечание: I - контроль, интактныеживотные; II - контроль, без лечения; III - нанесение ML ; IV - нанесение
фибробластов в МЦ; V - нанесение пленки «Геласпон»; VI- нанесение фибробластов в пленке «Геласпон». 1 - различия достоверны по сравнению с контролем I; 2 - различия достоверны по сравнению с контролем II соответствующих сроков;3 - различия варианта III достоверны по сравнению с вариантом IV соответсвующих сроков; 4 - различия варианта V достоверны по сравнению с вариантом VI соответсвующих сроков.
Одним из белков острофазового показателя, вовлеченного в процесс заживления ран, является церулоплазмин (Ц). Он имеет большое значение для уменьшения воспалительного процесса. Церулоплазмин устраняет свободные радикалы внеклеточно и может защищать клетки от перекисного окисления липидов, вызванного супероксидом и другими радикалами [1]. Уровень Ц возратает через 48 часов после на-
чала воспаления.
К моменту формирования ран в группе животных, не получавших лечение, уровень Ц возрастал в 1,8 раза по сравнению с нормой (табл. 3). На 7 сутки этот показатель возрастал в 2,5 раза. Снижение уровня Ц в сыворотке крови начиналось на 21 сутки, показатели Ц вернулись к норме к 30 суткам.
Табл. 3.
Содержание церулоплазмина в сыворотке крови при различных способах лечения ран у лабораторных крыс
Вариант Содержание церулоплазмина, мг/л
0 сутки 7 сутки 14 сутки 21 сутки 25 сутки
X ± Sx X ± Sx X ± Sx X ± Sx X ± Sx
I 278,5±18,4
II 497,3±25,21 689,3±22,11 539,5±25,31 438,5±26,11 412,4±25,91
III 595,0±21,712 479,8±29,21 402,3+20,412 325,6±16,712
IV 433,3±22,912,3 276,5±20,212,3 279,5±22,012,3 276,7±13,812,3
V 582,67±24,212 507,67±19,912 397,8±14,312 300,1±21,412
VI 605,67±15,2124 475,8±20,5124 403,5±12,4124 280,5±14,5124
Примечание: I - контроль, интактныеживотные; II - контроль, без лечения; III - нанесение МЦ; IV - нанесение фибробластов в МЦ; V - нанесение пленки «Геласпон»; VI- нанесение фибробластов в пленке «Геласпон». 1 - различия достоверны по сравнению с контролем I; 2 - различия достоверны по сравнению с контролем II соответствующих сроков;3 - различия варианта III достоверны посравнению с вариантом IV соответсвующих сроков; 4 - различия варианта V достоверны по сравнению с вариантом VI соответсвующих сроков.
При использовании аппликации МЦ без фибробластов уровень Ц был достоверно ниже, чем в группе животных без лечения на протяжении всего срока наблюдения 7 - 21 суток, но превышал показатели контрольной группы животных. При внесении фибробластов в МЦ на 14 и 21 сутки содержание Ц соответствовало норме. При использовании в качестве носителя губки
«Геласпон» показатель Ц возвращался к норме к 25 суткам.
Заключение
На основании полученных экспериментальных даннных был сделан выбор иммобилизатора для фибробластов. Гель на основе МЦ сам по себе оказывал лечебное действие, о чем свидетельствовали показатели скорости заживления
ран и белки острой фазы воспаления. Аппликация геля МЦ с фибробластами ускоряла процессы репарации в ране, восстанавливала го-меостаз организама.
Применение в качестве иммобилизатора губки «Геласпон» по эффекту действия на репаратив-ные процессы уступает метил целлюлозе при данной модели патологии. Такой метод нанесения фибробластов на рану показал недостаточную эффективность.
Возможно, применение губки «Геласпон» на первой фазе раневого процесса задерживает отторжение некротических тканей, не смешивается с раневым эксудатом, тем самым ухудшая условия течения раневого процесса.
