CC BY
38
Фауна, морфология, систематика паразитов
УДК 619:576.895.132
РЕЗУЛЬТАТЫ СРАВНИТЕЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ СПЕЙСЕРНЫХ УЧАСТКОВ РИБОСОМАЛЬНОЙ ДНК TELADORSAGIA CIRCUMCINCTA И T. TRIFURCATA (NEMATODA: OSTERTAGIINAE)
Д.Н. КУЗНЕЦОВ кандидат биологических наук
Центр паразитологии Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН
Исследованы фрагменты второго внутреннего транскрибирующего спейсера (ITS-2) рибосомаль-ной ДНК Teladorsagia circumcincta и T. trifurcata, предположительно являющихся разными морфологическими вариантами одного вида. Длина изученных фрагментов составила 275 пар оснований. Различия, обнаруженные в строении нуклеотид-ных последовательностей ITS-2 T. circumcincta и T. trifurcata, нельзя считать существенными. Уровень расхождения консенсусных нуклеотидных последовательностей ITS-2 T. circumcincta и T. tri-furcata составил 1,8 %, что не превысило уровня различий между отдельными экземплярами T. cir-cumcincta. В то же время, степень различия по участку ITS-2 между T. circumcincta и представителями других таксонов надсемейства Trichostron-gyloidea оказалась существенно выше: различия между T. circumcincta и O. ostertagi составили 15,9 %, между T. circumcincta и T. colubriformis - 20,2 %. Полученные результаты подтверждают, что T. cir-cumcincta и T. trifurcata представляют собой разные морфологические варианты одного вида.
Ключевые слова: молекулярная таксономия нематод, Teladorsagia circumcincta, Teladorsagia trifurcata, рибосомальная ДНК, ITS-2, полиморфизм.
Нематоды Teladorsagia circumcincta (Stadelman, 1894) и T. trifurcata (Ransom, 1907) - широко распространенные паразиты жвачных. Локализуются эти нематоды в сычуге, в ряде случаев их обнаруживают и в тонкой кишке. Интенсивность инвазии может достигать нескольких тысяч экземпляров [2].
В соответствии с гипотезой полиморфизма, у некоторых видов подсемейства Ostertagiinae Lopez-Neyra, 1947 имеются морфологически различные самцы - минорные и мажорные морфы [9, 10]. Основанием для этого предположения послужило наблюдение, что некоторые формы самцов, как правило, малочисленные, встречаются только в паре с самцами другой, доминирующей по количеству особей, формы. При использовании лишь морфологических критериев классификации мажорные и минорные морфы считали самостоятельными видами и обычно относили к разным родам из-за существенных различий в строении спикул и полового конуса. Например, к роду Skrja-binagia (Kassimov, 1942) были причислены Ostertagia lyrata Sjoberg, 1926 -предполагаемый минорный морф O. ostertagi (Stiles, 1892) [1, 8] и Ostertagia
arctica Mizkewitsch, 1929 - предполагаемый минорный морф O. gruehneri Skrjabin, 1929 [8].
J. Drozdz (1995) считает, что полиморфизм характерен для девятнадцати видов остертагиин [10]. В некоторых случаях конспецифичность (принадлежность к одному виду) морфологически различных самцов была подтверждена опытами по перекрестному заражению [5, 9, 14].
Вопросы полиморфизма остертагиин изучают и с применением методов молекулярной таксономии. Так, в результате исследования участков ITS-1 и ITS-2 (первого и второго внутренних транскрибирующих спейсеров) рибосо-мальной ДНК O. gruehneri и O. arctica не было выявлено четких различий, что подтверждает предположение о принадлежности O. gruehneri и O. arctica к одному виду [6]. Аналогичные результаты были получены при изучении ITS-1 и ITS-2 Marshallagia marshalli Ransom, 1907 и M. occidentals Ransom, 1907 [7], Spiculopteragia asymmetrica (Ware, 1925) и S. quadrispiculata (Jansen, 1958) [12]. У O. ostertagi и O. lyrata были изучены участки ITS-1 рибосомаль-ной ДНК и участки COX-1 митохондриальной ДНК, полученные данные также говорят в пользу конспецифичности O. ostertagi и O. lyrata [15].
