CC BY
12
РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОТЕОМНОГО АНАЛИЗА АСКАРИДАТ (ASCARIS LUMBRICOIDES и A.SUUM) МЕТОДОМ MALDI-TOFF MS
Нагорный С.А., Ермакова Л.А., Алешукина И.С., Алешукина A.B., Криворотова Е.Ю.
ФБУН «Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии» Роспотребнадзора (lab-parazit@yandex.ru)
В настоящее время в зарубежной литературе активно обсуждаются вопросы систематической принадлежности человеческой и свиной аскарид. Ряд зарубежных авторов [1, 2, 3] высказывают предположения об идентичности Ascaris lumbricoides м Ascaris suum, основываясь на морфологической схожести, как самих возбудителей, так и их яиц. Обсуждается вопрос о потенциальной патогенности A.suum для человека. Данная гипотеза, по мнению авторов, обусловлена минимальными (1,9%) различиями в структуре генома данных гельминтов, что подтверждается проведенными молекулярно-биологическими исследованиями [1,2,3].
Целью настоящей работы явилось изучение белкового профиля указанных аскридат с использованием метода MALDI-TOFF MS.
Материалы и методы. Для проведения исследований использовали молодых, неполовозрелых аскарид, отошедших естественным путем у пациентов клиники и молодых гельминтов A.suum, выделенных из кишечника свиней на бойнях. У гельминтов отделяли головной конец тела (два сантиметра). Материал замораживали и пятикратно гомогенизировали механически из замороженного состояния с последующей обработкой ультразвуком (пятикратно по 30 секунд с интервалом 30 секунд на спиртовой бане (-30). Для лизиса клеток добавляли лизис -буфер из набора MALDI Sepityper Kit (Bruker Daltonics) и встряхивали на вортексе 10 секунд. Для улучшения качества спектра проводили экстракцию в 20 ц1 70%-ной муравьиной кислоты. Затем в пробирку добавляли такое же количество (20 ц1) 50% ацетонитрила. Гомогенаты центрифугировали при 13000 оборотах в минуту в течение 2 минут. Один ц1 супернатанта образца наносили на стальную мишень в двух повторностях. Мишень сушили в течение нескольких минут (5-15) при комнатной температуре. Затем на каждый образец наносили 1 ц1 матрицы СНСА (а-Cyano-4-hydroxycinnamicacid), и просушивали. Масс-спектрометрию проводили по стандартной процедуре в соответствии с инструкцией к прибору.
Профили масс белка получены с использованием Microflex LT MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) с программным обеспечением Flex Control (Bruker Daltonics). Профили полученного спектра визуализированы с помощью программного обеспечения Flex analysis 3.3 (Bruker Daltonics).
Основные результаты. Масс-спектрометрический анализ белковых экстрактов показывал спектры с пиками высокой интенсивности в диапазоне 2-20 кДа. Распределение патернов и интенсивности спектральных пиков со схожей массой согласуется у всех образцов одного вида аскарид, что доказывается идентичными профилями при наложении масс-спектрометрического пика друг на друга (рис1.)
ад :m| inj ВДИ
j ЧИЛИ
_|б
Рис.1, а) Белковый масс-спектр A.suum, б) Белковый масс-спектр A.lubricoides
При использовании Flex analysis отмечено, что профили спектров, полученные из белков аскарид A.suum и A.lubricoides, отличаются по5из 8 мажорных пиков, что делает возможным дифференцировать по белковому профилю один вид от другого.
Заключение. Метод масс-спектрометрического анализа для бактерий и микроскопических грибов занял достойное место в диагностике инфекционных болезней и является «золотым стандартом». Для паразитарных инфекций его применение находится в стадии разработки.
Модернизация метода таксономической дифференциации аскаридат на базе масс-спектрометрии подкупает своей быстротой (в течение 1-2 часов) и точностью.
Применение метода масс-спектрометрии позволит дифференцировать виды не только целых образцов, но и поврежденных гельминтов, что в значительной степени упростит верификацию диагноза при минимальных материальных, временных и трудовых затратах.
Продолжение исследований в данном направлении позволит создать библиотеку масс-спектрометрических профилей для разных видов гельминтов человека и животных.
Литература: 1.Chang-Chun Shao, Min-Jun Xu, Samer Alasaad, et al. BMC Vet Res. 2014; 10: 99. Published online 2014 Apr 27. doi: 10.1186/1746-6148-10-99. 2.Daniela Leles, Scott L Gardner, Karl Reinhard, et al. Parasit Vectors. 2012 Feb 20;5:42.
doi: 10.1186/1756-3305-5-42. 3.Betson M, Stothard JR. J Infect Dis. 2016 Apr 15;213(8):1355-6. doi: 10.1093/infdis/jiw037. Epub 2016 Feb 4.
Results of proteomic analysis of Ascaridata (Ascaris lumbricoides and A. suum) by method of MALDI-TOFF MS. Nagorny S.A., Ermakova L.A., Aleshukina I.S., Aleshukina A.V., Krivorotova E.Yu. Rostov Scientific Research Institute of Microbiology and Parasitology.
Summary. Application of mass spectrometry will allow to differentiate species not only in intact helminth samples but also in damaged ones, what will greatly simplify the verification of diagnosis at the minimum material, time and labor costs. Continuation of such investigations in this area will provide creation of a mass spectrometric profile library for different types of human and animal helminths.
