Результаты секвенирования гена UGT1A1 у лиц с фенотипом синдрома Жильбера Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 616.36-008.51-056.7-07:575.21:57.088.7 https://doi.org/10.20538/1682-0363-2024-2-65-73

Результаты секвенирования гена UGT1A1 у лиц с фенотипом синдрома Жильбера

Иванова А.А. 1, Апарцева Н.Е. 1, Каширина А.П. 1, Немцова Е.Г. 2, Иванова Ю.В. 1, Кручинина М.В. 1, Курилович С.А. 1, Максимов В.Н. 1

1 Научно-исследовательский институт терапии и профилактической медицины - филиал Федерального исследовательского центра «Институт цитологии и генетики» Сибирского отделения Российской академии наук (НИИТПМ - филиал ИЦиГ СО РАН)

Россия, 630089, г. Новосибирск, ул. Б. Богаткова, 175/1

2 Северо-Западный государственный медицинский университет (СЗГМУ) им. И.И. Мечникова Россия, 191015, г. Санкт-Петербург, ул. Кирочная, 41

РЕЗЮМЕ

Цель. Оценка эффективности прямого автоматического секвенирования гена UGT1A1 для поиска мутаций у пациентов с фенотипом синдрома Жильбера.

Материалы и методы. Проведено прямое автоматическое секвенирование по Сэнгеру экзонов и части промотора гена UGT1A1 для 24 человек с непрямой гипербилирубинемией, у которых были исключены все другие ее причины, кроме генетических, и сделан ДНК-анализ на определение количества ТА-повторов в промоторе гена UGT1A1 (rs3064744). Распределение генотипов rs3064744 в группе: пять человек - генотип 7ТА/7ТА, пять человек - генотип 6ТА/6ТА, 12 человек - генотип 6ТА/7ТА, один человек - генотип 5ТА/7ТА, один человек - генотип 6ТА/8ТА. ДНК выделена методом фенолхлороформной экстракции или экспресс-методами. Секвенирование выполнено методом капиллярного электрофореза на аппарате Hitachi 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

Результаты. Идентифицированы однонуклеотидные варианты неопределенной клинической значимости rs3755319 (у 21 человека) и rs28899472 (у трех человек с генотипом 7ТА/7ТА rs3064744) в промоторе гена UGT1A1, rs2125984650 в 1-м экзоне гена UGT1A1 (у одного человека с генотипом 5ТА/7ТА rs3064744). У двух лиц с генотипами 6ТА/7ТА rs3064744 выявлены варианты гена, которые являются патогенными и вероятно патогенными для синдрома Жильбера по данным некоторых источников (rs4148323, rs1273237448).

Заключение. Прямое автоматическое секвенирование по Сэнгеру гена UGT1A1 может быть следующим этапом ДНК-анализа после определения генотипа rs3064744 для лиц с генотипами 6ТА/6ТА, 6ТА/7ТА rs3064744 и подозрением на синдром Жильбера.

Ключевые слова: синдром Жильбера, ген UGT1A1, неконъюгированная гипербилирубинемия, секвениро-вание по Сэнгеру

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 2325-00062.

Соответствие принципам этики. Все пациенты подписали добровольное информированное согласие на молекулярно-генетический анализ. Исследование одобрено локально-этическим комитетом НИИТПМ -филиала ИЦиГ СО РАН (протокол № 4 от 14.02.2023).

Н Иванова Анастасия Андреевна, ivanova_a_a@mail.ru

Для цитирования: Иванова А.А., Апарцева Н.Е., Каширина А.П., Немцова Е.Г., Иванова Ю.В., Кручи-нина М.В., Курилович С.А., Максимов В.Н. Результаты секвенирования гена UGT1A1 у лиц с фенотипом синдрома Жильбера. Бюллетень сибирской медицины. 2024;23(2):65-73. https://doi.org/10.20538/1682-0363-2024-2-65-73.

Results of UGT1A1 gene sequencing in individuals with the Gilbert syndrome phenotype

Ivanova A.A.1, Apartseva N.E.1, Kashirina A.P.1, Nemcova E.G.2, Ivanova Ju.V.1, Kurilovich S.A.1, Kruchinina M.V.1, Maksimov V.N.1

1 Research Institute of Internal and Preventive Medicine - Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

175/1, B. Bogatkova Str., Novosibirsk, 630089, Russian Federation

2 North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov 41, Kirochnaya Str., Saint Petersburg, 191015, Russian Federation

ABSTRACT

Aim. To evaluate the effectiveness of automated Sanger sequencing of the UGT1A1 gene to search for pathogenic mutations in individuals with the Gilbert syndrome phenotype.