L. Stevenson et al. (1996) провели сравнительное исследование участков ITS-2 T. circumcincta и T. trifurcata на материале от овец из Австралии, Германии, Китая и Шотландии и, не выявив существенных различий, пришли к выводу, что T. circumcincta и T. trifurcata принадлежат к одному виду.
Для повышения объективности ДНК-исследований необходимо пополнение имеющихся данных, в том числе за счет сравнительного изучения образцов ДНК нематод одного вида из разных регионов и от разных хозяев. Такое сравнение позволит выявить степень внутривидовой изменчивости участков ДНК, а в прикладном аспекте повысит эффективность применения молекулярных методик для определения таксономической принадлежности паразитических нематод. Нашей задачей было сравнительное изучение ITS-2 T. circumcincta и T. trifurcata на материале от коз из России с целью дополнения данных о строении этого участка рибосомальной ДНК и проверки конспеци-фичности T. circumcincta и T. trifurcata.
Материалы и методы
Самцов T. circumcincta и T. trifurcata собирали при гельминтологическом вскрытии козы из Кировской области. Было исследовано 4 экз. самцов T. circumcincta и 2 экз. T. trifurcata. Кроме того, были исследованы 3 самца Tricho-strongylus colubriformis от козы из Восточной Монголии. Полученные данные о строении участка ITS-2 T. colubriformis были использованы для сравнения T. colubriformis и T. circumcincta. В сравнительном аспекте также были использованы результаты наших исследований ITS-2 3 экз. самцов O. ostertagi от бизона из Приокско-Террасного государственного природного биосферного заповедника (Московская область).
Образцы нематод хранили в 70%-ном этаноле, их таксономическую принадлежность определяли по комплексу морфологических признаков [3, 4].
Отдельно из каждой особи нематод была выделена ДНК по методике J.F. Dallas et al. [6] с небольшими изменениями. Нематоду помещали в 100 мкл лизирующего буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl, 0,1 мМ ЭДТА (pH 8,0) и 20 мкг/мл протеиназы К. Образцы инкубировали в твердотельном термостате в течение 18 ч при 55 оС, затем нагревали до 95 оС и выдерживали при такой температуре 10 мин [6]. Выделенную ДНК хранили при - 20 оС.
Фрагменты ITS-2 рибосомальной ДНК были получены в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров NC 1 и NC 2 [11]. ПЦР проводили по следующей схеме: 1 этап - денатурация ДНК при 90 оС в течение 2 мин, 2 этап - денатурация ДНК при 90 оС 15 с, 3 этап - отжиг прайме-ров при 55 оС 15 с, 4 этап - элонгация цепи при 72 оС 30 с, 5 этап - элонгация цепи при 72 оС 5 мин. Этапы со 2 по 4 повторялись циклически 30 раз.
Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant.
Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с использованием пакета компьютерных программ DNAstar™, выравнивание и сравнение сиквенсов - с использованием метода Clustal W.
Результаты и обсуждение
Из каждого исследованного образца нематод T. circumcincta и T. trifurcata были получены фрагменты ITS-2 длиной 275 пар оснований.
При сравнении между собой нуклеотидных последовательностей участка ITS-2 четырех образцов T. circumcincta обнаружен вариабельный участок с 37 по 41 нуклеотид (рис. 1), в рамках которого отмечены 4 замены оснований. Кроме того, отмечены точечные замены оснований: в 81 позиции у одного из исследованных образцов и в 118 позиции - у другого образца. При попарном сравнении четырех исследованных образцов ITS-2 T. circumcincta различия между ними составили от 0,7 до 1,8 %.
Сопоставление нуклеотидных последовательностей ITS-2 двух исследованных образцов T. trifurcata обнаружило различия лишь по одному нуклео-тиду - в позиции 41 (рис. 2). В процентном отношении различия в сиквенсах между двумя изученными образцами T. trifurcata составили 0,4 %.
При сравнении консенсусных (построенных на основании обобщения данных обо всех изученных образцах) сиквенсов ITS-2 T. circumcincta и T. trifurcata установлены различия в общей сложности лишь по пяти нуклеотидам (рис. 3), что составляет 1,8 %. Один вариабельный участок образован тремя нуклеотида-ми подряд, и еще в двух позициях имеются замены по одному нуклеотиду.