После деградации губки фибробласты начинают активно участвовать в репаративных процессах поврежденных тканей, что и отражается в процессе уменьшения площади ран и нормализации острофазовых показателей сыворотки крови, с некоторым запозданием, по сравнению с процессами регенерации в ранах леченых фибробластами в МЦ геле.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о высокой репаративной активности аллофибробластов при лечении ран. Эти результаты могут лечь в основу метода лечения трофических язв, ожогов и долго незаживающих ран у человека. При этом в качестве иммобилизатора клеток можно использовать 1,5 % гель метилцеллюлозы, который усиливает репара-тивный процесс фибробластов.
Литература
1. 1.Алексеева Н.М. Изменение активности церуло-ллазмина в сыворотке крови под воздействием различных факторов // Гигиена и санитария. -1991. - № 8. - С.70 - 71
2. Апюшин М.Т, .Артемьев А.И, Тракман Ю.Г. Синтетические полимеры в отечественной фармацевтической практике. - М.: Медицина, 1974. - 152 с.
3. Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. - М.: МЕДПресс-информ, 2004. - 920 с.
4. Колосов Н.Г., Повещенко О.В., Ефремов A.B., Самарин Д.М, Селедцова Г.В., Козлов В.А. Использование фетальных клеток и тканей в лечении поверхностных ран и трофических язв. - Трансплантация фетальных тканей и клеток. Сб.науч.ст./ Под ред.. В.И.Кулакова, Г.Т.Сухих. // Бюл. экспе-рим.биологии и медицины.- 1998. - Т. 126. - С. 1286.
5. Патент №64540, Украша, МПК А61К35/48. Препарат Ембрюгель для зовшшнього застосування та cnociö його отримання/ O.I. Гончарук, C.B. Кощий, Т.П. Петренко, A.A. Гапон, О.Б. Ревенко, B.I. Гри-щенко. Заявл. 24.06.03, №2003065810. Публ. 16.02.04. Бюл. № 2, C. 442
6. Раны и раневая инфекция. / Под ред. М.И. Кузина и Б.М. Костюченок. - М.: Медицина, 1990. - С.83 -102
7. Рациональная антимикробная фармакотерапия: Руководство для практикующих врачей / Под ред. В. П. Яковлева, С. В. Яковлева. - М., 2003
8. СмирноваТ.Д., Парамонова Б.А., ЦареваТ.Р., Му-стейкис Д.Г., Еропкин М.Ю., Комаров A.M., Карпухина Л. Г. Кудояров М.Ф.// Использование диплоидных клеток человека, выращенных на пористых пленках, при восстановлении ожоговых ран // Цитология. - 1999. - Т. 41, № 3-4. - С. 313
9. Fauser A.A., Messner H.A. Granuloerythropoietic colonies in human bone marrow peripherae dlood and cord blood. // Blood. - 1978 - Vol. 52. - P. 1243 -1248
10. Nagle S.C., Tribbe H.R., Gary N.D. " A Chemically Defined Medium for Growth of Animal Cells in Suspension // Proc.Soc.exp.Biol.Med. - 1963. - Vol. 112. - P. 340 - 344
Реферат
РОЛЬ АЛЛОФ1БРОБЛАСТ1В В ПРОЦЕСАХ РЕГЕНЕРАЦИ РАН АбрафковаЛ.Г., Петренко Т.Ф., Кощш С.В., Гончарук G.I.
Ключов1 слова: аллоф1бробласти, кл1тинна терап1я, швидкють заживления ран, гострофазов1 бтки.
В робот1 представлен! дан1 по вивченню впливу аллоф1бробласт1в на процеси регенерацп експери-ментальних ран у тварин. Дослщжена можпивють застосування р1зних носив до ф1бробласт1в. Вивче-на динамка змш гострофазових бтк1в у сироватц1 кров1 експериментальних тварин.
Summary
ROLE OF ALLOFIBROBLASTS IN THE PROCESSES OF WOUND REGENERATION
Abrafikova L.G., Petrenko T.F., Koshchiy S.V., Honcharuk Ye.I.
Key words: allofibroblasts, cell therapy, wound healing rate, acute phase proteins.
The paper presents the data on the effect of allofibroblasts on the regenerative processes of experimental wounds in animals. There have been studied the potentials in using various carriers for fibroblasts and the dynamics in acute phase protein changing in blood serum of test animals.