Materials and methods. Automated Sanger sequencing of exons and part of the promoter in the UGT1A1 gene was carried out for 24 people with unconjugated hyperbilirubinemia, in whom all other causes except for genetic ones were excluded and DNA analysis was performed to determine the number of TA repeats in the promoter of the UGT1A1 gene (rs3064744). Distribution of rs3064744 genotypes in the group was the following: 5 people -7TA/7TA genotype, 5 people - 6TA/6TA genotype, 12 people - 6TA/7TA genotype, 1 person - 5TA/7TA genotype, 1 person - 6TA/8TA genotype. DNA was isolated using phenol - chloroform extraction or express methods. The sequencing was performed by capillary electrophoresis on the Hitachi 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA).

Results. Single nucleotide variants of uncertain significance were identified: rs3755319 (in 21 people) and rs28899472 (in three people with the 7TA/7TA genotype of rs3064744) in the promoter of the UGT1A1 gene, rs2125984650 in the first exon of the UGT1A1 gene (in one person with the 5TA/7TA genotype of rs3064744). In two individuals with the 6TA/7TA genotype of rs3064744, gene variants were identified that were pathogenic or likely pathogenic for the Gilbert syndrome according to some sources (rs4148323, rs1273237448).

Conclusion. According to the results of the study, automated Sanger sequencing of the UGT1A1 gene may be the next stage of DNA analysis after determining the rs3064744 genotype for individuals with 6TA/6TA, 6TA/7TA rs3064744 genotypes and suspected Gilbert syndrome.

Keywords: Gilbert syndrome, UGT1A1 gene, unconjugated hyperbilirubinemia, Sanger sequencing

Conflict of interest. The authors declare the absence of obvious or potential conflict of interest related to the publication of this article.

Source of financing. The study was supported by the Russian Science Foundation Grant No. 23-25-00062.

Conformity with the principles of ethics. All patients signed an informed consent to molecular genetic testing. The study was approved by the local Ethics Committee at Research Institute of Internal and Preventive Medicine -Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (Protocol No. 4 of 14.02.2023).

For citation: Ivanova A.A., Apartseva N.E., Kashirina A.P., Nemcova E.G., Ivanova Ju.V., Kurilovich S.A., Kruchinina M.V., Maksimov V.N. Results of UGT1A1 gene sequencing in individuals with the Gilbert syndrome phenotype. Bulletin of Siberian Medicine. 2024;23(2):65-73. https://doi.org/10.20538/1682-0363-2024-2-65-73.

ВВЕДЕНИЕ

По данным проведенного нами исследования, у почти 35% лиц с фенотипом синдрома Жильбера (СЖ) и исключением других причин неконъюги-рованной гипербилирубинемии, кроме генетических, не удается найти частый вариант rs3064744 гена UGT1A1 (количество ТА-повторов в промоторе гена) в гомозиготном состоянии 7ТА/7ТА, который бы объяснил причину гипербилирубинемии у этих пациентов [1]. Для лиц с генотипами 6ТА/6ТА, 6ТА/7ТА варианта rs3064744 с неконъюгированной гипербилирубинемией и подозрением на СЖ следующим этапом молекулярно-генетической диагностики может стать проведение прямого автоматического секвенирования по Сэнгеру гена UGT1A1 для поиска вариантов гена, которые могут быть причиной развития СЖ.

Целью данного исследования является оценка эффективности прямого автоматического секвенирования по Сэнгеру гена UGT1A1 в отношении поиска патогенных мутаций у лиц с разными генотипами rs3064744 и фенотипом синдрома Жильбера.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Прямое автоматическое секвенирование экзонов и промотора гена UGT1A1 по Сэнгеру выполнено для 24 человек с непрямой гипербилирубинемией, у которых были исключены все другие ее причины, кроме генетических. Пациенты были обследованы и направлены на ДНК-анализ опытными врачами-га-

строэнтерологами в период с 2012 по 2023 г. Среди 24 человек у пяти обнаружен генотип 7ТА/7ТА rs3064744 (количество ТА повторов в промоторе) гена UGT1A1, у 12 - генотип 6ТА/7ТА rs3064744, у пяти - генотип 6ТА/6ТА rs3064744, у одного человека - редкий генотип 5ТА/7ТА rs3064744 и еще у одного - редкий генотип 6ТА/8ТА rs3064744. Характеристика пациентов представлена в табл. 1. Приведенные в таблице показатели концентрации общего и непрямого билирубина являются случайными, теми, с которыми пациент обратился к врачу, т. е. в течение жизни пациента могли быть зафиксированы большие цифры.

