CC BY
597
(Окончание. Начало в №1 (21), 2002 г.)
2. Связывание хитозана с молекулами тяжелых металлов и их солями.
Хитозан, хитин и их производные образуют прочные хелатные связи с металлами, вследствие чего селективно извлекают ионы ртути, кобальта, золота, серебра, хрома, ирридия, палладия, свинца, кадмия, никеля, железа и других металлов из сточных вод, солевых растворов и морской воды [90,102]. Емкости сорбентов по отношению I к ионам металлов достигают 300 мг металла на грамм сорбента по меди, 500 мг/г по свинцу, 110 мг/г по цинку, 130 мг/г по кадмию, 500 мг/г по урану. Биосорбенты обладают высокой степенью извлечения из разбавленных растворов (концентрация ионов металлов менее 1 мг/л) [5].
Исследователи установили, что атомы углерода, содержащие аминогруппы в линейном полимере, являются не единственными точками реакции с молекулами металла. В процессе сорбции участвуют и не реактогенные группировки глютаральдегида [57].
На основе хитина и хитозана получены ионообменники, обладающие высокой обменной емкостью [17, 18, 28, 30]. Хитозан образует с медью комплекс, который используется в качестве инициатора винильной полимеризации метилметакрилата и акрилонитрила [59,60]. Хитин и хитозан представляют перспективы для создания новых технологических процессов по выделению актиноидов [83,88,89].
Хитин, получаемый обычным способом из большинства грибов, например после получения лимонной кислоты с использованием Aspergillus niger, представляет собой не индивидуальное вещество, а комплекс хитина с |3-1,3-глюканом, который называют хитин-глюкановым комплексом. Было обнаружено, что грибная масса некоторых простейших грибов извлекала в течение первые 5 минут до 72,75% кадмия (Cd). Особенно активное извлечение тяжелого металла наблюдалось при низких значениях рН (3,0-5,0) [96].
Изучена сорбция Си и U02 на аллилхитозане в зависимости от поглощенной дозы. После облучения емкость аллилхитозана к обоим катионам увеличивается, что связано с его радиационно-химическими превращениями, в результате которых возникают дополнительные центры сорбции - карбоксильные группы. Облучение изменяет и кинетику сорбции: скорость сорбции уменьшается, и тем существеннее, чем выше степень замещения. Это может быть связано с уплотнением надмолекулярной структуры аллилхитозана [16]. Ряд авторов получал конъюгат хитозана с аминокислотными остатками, соединяя его с карбоксильной группой глиоксиликовой кислото-содержащей единицей хитозана. В результате конъюгат удалял из растворов тяжелые металлы Си, Ni, Co и Мп. При присоединении к хитозану аминокислоты извлечение тяжелых металлов возрастало [62].
Получены хитинсодержащие материалы «Микотон» из биомассы высших грибов -Higher Basidiomycetes. Высшие грибы содержат уникально высокие массы хитина в клеточной стенке. Содержание его достигает 50%, а у гриба Fomes endopolus - 65%. Вегетативные гифы грибов имеют линейные и разветвленные нити цилиндрической формы с гладкой поверхностью. При удалении живого протопласта и других растворимых компонентов клеточной стенки остается нерастворимая ее часть - хитин-глюкановый комплекс и меланины. Толщина микрофибрилл хитина 15-25 нм, длина - 12 мкм. Глюканы - это аморфный матрикс, обеспечивающий связь между микрофибриллами. Меланины растворены в глюканом матриксе. Меланины защищают живую клетку от действия УФ-радиации и проникающего излучения [14]. Таким образом, микотон - это хитин (60-95%), глюканы (5-35%) и меланины (0-10%). В сухом состоянии материал обладает высокой пористостью. Преобладают поры размером 5 нм. Микотон-хитин можно перевести в микотон-хитозан (хитозан-глюкан-меланиновые волокна). Материал можно модифицировать введением различных химических радикалов или соединений. Оптимум работы сорбента находится при значениях рН 5,0-6,0. Наиболее высокие сорбционные свойства показаны в растворах органических кислот. Важной особенностью микотона является индифферентность к основным биогенным металлам
- К, Na, Ca и другим легким элементам. Концентрация солей этих металлов до 400 г/л не оказывает существенного влияния на сорбционные показатели. Сорбенты устойчиво работают в растворах с высоким содержанием поверхностно-активных веществ.
При изучении механизмов сорбции ионов тяжелых металлов на хитине и хитозане авторы отталкиваются от концепции центральной роли атома азота первичной аминогруппы полимера. Азот несет свободную электронную пару, способную к координации с атомами металлов. В растворе аминогруппы полисахаридов ведут себя как сильные основания Льюиса. Образовавшаяся связь иона металла с азотом в дальнейшем усиливается взаимодействием с гидроксильными и другими функциональными группами с образованием хелатов. При этом взаимодействии принимает участие и атом кислорода от гидроксильной группы, вступающей во взаимосвязь с ионами металлов. Хитозан по сравнению с хитином обладает более высокой селективностью и сорбционной емкостью, что объясняется его значительной гидрофильностью за счет большего количества ОН" групп. Сорбции способствует и высокий уровень активных первичных аминогрупп, и гибкая структура полимерных цепей хитозана. Это создает благоприятную конфигурацию для комплексообразования с ионами металлов [61]. Хелатный комплекс хитозана с металлами можно проследить на модели, в состав которой входят две аминогруппы и ОН" или О-группы D-глюкозаминного остатка. Из модели следует, что степень дезацетилирования хитина является важным фактором при сорбции ионов металлов [99]- Кристалличность микрофибрил может быть снижена дезацетилированием. Уровень дезацетилирования для оптимальной сорбции металлов - 40-60% [72,73]. При увеличении числа первичных аминогрупп в молекуле хитина увеличивается число доступных сорбционных центров для металлов. При увеличении степени дезацетилирования больше 60% появляется новая кристаллическая решетка в микрофибриллах хитина, и это снижает сорбционную активность полимера по отношению к металлам. Захват металлов происходит по двум путям: биоаккумулирование и биосорбция. Известны 4 механизма, обеспечивающие сорбцию металлов на примере структуры грибной клеточной стенки:
1. Слабое связывание незаряженных атомов или молекул за счет электростатического притяжения (Ван-дер-ваальсовые силы). Вклад этого механизма в сорбции металлов, очевидно, незначителен;
2. Ионообменный механизм характерен для связывания щелочных и щелочноземельных металлов. Хитинсодержащие колмплексы не сорбируют щелочные и щелочно-земельные металлы. Таким образом, этот механизм не имеет большого значения;
3. Хелатный механизм наиболее характерен для хитиновых и хитозановых макромолекул, реакционные группы которых формируют с тяжелыми металлами прочные ковалентные и комплексные связи;
4. Адсорбционное осаждение нерастворимых солей металлов на поверхности структур клеточной стенки. Это результат, по-видимому, электростатического притяжения [97].