Так как уровень различий нуклеотидных последовательностей участков ITS-2 T. circumcincta и T. trifurcata не превысил уровня различий между образцами T. circumcincta, можно заключить, что все обнаруженные различия являются только внутривидовыми. Следовательно, T. circumcincta и T. trifur-cata - мажорный и минорный морфы одного вида.
Показательно, что обнаруженный при сравнении консенсусных сиквен-сов T. circumcincta и T. trifurcata вариабельный участок с 37 по 39 нуклеотид (рис. 3) фактически соответствует вариабельному участку с 37 по 41 нуклео-тид, зарегистрированному при сравнении четырех образцов T. circumcincta (рис. 1). Причем, так же как у образцов T. trifurcata, у T. circumcincta на этом участке присутствует цитозиновое основание - у двух образцов в позиции 37 и у одного - в позиции 39. В позиции 41, как у T. circumcincta, так и у T. trifurcata, находится либо адениновое, либо гуаниновое основание. Таким образом, наличие этого вариабельного участка является скорее чертой сходства, а не различия ITS-2 T. circumcincta и T. trifurcata.
Степень различия по участку ITS-2 между T. circumcincta и представителями других таксонов надсемейства Trichostrongyloidea оказалась существенно выше: различия между T. circumcincta и O. ostertagi составили 15,9 %, между T. circumcincta и T. colubriformis - 20,2 % (рис. 4).
Наши результаты позволяют подтвердить и дополнить данные L. Stevenson et al. [13], не обнаруживших существенных различий в строении ITS-2 четырех образцов T. circumcincta от овец из Австралии, Германии, Китая и Шотландии и одного образца T. trifurcata от овец из Германии. Следует отметить, что эти авторы исследовали фрагменты ITS-2 несколько меньшей длины - 246 пар оснований.
Российский паразитологический журнал, 2009, № 2
с1гситс1пс1а с!гситс!псЬа с!гситс!псЬа с!гситс!псЬа
с!гситс!пс1а с!гситс!псЬа с!гситс!псЬа с!гситс!псЬа
с!гситс!пс1а с!гситс!псЬа с!гситс!псЬа с!гситс!псЬа
с1гситс1пс1а с!гситс!псЬа с!гситс!псЬа с!гситс!псЬа
с!гситс!пс1а с!гситс!псЬа с!гситс!псЬа с!гситс!псЬа
1 20 40 60 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|
СТАТАССТ9ТТТССС9ААТ99САТТТАТСАСТТТАТТ9ШАТААТТСССАТТТСА9ТТСА
......................................С.9...................
....................................СЫТ.9...................
....................................С.Т.....................
61 80 100 120 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|
А9ААТААСАТАТ9СААСАТ9АС9ТАС9АС99ТАТТАСС9ТС9ТААС9ТТССТ9ААТ9АТА ....................9.......................................
.........................................................9..
121 140 160 180 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|
Т9ААС9С9ТАТТ9СТАСТАТТТ9ААТ9ТАСТСААТ9ААТАТ9А9АТТ9АТТСА9АТА9А9
181 200 220 240 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|
АСАТ9ТАТ99ТААТАТАТ9ТТСААТ9ТАТСАТТТ9ТАТТ9СААССТ9А9СТСА99С9Т9А
241 260 280 |--------|---------|---------|---------|__
ТТАССС9СТ9ААСТТАА9САТАТСАТТТА9С99А9
300
Рис. 1. Нуклеотидные последовательности четырех образцов Т. агеитыпМа (направление от 5' до 3'- конца, точкой обозначены нуклеотидные основания, те же, что у Т. ыгеитапМа 1, N - отсутствие нуклеотида)
19
1 20 40 60 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|
Т. 1г1£игса1а 1 СТАТАССТ9ТТТССС9ААТ99САТТТАТСАСТТТАТССС99ТААТТСССАТТТСА9ТТСА Т. 1г1Гигса1а 2 ........................................А...................
Т. Т.
Т. Т.
61 80 100 120 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|
1г1Гигса1а 1 А9ААТААСАТАТ9СААСАТ9АС9ТАС9АС99ТАТТАСС9ТС9АААС9ТТССТ9ААТ9АТА 1гИигса1а 2 ............................................................
121 140 160 180 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|
1г1Гигса1а 1 Т9ААС9С9ТАТТ9СТАСТАТТТ9ААТ9ТАСТСААТ9ААТАТ9А9АТТ9АТТСА9АТА9А9 1гИигса1а 2 ............................................................