ДНК была выделена методом фенолхлороформ-ной экстракции или экспресс-методом (ПРОБА-РАПИД-ГЕНЕТИКА, ООО «ДНК-Технология», г. Москва). Условия проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) описаны в табл. 2. Температурный режим ПЦР включал в себя один цикл предварительного прогрева при температуре 95 °С в течение 5 мин и один завершающий цикл при температуре 72 °С в течение 7 мин. Для амплификации необходимого участка ДНК были использованы разработанные нами праймеры, а также праймеры, описанные в работах N. Abdellaoui и соавт., E. Costa и соавт. [2, 3]. Для амплификации 1-го экзона у носителей гетерозиготного генотипа по варианту rs3064744 (6ТА/7ТА, 5ТА/7ТА, 6ТА/8ТА) были использованы праймеры, исключающие зону варианта rs3064744 для улучшения качества прочтения при автоматическом секвенировании.

Таблица 1

Пациенты, включенные в исследование

№ Пол Возраст, лет Генотип rs3064744 Общий билирубин, мкмоль/л Непрямой билирубин, мкмоль/л Результаты секвенирования

Генотип rs28899472 Генотип rs3755319 Генотип rs2125984650 Генотип rs1273237448 Генотип rs4148323

394 мужской 32 7ТА/7ТА 56,4 47,0 СТ СС АА СС GG

386 женский 50 7ТА/7ТА 48,0 42,0 СТ СС АА СС GG

301 мужской 57 7ТА/7ТА 34,9 32,6 СТ СС АА СС GG

405 мужской 18 7ТА/7ТА 54,8 46,4 СС СС АА СС GG

533 женский 38 7ТА/7ТА 68,2 58,2 СС СС АА СС GG

240 женский 61 6ТА/8ТА 51,0 46,2 СС СС АА СС GG

56 женский 22 5ТА/7ТА 170,0 155,8 СС СС АТ СС GG

404 мужской 18 6ТА/7ТА 55,4 47,8 СС АС АА СС GG

447 мужской 76 6ТА/7ТА 36,7 29,5 СС АС АА CG GA

12 мужской 18 6ТА/7ТА 58,0 53,4 СС АС АА СС GG

442 мужской 21 6ТА/7ТА 46,4 37,8 СС АС АА СС GG

475 мужской 38 6ТА/7ТА 41,7 27,2 СС АС АА СС GG

498 мужской 38 6ТА/7ТА 35,0 20,3 СС АС АА СС GG

495 мужской 17 6ТА/7ТА 32,0 26,0 СС АС АА СС GG

523 мужской 9 6ТА/7ТА 23,0 17,0 СС АС АА СС GG

535 женский 17 6ТА/7ТА 25,2 21,2 СС СС АА СС GG

558 мужской 18 6ТА/7ТА 33,5 22,8 СС СС АА СС GA

Окончение табл. 1

№ Пол Возраст, лет Генотип rs3064744 Общий билирубин, мкмоль/л Непрямой билирубин, мкмоль/л Результаты секвенирования

Генотип rs28899472 Генотип rs3755319 Генотип rs2125984650 Генотип rs1273237448 Генотип rs4148323

587 мужской 15 6ТА/7ТА 36,3 33,1 СС АС АА СС GG

43 мужской 52 6ТА/7ТА 60,7 49,5 СС АС АА СС GG

11 мужской 56 6ТА/6ТА 54,2 45,5 СС АС АА СС GG

9 женский 54 6ТА/6ТА 50,0 30,0 СС АА АА СС GG

206 мужской 40 6ТА/6ТА 40,2 28,6 СС АА АА СС GG

224 женский 46 6ТА/6ТА 29,0 24,0 СС АС АА СС GG

104 мужской 28 6ТА/6ТА 33,7 29,6 СС АА АА СС GG

Таблица 2

Условия проведения полимеразной цепной реакции, n = 33

Участок гена Последовательность праймеров Температура Продолжительность Состав смеси Длина продукта (п.н.)