Хитозан в дозе 0,7 г/кг был испытан на кроликах и бычках, содержащихся в условиях промышленной зоны среднего Урала (Челябинская область). В течение 2 недель препарат хитозана вводили энтерально животным ежедневно 1 раз утром (кролики) и по два дня с интервалом в 2 дня (бычки). Авторы контролировали содержание в периферической крови тяжелых металлов: Pb, N Fe, Со, Zn, Mn. Применение хитозана вызвало достоверное снижение свинца на 64,4%, никеля - на 68,55%, и железа - на 35,3%. Применение препарата привело к увеличению концентрации эритроцитов на 17%, снижению количества лейкоцитов на 6,87%, увеличению выработки тромбоцитов на 58,7%. Авторы показывают, что хитозан следует применять для фармакологической коррекции аномального содержания тяжелых металлов в организме животных [26].
3. Кинетика хитозана в коже и других тканях.
Движение и распределение любого ксенобиотика в коже подчиняются законам диффузии, везикулярного транспорта, конвекционного переноса [1]. Если проникновение химического соединения главным образом происходит через межклеточные пространства, то взаимодействие его осуществляется как с мембранами кератиноцитов, так и .с холестерином, белками соединительной ткани,
гликопротеидами, полисахаридами межуточного матрикса. Гелеподобный межклеточный матрикс с суммарным отрицательным зарядом находится в равновесном состоянии при взаимодействии с мембранами клеток, несущих также суммарный отрицательный заряд. Формирование зон с заряженным коллоидом и зон с избыточным количеством воды обеспечивает активный конвекционный перенос как в силу градиента концентраций, так и в силу электростатических взаимодействий. Постоянное внедрение в кожу и поступление из сосудистого русла ксенобиотиков, особенно полимеров с противоположным суммарным зарядом, поддерживает направление капиллярного конвекционного потока жидкости и растворимых в ней веществ к фенестрам венозных капилляров и венул к стенкам лимфатических микрососудов [13, 33]. Равновесное состояние между кровеносной и лимфатической системами в коже обеспечивает механизмы внесосудистого переноса веществ, поддерживает' пластический резерв соединительной ткани, реализацию секретируемых веществ на микроциркуляторном модуле, механизмы иммунной защиты. При развитии острой экземы растет объем интерстициальной жидкости, с одной стороны, в результате профузного диапедеза через многочисленные межэндотелиальные течи кровеносных капилляров, с другой стороны, формирования блока сброса излишнего объема жидкости в лимфатическое русло. Аккумуляция белковых структур в межуточном матриксе формирует секвестры жидкостных потоков с нарушением дренажной функции ткани. Продукты протеолиза фибриллярных структур создают порочный круг и усугубляют процесс.
Изучение кинетики меченного флюоресцеином изотиоционатом (ФИТЦ) хитозана в коже начинается с кинетики изолированного ФИТЦ. Нанесение на экскориированную кожу флюоресцеина (5*104моль/л) с последующей контактной биомикроскопией показало, что препарат накапливался первоначально в эпидермисе в межклеточных пространствах. В сосочковом слое дермы ФИТЦ распределялся неравномерно, вероятно, согласно току тканевой жидкости по сформированным интерстициальным каналам между коллагеновыми волокнами [24]. У больных с экземой эвакуация флюоресцеина из лимфатических капилляров задерживается на 1,5-2 часа по сравнению с интактной кожей (30-40 мин). Время эвакуации препарата из эпидермального слоя в сосочковый в нормальной коже происходит в течение 1 часа на 76%. При развитии экземы такая эвакуация препарата замедлена (52% на втором часу экспозиции), препарат концентрируется в кератиноцитах. При контактном аллергическом дерматите эвакуация флюоресцеина также задерживается из эпидермального слоя (47 ± 7% против 24 ± 3% в контрольной группе здоровых лиц), но ускоряется из слоя дермы. При развитии экземы задержка транслокации препарата была характерна для обоих слоев кожи (52 щи 6% против 10 ± 3% в контроле в эпидермисе и 64 ± 10% против 35 ± 5% в контроле в дерме). Известно, что кати-онные флюорохромы довольно быстро в течение 2-3 сек. способны проникнуть из капилляров в сосочковый слой дермы и достигнуть границы эпидермиса, а через 6-8 сек. распределиться в эпидермальном слое межклеточно. С целью изучения кинетики хитозана в коже авторами настоящего обзора использован низкомолекулярный водорастворимый хитозан с молекулярной массой 10-15 Щ степенью деацетилирования 94%, ковалентной меткой - флюоресцеином изотиоцианатом в каждом десятом звене линейного полимера (СМ. Насибов, лаборатория синтеза и испытания сорбентов НИИ ФХМ МЗ РФ, г. Москва). В исследованиях использованы беспородные крысы. Под внутрибрюшинной нейролептоанальгезией (фентанил + дроперидол) в области спины у первой группы животных наносились по 6 скарификаций площадью 0,25 см2, у второй группы крыс по 6 полнослойных линейных кожных ран длиной 1 см. На кожные дефекты одной стороны спины наносились аппликации водного раствора хитозана-ФИТЦ (1 мг/мл). На противоположной стороне спины кожные дефекты закрывались компрессными аппликациями с водным раствором ФИТЦ (0,01 мкг/мл). Третью группу животных составляли крысы, которым на интактную кожу в области спины по обе стороны от позвоночного столба наносились идентичные аппликации растворов ФИТЦ-хитозана и ФИТЦ. Аппликации сохранялись в течение 1, 2,-4, 8, 12 и 24 часов. Фрагменты кожи после временных интервалов извлекались, растягивались на бумажных
полосках и помещались в тканевой фиксирующий раствор (10% нейтральный формалин). Гистологические замороженные срезы анализировались в
флюоресцентном микроскопе марки «ЛЮМАМ-ИЗ». Результаты исследований показали, что водорастворимый хитозан в интактной коже способен проникать трансфолликулярно (через устья волосяных фолликулов) и трансгландулярно (через устья желез) в течение первых 1-2 часов аппликаций раствора полимера. Скарифицированная кожа ускоренно пропускает полимер трансэпидермально наряду с трансфолликулярным
и трансгландулярным путями пенетрации. Полнослойные дефекты кожи способны быстро пропускать хитозан с последующим связыванием его с волокнами коллагена в течение 12 часов от момента нанесения [21].