181 200 220 240 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|
1г1£игса1а 1 АСАТ9ТАТ99АААТАТАТ9ТТСААТ9ТАТСАТТТ9ТАТТ9СААССТ9А9СТСА99С9Т9А 1гИигса1а 2 ............................................................
241 260 280 300 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|
1г1Гигса1а 1 ТТАССС9СТ9ААСТТАА9САТАТСАТТТА9С99А9 1гИигса1а 2 ...................................
Рис. 2. Нуклеотидные последовательности двух образцов Т. М/игеМа (направление от 5' до 3'- конца, точкой обозначены нуклеотидные основания, те же, что у Т. М/игеа1а 1)
20
Российский паразитологический журнал, 2009, № 2
1 20 40 60 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|
Т. с1гситс1псЬа СТАТАССТ9ТТТССС9ААТ99САТТТАТСАСТТТАТУ9У9КТААТТСССАТТТСА9ТТСА Т. Ьг1£игса1а ....................................ССС.....................
61 80 100 120 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|
Т. с1гситс1псЬа А9ААТААСАТАТ9СААСАТ9АС9ТАС9АС99ТАТТАСС9ТС9ТААС9ТТССТ9ААТ9АТА Т. 1гИигса1а ..........................................А.................
121 140 160 180 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|
Т. с1гситс1псЬа Т9ААС9С9ТАТТ9СТАСТАТТТ9ААТ9ТАСТСААТ9ААТАТ9А9АТТ9АТТСА9АТА9А9 Т. 1гИигса1а ............................................................
181 200 220 240 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|
Т. с1гситс1псЬа АСАТ9ТАТ99ТААТАТАТ9ТТСААТ9ТАТСАТТТ9ТАТТ9СААССТ9А9СТСА99С9Т9А Т. 1гИигса1а ..........А.................................................
241 260 280 300 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|
Т. с1гситс1пс1а ТТАССС9СТ9ААСТТАА9САТАТСАТТТА9С99А9 Т. 1гИигса1а ...................................
Рис. 3. Сравнение консенсусных нуклеотидных последовательностей Т. агеитыпМа и Т. М/игеМа (направление от 5' до 3'- конца, точкой обозначены нуклеотидные основания, те же, что у Т. е1геите1пе(а; У - присутствие в этой позиции Т или С, Я- присутствие в этой позиции О или А
в разных образцах Т. еiгеumеinеta)