Промотор D: 5'-ctctaagcacatccccaagta-3' R: 5'-taagcaagtttccatccttca-3' [3] 95 °С 30 с, 54 °С 30 с, 72 °С 30 с 10 мкл реакционной смеси БиоМастер LR Ж-ПЦР-Со1ог (2х) (ООО «БИОЛАБМИКС», Новосибирск), по 0,4 мМ каждого праймера 525

Экзон 1 (гетерозиготы по rs3064744) 1-1 D: 5'-gaacctctggcaggagcaa-3' 11R: 5'-aaagctgctttctgccag-3' 95 °С 30 с, 62 °С 30 с, 72 °С 30 с Трис-НС1 (рН 9,0) 75 мМ, (КН4)^04 20 мМ, Тween-20 0,01%, 2,5 мМ MgCl2, по 0,4 мМ каждого праймера, 0,3 мМ смеси dNTP, 2 мкг ДНК, 1 единица активности Тaq-ДНК-полимеразы (компания «СибЭнзим», Новосибирск) 461

12D: 5'-acttactgcacaacaagga-3' 12R: 5'-ggctagttaatcgatcca-3' 95 °С 30 с, 56 °С 30 с, 72 °С 30 с 10 мкл реакционной смеси БиоМастер LR Ж-ПЦР-Со1ог (2х) (ООО «БИОЛАБМИКС», Новосибирск), по 0,6 мМ каждого праймера 551

Экзон 1 (гомозиготы по rs3064744) 1 1D: 5'-aacttggtgtatcgattgg-3' 11R: 5'-aaagctgctttctgccag-3' 95 °С 30 с, 50 °С 30 с, 72 °С 30 с 10 мкл реакционной смеси БиоМастер LR Ж-ПЦР-Со1ог (2х) (ООО «БИОЛАБМИКС», Новосибирск), по 0,24 мМ каждого праймера 516

12D: 5'-acttactgcacaacaagga-3' 12R: 5'-ggctagttaatcgatcca-3' 95 °С 30 с, 56 °С 30 с, 72 °С 30 с 10 мкл реакционной смеси БиоМастер LR Ж-ПЦР-Со1ог (2х) (ООО «БИОЛАБМИКС», Новосибирск), по 0,6 мМ каждого праймера 551

Экзон 2 D: 5'-tgtaagcaggaacccttcctcc-3' R: 5'-gaagctggaagtctgggattag-3' [2] 95 °С 30 с, 60 °С 30 с, 72 °С 30 с 10 мкл реакционной смеси БиоМастер LR Ж-ПЦР-Со1ог (2х) (ООО «БИОЛАБМИКС», Новосибирск), по 0,4 мМ каждого праймера 409

Экзон 3 D: 5'-cctcccactctgttaaagactgttc-3' R: 5'-agtgttactcacatgcccttgc-3'[2] 95 °С 30 с, 60 °С 30 с, 72 °С 30 с 10 мкл реакционной смеси БиоМастер LR Ж-ПЦР-Со1ог (2х) (ООО «БИОЛАБМИКС», Новосибирск), по 0,4 мМ каждого праймера 402

Экзон 4 D: 5'-tgcaagggcatgtgagtaacac-3' R: 5'-ttgaaacaacgctattaaatgcta cg-3'[2] 95 °С 30 с, 44 °С 30 с, 72 °С 30 с 10 мкл реакционной смеси БиоМастер LR Ж-ПЦР-Со1ог (2х) (ООО «БИОЛАБМИКС», Новосибирск), по 0,4 мМ каждого праймера 434

Экзон 5 D: 5'-gagaggattgttcataccacagg-3' R: 5'-cactgattctgttttcaagtttgg-3' [2] 95 °С 30 с, 60 °С 30 с, 72 °С 30 с 10 мкл реакционной смеси БиоМастер LR Ж-ПЦР-Со1ог (2х) (ООО «БИОЛАБМИКС», Новосибирск), по 0,8 мМ каждого праймера 429

Примечание. n - количество циклов, п.н. - пара нуклеотидов.