При изучении кинетики водорастворимого меченого 1251-хитозана при условии введения его в циркуляторное кровеносное русло (внутривенно) было установлено, что высокоочищенные низкомолекулярные полимеры с молекулярной массой меньше 5000D обнаруживают быстрый клиренс в крови уже через 1 час после введения. Уровень в плазме через 1 час после введения составлял для хитозана с Мм меньше 5000D 32,2 ± 10,5%, с Мм больше 10000D - 26,0 ± 0,5%. Кумуляция в печени значительно зависела от молекулярной массы: 26,5 ± 4,9% от введенной дозы
- для хитозана с Мм меньше 5000D и 82,7 ± 1,9% - для хитозана с Мм больше 10000D. Подтверждено, что низкомолекулярные водорастворимые хитозаны не кумулируют в печени [98]. При введении экспериментальным мышам внутрибрюшинно водорастворимого меченого флюоресцеин изотиоцианатом 50% деацетилированного хитозана показано, что полимер быстро выводился почками, его следы обнаруживаются в печени, селезенке, плазме крови и жидкости полости брюшины. Максимальное выделение хитозана с мочой констатировалось через 14 часов от момента инъекции. Эти результаты характерны только при условии применения низкомолекулярных образцов полимера [94].
При изучении распределения полимеров в клеточных взвесях отмечается, что гранулоциты и макрофаги способны аккумулировать хитин и его продукты на своей клеточной поверхности [115].
4. Использование хитозана и его производных в управлении раневым процессом.
Высокая биосовместимость хитозана и его производных, чрезвычайно низкая токсичность, биодеградабельность, антимикробные и антитоксические свойства позволили ряду исследователей использовать эти полимеры для управления стадиями раневого заживления. В этом вопросе как нельзя лучше можно проследить роль молекулярной массы, степени вязкости и деацетилирования, растворимости в кислотах и воде, механизмы связывания и утилизации с клеточными элементами и межклеточным матриксом в условиях воспалительного процесса. На модели лиофилизированной дермы было показано, что хитозан как самостоятельный полимер и в смеси с гиалуронатом натрия независимо от концентрации водородных ионов способен проявлять феномен адгезии к элементам дермы [111]. Сила адгезии была выше, если в систему вносился один хитозан. В случае привязки к хитозану водорастворимых субстанций (например, антибактериальных веществ или бриллиантового голубого), их выделение в ткани зависело от соотношения полимера и самих веществ. В случаях использования в раневом процессе хитозановых пленок с включенными в них целевыми лекарственными веществами процесс выделения лекарств осуществлялся в зависимости от молекулярной массы хитозана, степени аминирования, концентрации тканевого лизоцима и рН полимера (концентрации кислых остатков слабых кислот в молекуле). С увеличением степени деацетилирования хитозана и ростом кислых остатков в полимере возрастала деградация его в ткани и соответственно увеличивалось выделение в среду лекарственных субстанций [123]. Кроме того, такая же зависимость обнаруживалась и при росте молекулярной массы полимера с 58000 до 380000 D. Внесение в дорсальные кожные раневые дефекты у кроликов капсулированной формы N карбоксибутилхитозана приводило к правильно программированной пролиферации и
организации тканей, стимулированию процесса восстановления во времени, новообразованию сосудов. В то же время процессы гиперпродукции фиброзной ткани (рубцевания) существенно подавлялись по сравнению с контрольнй группой животных. Такие же закономерности установлены и при заживлении раневых дефектов у собак и кошек [85, 92]. Такая направленность раневого заживления важна не только в случаях гнойного инфицирования тканей, но и при производстве плановых пластических операций [40]. Установлено, что использование ^карбоксибутилхитозана для заживления мест донорского забора кожи при пластических операциях по сравнению с контрольными ранами приводит к лучшей организации гистоар-хитектоники, лучшей васкуляризации и отсутствию воспалительной клеточной инфильтрации. Это имеет прямое отношение как к дерме (мальпигиевому слою), так и к эпидермису [39]-Упорядоченная организация соединительной ткани кожи, особенно в-грануляционную фазу заживления, зависит и от количества нарабатываемых окисляющих субстанций. Выделение оксида азота в раневом процессе увеличивает цитотоксичность в клеточной пролиферации при заживлении раны в течение начальной фазы воспалительной реакции. Хитин и хитозан обнаруживают существенное ингибирование продукции оксида азота активированными макрофагами. Испытание воздействием на активированные клетки ^ацетилхито-тетраозы, -триозы, -диозы и мономера хитина выявляет слабый эффект по сравнению с использованием полисахарида [58]. Снижение воспалительной реакции в фазу репарации кожи во многом зависит от активности резидуальных макрофагов. Ингибирование макрофагальной активности (контроль картины респираторного взрыва) с помощью лактата хитозана приводит к функционально ориентированной архитектонике коллагеновой подложки. Картину дополняет процесс стимулирования пролиферации фибробластов. При сравнении действия на воспалительную и грануляционную фазы раневого заживления известных стандартных полисахаридов (альгината натрия или кальция, каррагинана, пектиновой кислоты, хондроитинсульфата, хитина) и хитозана подтверждается, что последний полимер имеет существенные преимущества - возможность полноценного управления раневым процессом [104]. При процессах усиленной пролиферации фибробластов и образования рубцовой ткани в коже комплексы, содержащие хитозан, способны подавлять излишнюю функцию клеток, регулировать резорбцию гиперпродукта и, таким образом, предупреждать грубое рубцевание [86,99]. При использовании хитозанов, полученных из мицелия грибов, феномен стимуляции фибробластов может отсутствовать в результате подавления реакции грибными меланинами [47].
Использование хитозана и его карбогидратных производных в модели дисфункции тромбоцитов показало, что полимеры способны вмешиваться в систему гемостаза в раневом дефекте. Нанесение билатеральных линейных ран (15x2 мм) в области языка у экспериментальных новозеландских кроликов с моделью дисфункции тромбоцитов (введение в сосудистое русло животных простациклина или простагландина 12) и при введении в опытные раны карбогидратной формы хитозана приводиЛ к сокращению времени коагуляции крови и времени кровотечения на 56% (Р = 0,003) [67].
Организацию соединительной ткани в коже при репарации раны с помощью хитозановых полимеров логично рассматривать с момента взаимодействия коллагена и хитозана. В искусственной системе бычьего коллагена и 100% деацетилированного высокомолекулярного хитозана происходят прежде всего электростатические взаимодействия. Сила этих связей довольно слабая и зависит от плотности заряда и длины коллагеновой цепи. Чем выше доступность к активным центрам хитозана (короткие цепи полимера),, чем выше плотность заряда (высокая степень деацетилирования), тем проще образование в водной среде состояния геля и получение плотного поликатионполианионового комплекса [114].