21
1 20 40 60 |--------|---------|---------|---------|---------|---------|
T. circumcincta CTATACCTGTTTCCCGAATGGCATTTATCACTTTATYGYGRTAATTCCCATTTCAGTTCA
O. ostertagi A..C.. TGTCCCGT.......T......T.......T.T.A...........C.......
T. colubriformis TCTCC.......GT.......TCA..G...AA.-..T.T.A.G.................
61 80 100 120 |--------|---------|---------|---------|---------|--------- |
T. circumcincta AGAATAACATATGCAACATGACGTACGACGGTATTACCGTCGTAACGTTCCTGAATGATA
O. ostertagi ......TG.A..............-TA..AT.G...-------------A..........
T. colubriformis .......T.C...........T..-TA.T.T.G.A.TGACAT...T.......T.....G
121 140 160 180 |--------|---------|---------|---------|---------|--------- |
T. circumcincta TGAACGCGTATTGCTACTATTTGAATGTACTCAATGAATATGAGATTGATTCAGATAGAG
O. ostertagi CTG.-ATA....A.C......................................A....G.
T. colubriformis ......T..--..T....G..............G.....T...........T.A.C.G.G
181 200 220 240 |--------|---------|---------|---------|---------|--------- |
T. circumcincta ACATGTATGGTAATATATGTTCAATGTATCATTTGTAT--TGCAACCTGAGCTCAGGCGT
O. ostertagi ............T.G...A...................AT..........A.........
T. colubriformis ........AAC....-.........-...........—T..........A.........
241 260 280 300 |--------|---------|---------|---------|---------|--------- |
T. circumcincta GATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCATTTAGCGGAG
O. ostertagi .....................................
T. colubriformis ...........................C.........
Рис. 4. Сравнение консенсусных нуклеотидных последовательностей T. circumcincta, O. ostertagi и T. colubriformis (направление от 5' до 3' - конца, точкой обозначены нуклеотидные основания, те же, что у T. circumcincta; Y - присутствие в этой позиции T или C, R - присутствие в этой позиции G или A в разных образцах T. circumcincta)
22
Российский паразитологический журнал, 2009, № 2
В заключение следует отметить необходимость дальнейших исследований T. circumcincta методами молекулярной таксономии. В частности, актуальной задачей является изучение других таксономически значимых участков ДНК этой нематоды, учет влияния на их вариабельность гостальных и географических факторов, а также проверка, на основе сочетания морфологических и молекулярных методик, правомерности выделения Teladorsagia davtiani Andreeva et Satubaldin, 1954 в качестве второго минорного морфа T. circumcincta.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 07-04-90005, 08-0400191, 08-04-00209 и гранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ НШ-5410.2008.4. Секвенирование ДНК проводили в Межинститутском Центре коллектив-ного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН, организованном при поддержке РФФИ (грант 00-04-55000).
Автор благодарит за большую помощь в сборе и обработке материала О.В. Масленникову (Вятская ГСХА), Н.В. Есаулову и А.П. Аксенова (МГАВМиБ), АС. Москвина (ВИГИС), Н.В. Требоганову (Приокско-Тер-расный ГПБЗ), Н.А. Кузнецову (ИМБ РАН), а также руководство Совместной Российско-Монгольской комплексной биологической экспедиции РАН и АНМ.
Литература
1. Андреева Н.К. // Тр. ин-та вет. Казахского филиала ВАСХНИЛ. - 1957. - Т. 8. - С.473-487.
2. Асадов С.М. Гельминтофауна жвачных животных СССР и ее эколого-географический анализ. - Баку: Изд. АН АзССР, 1960. - 511 с.
3. Ивашкин В.М., Орипов А.О., Сонин М.Д. Определитель гельминтов мелкого рогатого скота. - М.: Наука, 1989. - С. 211-217.
4. Кузнецов Д.Н. // Тр. Всерос. ин-та гельминтологии. - 2006. - Т. 43. -С.271-278.
5. DaskalovP. // Helminthological Abstracts. - 1974. - V. 44. - P. 494.
6. Dallas J.F. et al.// Int. J. Parasitol. - 2000. - V. 30, № 5. - P. 655-658.
7. Dallas J.F. et al. // Int. J. Parasitol. - 2001. - V. 50, № 2. - P. 101-103.
8. Drozdz J. // Acta Parasitol. Polonica. - 1965. - V. 13, № 44. - P. 445-481.
9. Drozdz J. // Third Int. Congr. Parasitol. - 1974. - V. 1. - P. 477-478.
10. Drozdz J. // Syst. Parasitol. - 1995. - V. 32 (2). - P. 91-99.
11. Gasser R.B. et al. // Nucl. Asids Res. - 1993. - V. 21. - P. 2525-2526.
12. Santin-Duran M. et al. // J. Parasitol. - 2002. - V. 88 (2). - P. 417-418.
13. Stevenson L.A. et al. // Int. J. Parasitol. - 1996. - V. 26 (10). - P. 1123-1126.
14. Suarez V.N., Cabaret J. // J. Parasitol. - 1992. - V. 78 (3). - P. 402-405.
15. Zarlenga D.S., Hoberg E.P., Stringfellow F., Lichtenfels J.R. // J. Parasitol. - 1998. - V. 84 (4). - P. 806-812.
Comparative study of spacer rDNA domains of Teladorsagia circumcincta and T. trifurcata (Nematoda: Ostertagiinae)
D.N. Kuznetsov
Partial sequences of the second internal transcribed spacer (ITS-2) rDNA of Teladorsagia circumcincta and T. trifurcata, which are supposedly constitute two morphologically distinct variants of a single species, were investigated. The length of the sequences was 275 b.p. The 1,8 % level of difference discovered between the ITS-2 sequences of T. circumcincta and T. trifurcata did not exceed it in samples taken from the T. circumcincta morph. At the same time, the ITS-2 difference level was substantially higher among T. circumcincta and other Trichostrongyloidea species. The level of difference was 15,9 % between T. circumcincta and O. ostertagi, and 20,2 % between T. circumcincta and T. colubriformis. Obtained data confirm that T. circumcincta and T. trifurcata are morphologically distinct variants of a single species.