Полученные продукты амплификации подвергали очистке от солей, не включившихся праймеров и дезоксинуклеотидтрифосфатов с помощью суспензии магнитных частиц КлинМаг ДНК (ЗАО «Евро-ген», г. Москва). Секвенирование образцов осуществляли при помощи наборов BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems, США), BrilliantDye™ Terminator (v3.1) Cycle Sequencing Kit (NimaGen, Нидерланды) методом капиллярного электрофореза на аппарате Hitachi 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems,

США) с применением полимера POP-7. Анализ результатов секвенирования осуществляли с помощью программ SeqScape v.2.7, Sequence Scanner.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты прямого автоматического секвенирования по Сэнгеру указаны в табл. 1.

У 21 человека обнаружен частый однонуклеотид-ный вариант rs3755319 в гетеро- или гомозиготном состоянии (рис. 1, 2). Однонуклеотидный вариант

ге3755319 ^.234667582А>С) локализован в промоторе гена UGT1A1, является часто встречающимся в популяции вариантом [4]. Частота редкого аллеля С варианта по данным GnomAD для европейцев -около 0,43. По данным СНпУаг, вариант является патогенным для транзиторной семейной неонаталь-ной гипербилирубинемии. Однако в исследовании, выполненном в Корее, не обнаружено его влияния на уровень экспрессии гена (при оценке в составе гаплотипов): гаплотипы ге3755319С-ге2003569А-ге887829С-ге3064744(ТА)6 и ге3755319А-rs2003569G-rs887829C-rs3064744(TA)7 ассоциированы с более низкой экспрессией гена по сравнению с гаплотипом rs3755319C-rs2003569G-rs887829T-rs3064744(TA)6 [5]. Проводились исследования ге3755319 в отношении влияния на фармакокинети-ку моксифлоксацина, иринотекана [6, 7]. Вариант ас-

социирован с уровнем общего билирубина и холели-тиазом у пациентов с серповидноклеточной анемией [8]. Для того чтобы сделать однозначный вывод об ассоциации варианта с СЖ, необходимо провести дополнительные исследования.

У трех человек с генотипом 7ТА/7ТА ге3064744 (пациенты № 301, 386, 394) идентифицирован частый однонуклеотидный вариант ге28899472 в гетерозиготном состоянии (рис. 3). Однонуклеотидный вариант ге28899472 ^.234667809С>Т) локализован в промоторе гена UGT1A1 [9]. Частота редкого аллеля варианта, по данным GnomAD, для европейцев -около 0,03. Вариант не описан в СНпУат, не найдено научных статей, в которых упоминается этот вариант. По данным предиктивного анализа т sihco, вариант определен как доброкачественный/нейтральный (Ро^еп-2, PhD-SNP, SNPs&GO).

Рис. 1. Сиквенс образца

(ге3755319 в гетерозиготном состоянии)

Рис. 2. Сиквенс образца (ге3755319 в гомозиготном состоянии)

Проведен поиск варианта ге28899472 у ближайших родственников пациентов № 386, 394. Все родственники пациентов, включенные в исследование, не отмечали клинических симптомов гипербилиру-бинемии и у них никогда не фиксировалось повышение концентрации билирубина и его фракций по результатам биохимического исследования крови. Оба сына пациентки № 386 (женщина 50 лет, максимальная концентрация билирубина была зафиксирована во время беременности, в течение жизни наблюда-

ются колебания концентрации билирубина от нормальных до повышенных цифр) являются гетерозиготными носителями варианта ге3064744 (6ТА/7ТА). У одного из сыновей (28 лет) идентифицирован вариант ге28899472 в гетерозиготном состоянии, второй сын (24 года) не является носителем редкого аллеля ге28899472. Отец пациента № 394 (мужчины 32 лет, у которого впервые неконъюгированная гипербили-рубинемия была диагностирована на фоне лечения диффузного токсического зоба тиреостатиками)

также является гетерозиготным носителем варианта rs3064744 (6ТА/7ТА) и не является носителем редкого аллеля варианта rs28899472.

Таким образом, вариант rs28899472 идентифицирован в гетерозиготном состоянии у лица без ги-пербилирубинемии, носителя генотипа 6ТА/7ТА варианта rs3064744. То есть расценить вариант как патогенный в отношении СЖ на данный момент нельзя, требуется проведение исследований дизайна «случай - контроль» с целью определения частоты варианта в группе лиц с гипербилирубинемией и в контрольной группе.