При взаимодействии хитозана и коллагена может возникнуть комплекс в том случае, если взаимодействие происходит при контакте с эндогенной водой. Оптимальные условия образования комплекса достигаются в случае взаимодействия полимеров в форме солей. Установлено, что при соотношении хитозана и коллагена 18,5% (электростатическая стехиометрия) все анионные группы коллагена теоретически взаимодействуют и полностью нейтрализуют Ш3-группы хитозана. Такое соотношение является условием трансформации коллагена в застывающую массу (гель) согласно
его изоэлектрической точке [112]. Наряду с электростатическими взаимодействиями коллагена и хитозана при большом избытке хитозана возможно образование комплекса на основе водородных связей [113]. Авторы работы установили, что трехспиральная структура коллагена укрепляется в присутствии хитозана. Однако при избытке хитозана и образовании комплекса с водородными связями стабильность трехспиральной коллагеновой структуры нарушается в сторону денатурации. При этом цепи коллагена могут вступать или не вступать во взаимодействие с хитозаном. Констатировано, что максимально 38% анионных сайтов коллагена взаимодействуют с функциональными группами хитозана. Взаимодействие происходит только при условии достаточно высокой плотности заряда и электростатического потенциала [52]. Наряду с прямым тормозным влиянием хитозана на гидролиз коллагена предполагается ингибирование активности протеолитических ферментов. Установлено, что лиофилизация комплекса коллагена с хитозаном снижает стабильность коллагена и увеличивает скорость его деградации, снижает резистентность его кпротеолизу ферментом. В этих условиях хитозан коллагеназа не меняет свойств хитозана, более того, он сам снижает ее активность. Если коллаген денатурируется в избытке хитозана, то он становится нечувствительным к специфическим коллагеназам [107].
Управление раневым процессом можно осуществлять с помощью растворимых регуляторных биологически активных субстанций, полученных в результате инкубирования или культивирования гранулоцитов, макрофагов, "лимфоцитов,
фибробластов. Введение этих субстанций в эластичные и мягкие хитозановые губки или пленки позволяет дозированно воздействовать на межклеточные отношения. Например, введение в метилполивинилпирролидон-хитозан основного фактора роста фибробластов и последующее получение из этого геля эластичной и мягкой пластинки приводит к получению природного продукта с заранее заданными свойствами -способностью регулировать скорость роста и размножения фибробластов [37]. Степень миграции и пролиферации фибробластов регулируется степенью адгезии клеток к гелю хитозана. Это обеспечивает дозированный синтез коллагена в межклеточный матрикс и регулярную самосборку коллагеновой сетки в коже [99]. Сульфатирование полимера и далее образование и использование коллаген-хитозанового комплекса приводит к усилению адгезии фибробластов на этом матриксе, получению высоких показателей локомоции клеток воспалительного раневого ..процесса. Таким образом, сульфогруппы полимера способны формировать сигнал к фенотипической трансформации клеток раневой регенерации [81]. Однако введение в искусственную систему фибробластов даже неочищенных источников хитина-хитозана, например, мицелия грибов Aspergillus oryzae, Mucor mucedo, Phycomyces blakesleeanus приводит к стимулированию пролиферации клеток. Степень пролиферации зависит от количества внесенного в систему хитозана (от слабой стимуляции к значительной и очень значительной, а также к состоянию существенного ингибирования) [47]. Цитоморфологические исследования фибробластов, стимулированных продуктами хитозана, показывают, что клетки обладают свойствами аттрактантов.
Хитозановые полимеры могут быть введены и в абсцедированные полости с положительным результатом. Моделирование в эксперименте у собак подкожного абсцесса с помощью взвеси золотистого стафилококка сопровождалось последующим его дренированием и наложением на кожу шелкового шва. Введение дважды в абсцедирующие полости тонкогранулированной взвеси хитозана в дозах 0,01 мг, 0,1 мг и 1 мг приводило к сокращению
размеров раны и срока полного заживления. При условии введения в раневые полости раствора ампициллина полное заживление на 8-й день наступало только в 40% случаев, при введении 0,1 мг и 1 мг взвеси хитозана полное заживление регистрировалось на 4-й день (5б%) и на 8-й день (90%) [93]. Было подемонстрировано эффективное лечение хронического остеомиелита (средний срок заболевания 24,8 мес.) с использованием антибиотика и хитозана [44]. Авторы полагают, что введение комплекса хитозан-антибиотик в костные полости является простым и надежным методом лечения хронического остеомиелита [44]. Нанесение на раны у крыс-самок линии Wistar хитозановых пленок с включенной лиофилизированной человеческой плацентой приводит к стимуляции всех стадий процесса раневого заживления, сокращению по
сравнению с контрольными ранами сроков формирования демаркационной линии, гранулирования и эпителзации [53]. Самые прочные и устойчивые к гидролазам губки можно получать, растворяя хитозаны как в сильных кислотах (например, в соляной или уксусной), так и в слабых кислотах (например, молочной) [74]. Стабильность при хранении таких пленок также зависит от органического растворителя хитозана и степени деацетилирования продукта. Пленки, полученные из
высокодеацетилированных хитозанов (выше 77%), растворенных в уксусной кислоте с последующей лиофильной сушкой, становятся стабильными как при 4 °С, так и при 28 °С Стабильность может быть не нарушена и при 120 °С в течение 2 часов [64].
Начат выпуск коллахита - комплексообразующего перевязочного материала в виде пленок и губок, введение в эту матрицу антисептических и анестетических препаратов позволяет существенно повысить эффективность управления раневым процессом, создать условия комфортного заживления, сократить сроки закрытия раневых дефектов [27]. Участие в раневом процессе полисахаридных продуктов с иммобилизованными целевыми веществами целесообразно во второй и третьей фазах воспалительной реакции. Грануляционная ткань начинает формироваться в виде отдельных участков в дне раны. Главное значение в период пролиферации приобретают эндотелий капилляров и фибробласты. Синтезированные фибробластами молекулы коллагена подвергаются самосборке в межуточном матриксе путем линейной полимеризации конец в конец и боковой агрегации. В результате боковых взаимодействий определенных аминокислот трехспиральная структура будущих тонофибрилл приобретают строгий вид каждой нити коллагена по отношению друг к другу. Параллельно происходит синтез фибробластами гликозаминогликанов. Полисахариды, окружающие в межуточном матриксе молекулы коллагена, регулируют скорость образования фибрилл. Гликозаминогликаны создают высокую концентрацию молекул коллагена на определенных участках в ране. Неизбежное возникновение слабых межмолекулярных взаимодействий в результате формирования большого числа коллагеновых фибрилл приводит к стабилизации волокнистых структур. Нарастание массы коллагеновых волокон грануляционной ткани приводит к ее уплотнению с формированием рубца. Частичная резорбция грануляций при участии гликозаминогликанов и тканевого протеолиза является необходимым условием исключения излишнего фиброза. Характер процесса эпителизации зависит от пролиферации, дифференцировки и миграции клеток эпителия. Исходя из качественных характеристик заключительных стадий раневого заживления, логично участие полисахаридных компонентов в целенаправленном управлении [2]. Авторы рекомендаций отмечают, что коллаген-хитозановые комплексы оказывают выраженное стимулирующее воздействие на рост эпителиальных клеток.
Известно, что гепарин активно участвует в процессах раневого заживления. Введение в модель полнослойного расщепленного фрагмента человеческой кожи in vitro хи-тозан-гепаринового комплекса, основанного только на ионных связях, в виде пленки или геля обеспечивает жизнеспособность ткани при инкубировании. Через 7 дней инкубирования в 90% случаев определяются признаки ре-эпителизации по сравнению с 30% в контроле (введение только гепарина или без какого-либо введения). Механизм лечебного эффекта связан с постепенной биодеградацией хитозана и выходом в раневую среду гепарина. Содержание гепарина в хитозане оказывает существен-ное влияние на сроки восстановления ткани [70, 71].
Защитное действие от специфических ферментов при репаративных процессах в коже проявляется и в отношении к основным гликозаминогликанам. Полноценная утилизация в коже хондроитинсульфата и гиалуроновой кислоты возможна при участии в системе заживления хитозана. Анализ гидролиза этих дермальных полианионов с помощью ферментов показал, что хитозан существенно задерживает этот процесс, обеспечивая, таким образом, пролиферацию и клеточную адгезию на этих полианионах. Отмечается, что защитный эффект от гидролаз был выше при использовании чистого хитозана по сравнению с примененными хитозан-гликозаминогликановы-ми комплексами [50]. Однако введение в раневой дефект сульфатированных хитозанов или сульфатированных гликозаминогликанов приводит к усилению адгезии фибробластов к ним и к сокращению сроков образования коллагенового матрикса с
картиной правильной архитектоники волокнистой соединительной ткани [82]. Подобная морфологическая картина с формированием соединительной ткани, близкой по своим характеристикам к нормальной коже, может быть получена при использовании в раневых дефектах водорастворимых форм хитозана. Нанесение на полнослойные линейные раны у крыс раствора водорастворимого хитозана приводит к образованию ткани с более высокой степенью натяжения, чем при использовании водонерастворимых хитозана или хитина, росту содержания оксипролина. Усиление эффекта заживления сопровождается быстрым появлением грануляционной выстилки дефекта и полной реэпителизации, отсутствием излишнего фиброза. Полное восстановление волосяных фолликулов отмечено через 7 дней после нанесения раны [45]. Иммуногистохимическии анализ тканей экспериментальных открытых ран (определение коллагенов типов I, III, IV) подтверждает, что внесение хитозана в рану стимулирует образование на 9-й и 15-й дни после операции коллагена типа III. Такая направленность синтеза отсутствует в ране, в которую не вносился полимер [117]. Очень важным обстоятельством является последовательное сочетание двух процессов в раневых тканях. Это усиление инфильтрации к очагу полиморфоядерных лейкоцитов и усиление фибробластной реакции и продукции коллагена.
Детальное исследование пролиферации культуры дермальных фибробластов линии L929 в присутствии хитозана и его производных показало, что размножение клеток происходит благодаря усиленному выделению из них ИЛ-8. Поиск во внеклеточной жидкости таких цитокинов, как ИЛ-1 а, ИЛ-1(3, ИЛ-6, фактор некроза опухоли (ФНО) после введения в систему хитозанового геля установил отсутствие этих регуляторных продуктов [87]. Присутствие в клеточных культурах человеческих фибробластов хитозановых продуктов обеспечивало клеткам высокую жизнеспособность. Увеличение в составах гелей порции хитозана выше 15 весовых процентов приводило не только к сохранению жизнеспособности сидящих на подложке фибробластов, но и создавало феномен пролиферации. При постепенном повышении содержания хитозана в системе степень адгезии и роста клеток возрастали. При достижении доли хитозана 40% по весу показатели силы адгезии и роста фибробластов начинали превышать таковые на коллагене. Форма фибробластов при низких концентрациях хитозана в культуре представлялась сферической с небольшой площадью контакта с подложкой.
Увеличение доли хитозана приводит к формированию веретенообразно вытянутых клеток и увеличению площади контакта с подложкой [69]. Это обстоятельство имеет существенное значение в процессах управления раневым заживлением, особенно на стадии тканевого восстановления.
Использование поливинилалкогольных мембран для выращивания фибробластов было существенно более эффективным, если в подложку включался хитозан. Рост и транслокация клеток были достаточно интенсивными, форма клеток указывала на высокую активность обмена веществ в цитозоле [46]. Известное свойство хитозана образовывать электростатические связи с тяжелыми металлами послужило основой для применения хитозановых мембран с включенными атомами серебра для лечения ожоговых ран. При контакте с ожоговыми кожными дефектами полупроницаемых для сульфадиазина серебра или хлористого серебра хитозановых, целлюлозных, коллагеновых и полиэтиленовых мембран установлено, что только хитозановые мембраны способны в различных биологических средах полноценно обеспечивать раноза-живляющий синергизм полимера и металла, не позволяя атомам серебра абсорбироваться на тканях и вызывать токсический эффект [116].
Введение в хитозановые пленки с сульфадиазином серебра полианиона в виде альгината натрия, а также дополнительное включение в такой комплекс дигидроандростерона показало, что покрытие очищенных раневых поверхностей такими пленками создавало бактериостатический и бактерицидный эффекты, формировало защитный барьер для суперинфекции, сокращало временной интервал образования грануляционной ткани и площадь раневого дефекта [6б].
Введение хитозана в организм подтверждает механизмы распределения его по результатам in vitro прежде всего в элементах соединительной ткани. Хитозан быстро вступает в контакт с гликозаминогликанами, в том числе в хондроитинсульфатами и гиалуроновой кислотой, при образовании полиэлектролитного комплекса ускоряется
заживление ран, клеточное восстановление для кожи и суставов [51]. Взаимодействие происходит между ЫИз-группами хитозана и СОО" - и (или) SO4"2 - группами гликозаминогликанов. Такие взаимодействия протекают строго с образованием в ряде случаев депротонированных карбоксильных групп (рН-метрия, кондуктометрия, инфракрасная спектрометрия). При этом совместимость меток соединительной ткани (хондроциты, кератиноциты, фибробласты) очень высокая. Результаты in vitro и in vivo (крысы) подтверждают эти находки.