У пациента № 56 (редкий генотип 5ТА/7ТА rs3064744, женщина, 22 года, без заболеваний печени и желчного пузыря в анамнезе) идентифицирован

редкий однонуклеотидный вариант ге2125984650 в гетерозиготном состоянии (рис. 4). Однонуклеотидный вариант ге2125984650 в 1-м экзоне гена UGT1A1 (с.188А>Т) является миссенс-вариантом, приводящим к замене аспарагиновой аминокислоты на валин p.Asp63Val в 63 позиции аминокислотной последовательности белка [10]. Вариант не описан в СНпУап Данных по частоте варианта в GnomAD нет. Не найдено научных статей, в которых упоминается вариант ге2125984650. По данным предиктив-ного анализа т silico, вариант определен как доброкачественный/нейтральный (PolyPhen-2, PhD-SNP, SNPs&GO). Таким образом, на данный момент вариант ге2125984650 гена UGT1A1 может быть расценен как вариант неопределенного значения.

Рис. 3. Сиквенс образцов № 301, 386, 394 (rs28899472 в гетерозиготном состоянии)

Рис. 4. Сиквенс образца № 56 (rs2125984650 в гетерозиготном состоянии)

У пациента № 447 (генотип 6ТА/7ТА ге3064744, мужчина, 76 лет, гипербилирубинемия выявлена случайно в возрасте 76 лет, татарин, в анамнезе желчнокаменная болезнь, по результатам ультразвукового исследования обнаружены кисты левой доли печени) идентифицирован редкий однонуклеотидный вариант ге1273237448 в гетерозиготном состоянии (рис. 5). Однонуклеотидный вариант ге1273237448 локализован в 1-м экзоне гена UGT1A1 (c.182C>G), является миссенс-вариантом, приводящим к замене аминокислоты аланина на

глицин р.А1а6Ю1у в 61-й позиции аминокислотной последовательности белка [11].

По данным СНпУат, вариант является вероятно патогенным для СЖ [12]. Частота редкого аллеля варианта, по данным GnomAD, очень низкая - около 0,000009, гомозигот не зафиксировано. Не найдено научных статей, в которых упоминается вариант ге1273237448. По данным предиктивного анализа in silico, вариант расценен как доброкачественный/ нейтральный (Po1yPhen-2, PhD-SNP, SNPs&GO). На данный момент вариант может быть расценен как ва-

риант неопределенного значения, однако он может иметь отношение к фенотипу пациента.

Пациент № 558 (генотип 6ТА/7ТА ге3064744, мужчина, 18 лет, без заболеваний печени и желчного пузыря в анамнезе), является носителем редкого варианта ге4148323 (UGT1Л1*6) в гетерозиготном состоянии (рис. 6). Вариант ге4148323 локализован в 1-м экзоне гена UGT1A1 (с.21Ш>А, р^1у71А^) [13]. Частота редкого аллеля варианта, по данным GnomAD, низкая - около 0,002. Наиболее распространен вариант в странах Азии (частота редкого аллеля варианта - около 0,15). Вариант ге4148323 (ШТ1А1*6) в гомозиготном состоянии связан с развитием СЖ, неонатальной гипербилирубинемией и снижением активности фермента УДФ-глюкуронозилтрансферазы 1А1 на 70% по сравнению с диким типом [14, 15].

Ранее нами был проведен поиск варианта в группе лиц с СЖ (125 человек). В состав группы не были включены пациенты № 447 и 558. У двоих лиц с

СЖ в этой группе был идентифицирован вариант ге4148323 также в гетерозиготном состоянии. Кроме варианта ге4148323, пациенты были гетерозигота-ми по ге3064744 (генотип 6ТА/7ТА) [1]. Основные исследования ге4148323 проведены в странах Азии (Индия, Китай). В них показано, что при СЖ встречаются как гомозиготные носители ге4148323, так и компаунд-гетерозиготы по ге4148323 и ге3064744, что и наблюдается у пациентов № 447 и 558 [16, 17].

Таким образом, пациент № 447 является гетерозиготным носителем четырех вариантов: ге3064744 (частый вариант при СЖ), ге1273237448 (редкий вариант, вероятно патогенный для СЖ по данным СНпУаг), ге4148323 (известный вариант для СЖ у жителей азиатских стран), которые могут объяснить неконъюгированную гипербилирубинемию, и распространенного в популяции варианта ге3755319, клиническая значимость которого на данный момент неизвестна.