Современные раневые хитозановые покрытия могут сочетать в себе несколько слоев с различной функциональной нагрузкой. Если ожоговую рану покрыть непосредственно гелевым раствором (или пеной) ацетата хитозана с включенными в него антибактериальными препаратами, а на первое покрытие нанести слой карбоксиметилхитина, то будет достигнут длительный (в течение 24 часов) антибактериальный импрегнирующий эффект, перевязочная композиция высоко биосовместима и не прилипает к тканям. Верхний гидрогель - это барьер для суперинфекции и механическая защита. Это зона абсорбции обильного раневого экссудата (в физиологической жидкости гидрогель карбоксиметилхитина способен поглощать количество воды в 4 раза больше, чем вес самого полимера, имеет поры высокой степени проницаемости для воды), что характерно для ожоговых ран II степени. Нижний слой - это высокая антибактериальная активность. Даже при отсутствии антибактериальных препаратов в хитозановом полимере такое двухслойное покрытие на ране высоко активно против Ps. aeruginosa и S. aureus [76].
Таким образом, возможности широкой непосредственной модификации хитозана как базового полимера, так и с помощью различных лекарственных субстанций позволяют получать неограниченно большой арсенал соединений, которые могут быть использованы в управлении острых и хронических воспалительных процессов в коже и других тканях.
5. Использование хитозана в получении искусственного аналога кожи человека.
Г ибель значительных по площади кожных покровов в результате ожогов или забор этих тканей для аутотрансплантации всегда может являться непосредственной причиной инфекции и суперинфекции, потери белков, электролитов, воды плазмы, формирования извращенного анархического пути восстановления клеток и межуточного матрикса. Известно, что при глубоких ожогах необходимо как можно раньше восстановить непроницаемый кожный барьер. Аллографты дороги и не обеспечивают эффективного покрытия, так как часто отторгаются, дополнительно травмируя пациента. Стандартная методика аутопересадки возможна лишь при ограниченных размерах ожога. Прогресс в интенсивной терапии обожженных больных сделал возможным спасение их с ожогами 80% кожной поверхности. В результате резко возросла необходимость в коже или ее искусственных эквивалентах, что стимулировало многочисленные исследования в этом направлении. Первой серьезной работой по использованию искусственного кожного эквивалента можно считать исследование Yannas с соавторами [122]. Искусственная кожа, предложенная этими авторами, включает два слоя - дермальный эквивалент, представляющий собой бычий коллаген, и гликозаминогликан (ГАГ)-хонд-роитин-б-сульфат, поперечносшитые глутаровым альдегидом. В качестве временного псевдоэпидермиса использована небиодеградабельная силиконовая пленка, ограничивающая экссудативные потери в ранних фазах ожоговой болезни и являющаяся барьером для инфекционных агентов. Такая искусственная кожа наносилась на участки, обнажившиеся после удаления некротизированных тканей при ожогах III степени (через 48-72 часа после травмы). Комплекс коллаген - ГАГ имеет поры, через которые прорастает эндогенная неодерма. Таким образом, восстановление дермы и синтез коллагена фиброб-ластами происходит упорядоченно, без формирования избыточных грануляций и грубого рубца. После реваскуляризации дермального слоя и восстановления эпидермиса силиконовая мембрана удаляется. Время деградации искусственной кожи соответствует времени заживления раны (около 24 дней). В то же время предложенное покрытие имеет недостатки - композиция малоустойчива, растворима в биологических жидкостях и требует поперечной химической сшивки. Силиконовый псевдоэпидермис не
биодеградабелен, а следовательно, требует его хирургического удаления. Полисахаридная структура природных полимеров (хитин-хитозаны), высокая биосовместимость и биодеградабельность в животных тканях, образование поликатионно-полианионных связей с коллагенами, хондроитинсульфатом и гиалуронатом создают стратегические возможности получения искусственной кожи и применения полученных продуктов с целью трансплантации. Кроме того, известно, что собственно гликозаминогликаны играют главную роль в клеточной адгезии и контактах, дифференцировке и морфогенезе. Близость химической структуры дермальных гликозаминогликанов к хитозану определяет логику применения этих полиионов в реконструкции кожи [55].
Моделирование взаимоотношений клеток и основного вещества кожи может быть продемонстрировано в системе двух изолированных камер, разделенных ультрафильтрационной мембраной. Если в одну камеру внести питательную среду, а во вторую камеру клетки, коллаген и хитозан, то во второй камере при формировании геля в условиях культивирования и в результате жизнедеятельности клеток будут неосинтезированы белковые структуры (например, протеин С). При этом низкомолекулярные метаболиты будут транспортироваться в первую камеру и накапливаться в питательной среде [105]. Соотношение низко- и высокомолекулярных веществ в камерах можно целенаправленно изменять, если в них помещать разное количественное содержание клеток или компонентов среды. Важным следствием подобных научных работ явились опыты по реконструкции дермального и эпидермального эквивалентов. Shahabeddin L. et al. (1990) использовали для биоинженерии дермального слоя бесклеточный дермальный субстрат, выработанный фибробластами крайней плоти. Этот субстрат содержал коллагены I и IV типов, гликозаминогликаны, сшитые с помощью спейсера с хитозаном. Введение в пористую структуру такого комплекса человеческих фибробластов обеспечивало не только их жизнеспособность, но и рост и размножение с формированием достаточно полноценной клеточной подложки, в частности для кератиноцитов [108]. Для реконструкции эпидермального эквивалента авторы применили регенерированный эпидермис из нормальных кератиноцитов человека. Внесение на дермальный комплекс эпидермального эквивалента заканчивалось быстрым прикреплением клеток, проявлением их мито-тической активности с образованием межуточного эпидермального матрикса и слоев эпидермоцитов. Г истологические срезы ткани после двухнедельного культивирования показали наличие базального слоя с кубовидными клетками, прикрепленными к дермальному эквиваленту, формирование нескольких супрабазальных клеточных слоев, включающих и роговой слой. В местах соединения дермы и эпидермиса выявляются плотные клеточные мембраны - полудесмосомы. В гребешковом (шиповатом) слое эпидермиса - наличие липидных шариков, а в зернистом слое - кератогиалиновых шариков. Дифференцировка эпидермиса окончательно завершалась формированием рогового слоя, содержащего несколько пластов корнеоцитов, наполненных тонофиламентами (анализ трансмиссионной электронной микроскопии). Таким образом, реконструированная кожа на основе хи-тозан-коллаген-гликозаминогликановой матрицы морфологически эквивалентна нормальной коже человека и может быть применена для восстановления кожных дефектов при ожогах. Детальный иммунопатологический анализ фибробластной решетки, содержащей хитозан с перекрестно сшитым коллаген-гликозаминогликановым комплексом, показал, что в эпидермально-дермальной зоне искусственной кожи присутствует большинство присущих этой ткани белков. В случае отсутствия в этом каркасе человеческих фибробластов при культивировании формируется эпителий с дезорганизацией клеточного слоя, маркеры дифференцировки расположены хаотично, их экспрессия может полностью отсутствовать [101]. Установлено, что присутствие фибробластов весьма важно для формирования базального белкового слоя, а также компактного соединения между дермальным эквивалентом и реконструированным эпидермисом [42]. Вблизи же кератиноцитов большинство межуточных ингредиентов может полностью не зависеть от присутствия фибробластов. Внесение в полиэлектролитный комплекс молочного протеина стимулировало образование коллагена и гликозаминогликанов. Такой
неосинтез контролид ровался содержанием пролина, глюкозамина и включениями сернокислого натрия. Дермальные поры матрикса засевались клетками более плотно, чем в контроле. Синтез гиалуроновой кислоты возрастал на 46%, а сульфатированный гликозаминогликан - на 53%. При этом уровень общего белка возрастал незначительно [35]. При выращивании искусственной кожи возможно формирование ткани в виде хитозан-гликозаминогликан-коллагеновой губки как трехмерной структуры. Контроль общего белка, синтез коллагена во времени, рост и миграция фибробластов, степень денатурации и растворение, вес и величина губки указывают на стабильность системы при ионных взаимоотношениях различных компонентов. Сокращение размеров губки на 20% после 6 недель культивирования, увеличение ее веса на 10%, высокий клеточный рост (в три раза) подтверждают, что ткань жизнеспособна. Новосинтезированный коллаген составляет через 6 недель 60% от общего количества. В чистом коллагеновом геле (без хитозана) образование новых порций белка составляет 30%. Подобные результаты могут быть получены при использовании слабосшитого дифенилфосфарилазид-коллагена. Эти результаты подтверждают, что такие комплексы являются отличной подложкой, для размножения фибробластов и образования дермально-эпи-дермального эквиваллента [38]. Анализ новообразования эластической ткани (определение иммуногистохимическим методом представителя микрофибрилл -фибриллина и представителя эластических волокон в коже -эластина-белка) показал, что в течение 2 месяцев культивирования фибробластной культуры в дермальном эквиваленте эластин не определялся, а фибриллин был слабо выражен,
микрофибриллы были редкими элементами (трансмиссионная электронная микроскопия). И только внесение в ситему эпидермоцитов запускало синтезы фи-бриллина-1 и эластина на 15-й день эпидермизации и формировало механизм образования эластической сети в дерме на микрофибриллярной структуре [54]. При условии искусственого внесения в полиэлектролитную фибробластную решетку культуры эндотелиальных клеток установлено, что в процессе культивирования такого эндотелизированного матрикса происходит формирование капилляроподобных
трубочковых структур, морфологически соответствующих микрососудам [42]. Такие культивированные дермально-эпидермальные эквиваленты, содержащие коллагены I и III типов, связанные ковалентно с хитозаном и гликозаминогликанами, были трансплантированы «nude» мышам. Через 7 и 14 суток после трансплантации
констатирована колонизация эпидермоцитов, структура, схожая с нормальной кожей. Главными трудностями использования кожного эквивалента являются
технологии извлечения цельной искусственной кожи из питательных растворов [41]. Подобные исследования проводились на кроликах и морских свинках, которым на кожные дефекты трансплантировались хитозановые, полиэтилуретано-вые и поливинилалкогольные пленки как прототипы искусственной кожи [63]. В технологии получения искусственной кожи существенным вопросом является выявление механизмов взаимодействия хитозанов с коллагенами. Известно, что при смешивании через спейсер или без такового гелей хитозана и коллагена последний начинает полимеризоваться, и образуется полианион-поликатионовый комплекс (инфракрасная и циркулярная спектрофотометрия, дифференциальная сканирующая калориметрия). На этой стадии связывания вязкость коллагена резко увеличивается, он денатурирует. Избыток хитозана дает начало второму механизму взаимодействия, приводящему к дальнейшей денатурации коллагена [113]. Имеет значение доля хитозана в таких комплексах. При пассивном смешивании высокомолекулярного полностью деацетилированного хитозана с бычьим коллагеном образуются комплексы, основанные только на электростатических взаимодействиях или водородных связях. Максимальная активность хитозана проявляется при содержании его в комплексе около 10% (коллаген - 90%) [112]. Ультрафиолетовое облучение кератиноцитов, введенных в коллаген-гликозаминогликан-хитозановую матрицу, показало, что полимер хитозан в зависимости от процентного содержания в матрице способен оказывать фо-топротективный эффект и существенно повышать жизнеспособность расселяющихся клеток (окраска 4,5-диме-тилтиозол-2,5-дифенилтетразолий бромидом) [34, 35]. Само по себе соединение хитозана с гиалуроновой кислотой существенно влияет на величину адгезии к слою эндотелиальных клеток и повышает пенетрацию хитозана
через эндотелий [75]. Исследователи из НИИ физико-химической медицины МЗ РФ в 1996 году впервые предложили композицию бычьего коллагена и хитозана, включающую Тактивин (Кулаев Д.В. с соавт). Подобная комбинация коллагена и хитозана была уже успешно использована группой Ковид! в 1983 году [118]. Мембраны, полученные этими учеными, были проницаемы, набухали в водных растворах, но были слишком жестки и неустойчивы, требовали дополнительной поперечной химической сшивки через спейсер. Предлагаемая группой Д.В. Кулаева композиция искусственной кожи существенно отличается от технического решения группы Ковид!. Включение в гель коллагена геля хитозана ускоряет заживление вследствие способности дериватов хитина стимулировать клетки воспалительного ряда. Хорошо известно, что макрофаг является центральной фигурой процесса заживления. Стимуляция макрофагов хитин-хитозаном индуцирует продукцию ряда важных цитокинов, ускоряет пролиферацию фибробластов и синтез коллагена [91]. Ускоренный рост в среде с хитозаном доказан в культуре миоцитов [79] и почечных клеток [120]. Хитин, хитозан и их производные используются как самостоятельно в виде водных растворов водорастворимых производных, так и в составе сложных композиций - мазей, повязок и мембран для покрытия ран [65]. Нерастворимые коллагены широко используются в качестве подложки в клеточной культуре. Растворимые коллагены используются для покрытия сосудов, в которых культивируются ткани с последующей поперечной химической сшивкой или без таковой. Коллагеновое покрытие можно стерилизовать нагреванием или радиацией. Такие коллагеновые покрытия могут быть использованы для культивации:
а) дифференцированных клеток (лимфоцитов, макрофагов, хондроцитов, эндоте-лиоцитов, нервных клеток и пр.);
б) эмбриональных клеток (фертилизированные овоциты млекопитающих);
в) линий злокачественно перерожденных клеток (мелкоклеточного рака легкого, рака яичника, аденокарциномы молочной железы).