Рис. 5. Сиквенс образца № 447 (ге1273237448 в гетерозиготном состоянии)

Рис. 6. Сиквенс образца № 447 (ге4148323 в гетерозиготном состоянии)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно результатам проведенного исследования, прямое автоматическое секвенирование по Сэ-нгеру гена иОТ1Л1 может быть следующим этапом ДНК-анализа после определения генотипа ге3064744 для лиц с генотипами 6ТА/6ТА, 6ТА/7ТА ге3064744 и подозрением на СЖ.

Идентифицирован распространенный однону-клеотидный вариант ге3755319 в промоторе гена,

значимость которого в отношении неконъюгиро-ванной гипербилирубинемии должна будет оценена в следующих научных исследованиях. У трех лиц с подтвержденным СЖ (7ТА/7ТА ге3064744) идентифицирован вариант ге28899472, роль которого в развитии фенотипа СЖ пока неясна, что также требует дальнейшего изучения. У пациента с редким генотипом 5ТА/7ТА ге3064744 идентифицирован одно-нуклеотидный вариант неопределенного значения

rs2125984650. У двух лиц с генотипами 6ТА/7ТА rs3064744 выявлены варианты гена, которые являются патогенными и вероятно патогенными для СЖ по данным некоторых источников (rs4148323, rs1273237448).

Таким образом, ни у одного из шести человек с неконъюгированной гипербилирубинемией и генотипом 6ТА/6ТА rs3064744 не выявлено каких-либо патогенных для СЖ вариантов в гене UGT1A1. Среди 12 человек с неконъюгированной гипербилиру-бинемией и генотипом 6ТА/7ТА rs3064744 у двух найдены варианты, объясняющие их состояние. То есть только у 11% (два человека из 18 с генотипами 6ТА/6ТА, 6ТА/7ТА rs3064744) прямое автоматическое секвенирование по Сэнгеру гена UGT1A1 позволило выявить причинные варианты гена. Полученные результаты могут говорить о наличии вариантов других генов, которые ассоциированы с СЖ, либо о недостаточной обследованности пациентов с генотипами 6ТА/6ТА, 6ТА/7ТА rs3064744 и клинически ложном диагнозе синдрома Жильбера.

СПИСОК ИСТОЧНИКОВ

1. Иванова А.А., Гуражева А.А., Мельникова Е.С., Максимов В.Н., Немцова Е.Г. Исследование молекулярно-гене-тических маркеров синдрома Жильбера. Бюллетень сибирской медицины. 2023;22(2):39-45. DOI: 10.20538/16820363-2023-2-39-45.

2. Abdellaoui N., Abdelmoula B., Abdelhedi R., Kharrat N., Tabebi M., Rebai A. et al. Novel combined UGT1A1 mutations in Crigler Najjar syndrome type I. J. Clin. Lab. Anal. 2022;36(6):e24482. DOI: 10.1002/jcla.24482.

3. Costa E., Vieira E., Martins M., Saraiva J., Cancela E., Costa M. et al. Analysis of the UDP-glucuronosyltransferase gene in Portuguese patients with a clinical diagnosis of Gilbert and Cri-gler-Najjar syndromes. Blood Cells Mol. Dis. 2006;36(1):91-7. DOI: 10.1016/j.bcmd.2005.09.002.

4. Db SNP rs3755319. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/ rs3755319.

5. Shin H.J., Kim J.Y., Cheong H.S., Na H.S., Shin H.D., Chung M.W. Functional study of haplotypes in UGT1A1 promoter to find a novel genetic variant leading to reduced gene

expression. Ther. Drug Monit. 2015;37(3):369-374. DOI: 10.1097/FTD.0000000000000154.

6. Naidoo A., Ramsuran V., Chirehwa M., Denti P., McIlleron H., Naidoo K. et al. Effect of genetic variation in UGT1A and ABCB1 on moxifloxacin pharmacokinetics in South African patients with tuberculosis. Pharmacogenomics. 2018;19(1):17-29. DOI: 10.2217/pgs-2017-0144.

7. Yu Q., Zhang T., Xie C., Qiu H., Liu B., Huang L. et al. UGT1A polymorphisms associated with worse outcome in colorectal cancer patients treated with irinotecan-based chemotherapy. Cancer Chemother. Pharmacol. 2018;82(1):87-98. DOI: 10.1007/s00280-018-3595-7.

8. Milton J.N., Sebastiani P., Solovieff N., Hartley S.W., Bhat-nagar P., Arking D.E. et al. A genome-wide association study of total bilirubin and cholelithiasis risk in sickle cell anemia. PLoS One. 2012;7(4):e34741. DOI: 10.1371/journal.pone.0034741.