В медицине коллагены используются как гемостатические губки, шовный материал и, главным образом, как компонент новейших покрытий и перевязочных средств. Легко совместимый с тканями человека, биодеградабельный, поддающийся стерилизации коллаген стал необходимым компонентом всех композиций, применяемых для закрытия кожных дефектов [31,48,68,84,119,121]. Получение искусственной кожи в НИИ ФХМ МЗ РФ заключалось в следующем:
1. Очистка (растворение, фильтрование и переосаждение) хитозана (ТИБОХ);
2. Очистка (растворение, фильтрование и переосаждение) коллагена (НПП «КОПО»);
3. Модификация хитозана (введение активных функциональных групп);
4. Очистка модифицированного хитозана методами препаративной хроматографии и ультрафильтрации;
5. Смешивание хитозана и коллагена в нужных пропорциях, добавление присадок (иммуномодуляторы, консерванты, антибиотики, противоопухолевые препараты и пр.);
6. Стерилизация и розлив препарата в стерильную посуду [12].
Авторы осуществляли нанесение губки тимохитона на полнослойные кожные раны 15x15 мм у морских свинок массой 300 г. В контроле наносился на раны губчатый коллагеновый материал - колласпон. Оба материала обладали высокой сорбционной способностью и высокой скоростью смачивания. Контроль течения раневого процесса производился по срокам заживления и ряду клинических критериев (появление грануляций, эпителизации и др.) с помощью микробиологического, морфологического анализов. Анализ заживления производился на 3-й, 7-, 10- и 14-е сутки. Исследование биосовместимости осуществлялось в условиях имплантации губки толщиной 1 мм или пластинки толщиной 0,2 мм в подкожную клетчатку крысам линии W!вtar массой 150200 г с последующим гистологическим анализом имплантата вместе с капсулой. В качестве контроля выполнялась ложная операция. Исследование проведено в динамике на 7-, 10-, 14-, 22-, 26-, 35- и 45-е сутки после имплантации. Результаты исследований показали, что физико-химические и механические характеристики композиций зависят от соотношения высокомолекулярных компонентов системы и их заряда. Оптимальное соотношение хитозан (поликатион) : коллаген в композиции составляет
10:90, а карбоксиметилхитин (полианион) : коллаген - 50:50. Изучение влияния ионной силы растворов полимеров на свойства конечного продукта показывает, что в физиологических условиях среды образование ионного комплекса коллаген-хитозан не происходит. Образование ионного комплекса наблюдается при добавлении в систему сильной поликислоты-хондроитинсульфата. В отношении раневой адсорбции наилучшими характеристиками обладают порошок и губка. В таких композициях происходит существенное впитывание раневого секрета, практическое сохранение активности физиологических веществ, препараты могут длительно храниться. Включенные в коллаген-хитозановое покрытие иммуностимуляторы (Тактивин) не теряют свою активность в интервале рН среды 6-8. Максимум сорбционной зависимости по крови у губок толщиной 1-2 мм составлял 2,5-З,5 часа (полное смачивание кровью Комбутека происходит за 5-10 мин.). Сорбционная способность тимохитона составляет 30-50 г биологического секрета на 1 г препарата (показатель для колоспона равен 20-30 г/г). Увлажнение губчатой или порошковой композиции раневым секретом не приводит к потере их структурной прочности, пластичности, упругости, снижению парообмена в ране [12]. Воздухопроницаемость образцов составляла 25-30 дм3/мг сек. Нанесение опытных образцов на полнослойные линейные раны у морских свинок показало, что на 3-й сутки характерен воспалительно-регенераторный тип цитограммы раны, отмечено значительное содержание полибластов, макрофагов и фибробластов на фоне небольшого количества сохранных нейтрофилов. Это указывает на слабую выраженность воспалительной компоненты процесса. У большинства животных на 5-е сутки раневого процесса количество раневых макрофагов составляло до 10%, а фибробласты превалировали и составляли до 18-20% клеточного состава. Такая цитограмма может быть отнесена к регенераторно-воспалительному типу. На 7-е сутки наблюдения фибробластный состав раны
составлял уже 30% (регенераторная направленность процесса). На 10-14-е сутки наблюдения характерно появление молодых клеток плоского эпителия. Коллагеновые волокна тонкие и ясно верифицируются.
При морфологическом анализе подкожных имплантатов установлено, что на 7-е сутки имплант представлял собой набухшую, уплотненную, импрегнированную кровью пластину. Картина начальной фрагментации пластины на крупные глыбки и структуры, напоминающие волокна. Структура материала сохранена, так как фуксинофильна. Вокруг каждого фрагмента - воспалительная инфильтрация. В клеточном составе преобладают лимфоциты, в значительном количестве полиморфонуклеарные лейкоциты. На 10-е сутки - незначительное уменьшение пластины, имплант хрящевидной структуры. При микроскопии - фрагменты коллагена, сохраняющие прежнее очертание глыбок и волокон, они фуксинофильны. Сохранена клеточная инфильтрация лимфоцитами и ПМЯ лейкоцитами. Усилена картина пролиферации фибробластов, начало формирования соединительнотканной капсулы. На 14-е сутки -дальнейшее уменьшение размеров импланта, материал остается плотным. В клеточном составе - преобладание лимфоцитов. Структура коллагеновых волокон сохранена. На 22-е сутки имплантации пластина фрагментирована на крупные глыбки и волокна, структура их сохранена, вокруг фрагментов - инфильтрат из лимфоцитов, макрофагов и гистиоцитов. На 26-е сутки имплантации - имплант в виде мелких глыбок без сохранения своей структуры. Г ранулемы состоят из большого числа макрофагов, гигантских клеток «инородных тел», лимфоцитов. Воспаление отсутствует. Вокруг импланта - тонкая соединительнотканная капсула. На 35-е сутки послеоперационого периода коллагеновые фрагменты не наблюдаются. Среди гранулем инородных тел -остатки биодеградирующего коллагена. Гранулемы инородных тел мелкие, в их составе фибробласты, зрелые коллагеновые волокна. Общая капсула импланта, тон™ ко инфильтрированная лимфоцитами, прослеживается только на отдельных участках. На 45-е сутки наблюдения фиксируются гранулемы инородных тел. В их составе мелкие глыбки - остатки коллагена. Г ранулемы представлены фибробластами коллагеновых волокон, окружены тонкой соединительнотканной капсулой. Подобная морфологическая картина во времени имеет место и при имплантации колласпона, но фрагментация импланта увеличена до 80 суток. Микробиологический анализ раневых
дефектов обнаруживает присутствие Staph. Epidermidis, отсутствие развития патогенной микрофлоры. Таким образом, авторы получили модель перспективных материалов в качестве человеческих кожных эквивалентов, обладающих хорошей защитой раневой поверхности от высыхания и потери плазмы крови, препятствующих развитию патогенной микрофлоры, адсорбирующих раневое отделяемое, стимулирующих пролиферацию клеточных элементов, препятствующих формированию грубых келлоидных рубцов.