9. Db SNP rs28899472. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/ rs28899472.

10. Db SNP rs2125984650. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ snp/rs2125984650#variant_details.

11. Db SNP rs1273237448. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ snp/rs1273237448#variant_details.

12. ClinVar. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ RCV002221165.1.

13. Db SNP rs4148323. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ snp/rs4148323.

14. Steventon G. Uridine diphosphate glucuronosyltrans-ferase 1A1. Xenobiotica. 2020;50(1):64-76. DOI: 10.1080/00498254.2019.1617910.

15. Zhou J., Yang C., Zhu W., Chen S., Zeng Y., Wang J. et al. Identification of Genetic Risk Factors for Neonatal Hyperbilirubinemia in Fujian Province, Southeastern China: A Case-Control Study. Biomed. Res. Int. 2018;2018:7803175. DOI: 10.1155/2018/7803175.

16. Bale G., Avanthi U.S., Padaki N.R., Sharma M., Duvvur N.R., Vishnubhotla V.R.K. Incidence and risk of Gallstone disease in Gilbert's syndrome patients in Indian population. J. Clin. Exp. Hepatol. 2018;8(4):362-366. DOI: 10.1016/j. jceh.2017.12.006.

17. Zhang M., Wang H., Huang Y., Xu X., Liu W., Ning Q. et al. Compound heterozygous UGT1A1*28 and UGT1A1*6 or single homozygous UGT1A1*28 are major genotypes associated with Gilbert's syndrome in Chinese Han people. Gene. 2021;781:145526. DOI: 10.1016/j.gene.2021.145526.

Вклад авторов

Иванова А.А. - разработка концепции и дизайна, молекулярно-генетический анализ, интерпретация данных. Апарцева Н.Е., Немцова Е.Г., Курилович С.А., Кручинина М.В. - формирование группы СЖ. Каширина А.П., Иванова Ю.В. - молекулярно-ге-нетический анализ. Максимов В.Н. - проверка критически важного интеллектуального содержания, окончательное утверждение для публикации рукописи.

Информация об авторах

Иванова Анастасия Андреевна - канд. мед. наук, ст. науч. сотрудник, лаборатория молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний, НИИТПМ - филиал ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск, ivanova_a_a@mai1.ru, http://orcid. о^/0000-0002-9460-6294

Апарцева Наталья Евгеньевна - аспирант, мл. науч. сотрудник, лаборатория генетических и средовых детерминант жизненного цикла человека, НИИТПМ - филиал ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск, tusya_evdokimova@mail.ru, http://orcid.org/0000-0003-3772-1058

Каширина Анастасия Петровна - аспирант, мл. науч. сотрудник, лаборатория генетических и средовых детерминант жизненного цикла человека, НИИТПМ - филиал ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск, kashirina_a_p_91@mail.ru, http://orcid.org/0000-0002-1968-9712

Немцова Елена Геннадьевна - канд. мед. наук, доцент, кафедра пропедевтики внутренних болезней, гастроэнтерологии и диетологии им. С.М. Рысса, лечебный факультет, СЗГМУ им. И.И. Мечникова, г. Санкт-Петербург, neg-85@yandex.ru, http:// orcid.org/0000-0003-1501-6796

Иванова Юлия Владимировна - ординатор, НИИТПМ - филиал ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск, juliaivanovvaa@yandex.ru.

Кручинина Маргарита Витальевна - д-р мед. наук, доцент, вед. науч. сотрудник, лаборатория гастроэнтерологии, НИИТПМ - филиал ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск, kruchmargo@yandex.ru, http://orcid.org/0000-0003-0077-3823

Курилович Светлана Арсентьевна - д-р мед. наук, профессор, зав. лабораторией гастроэнтерологии, НИИТПМ - филиал ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск, kurilovich@yandex.ru

Максимов Владимир Николаевич - д-р мед. наук, профессор, гл. науч. сотрудник, лаборатория молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний, НИИТПМ - филиал ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск, medik11@mail.ru, http://orcid. org/0000-0002-7165-4496

(*) Иванова Анастасия Андреевна, ivanova_a_a@mail.ru

Поступила в редакцию 06.12.2023; одобрена после рецензирования 21.12.2023; принята к публикации 26.12.2023