Масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI MS) - инструмент видовой идентификации дирофилярий Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

стронгилятозами и молодняка текущего года рождения параскаридозом. В результате снижения резистентности организма лошадей, особенно молодняка, они более восприимчивы к инфекционным заболеваниям. Например, молодняк, пораженный гельминтами и желудочными оводами, восприимчив к мыту и тяжело переболевает этой инфекцией.

Литература: 1. Неустроев М. П. //Сб. науч. тр. /РАСХН Сиб. отд-ние. НПО «Якутское», Якут. НИИСХ - Новосибирск, 1993. - С. 100-103. 2.Неустроев М. П. Система ведения агропромышленного производства Республики Саха (Якутия). Производство и переработка продуктов животноводства /РАСХН. Сиб. Отд-ние. НПО «Якутское». - Новосибирск, 1992. - С. 92. 3. Коколова Л. М. //Автореф. дисс. ...докт. вет. наук - М., 2007. -48 с. 4. Исаков С. И. // Автореф. дисс. ...канд. вет. наук - М., 1973. - 16 с. 5. Баишев А. А. //Автореф. дисс. ... канд. вет. наук - Якутск, 2002. - 19 с. 6. Коколова Л. М., Исаков С. И., Сергучев И. С. //I Международный конгресс по табунному коневодству «Устойчивое развитие табунного коневодства». -Якутск, 2006. - С. 128-134. 7. Сафронов М. Г. Гельминты и гельминтозы животных Якутии. - Якутск, 1966. - 121 с. 8. Андреева М. В. Рекомендации по борьбе с аноплоцефалидозами лошадей в Республике Саха (Якутия). - Якутск 1996. - 7 с. 9. Большакова В. А. Автореф. дис. .канд. вет. наук. - М.,1998. -16 с. 10. Коколова Л. М., Исаков С. И., Верховцева Л. А. Сб. мат. научно-практ. конф., посвященная государственной и республиканской животноводческим опытным станциям (Якутск, 2 ноября 1999 г.) С. 260-263. 11. Готовцева М. З. //Научно-техн. бюлл. «Профилактика и лечение болезней животных». - Новосибирск, 1989. - Вып. 1. - С. 24-25. 12. Коколова Л. М., Исаков С. И. //Вестник ветеринарии. - М., 2007.- № 1-2. (40-41).- С. 116-117.

Helminthoses of horses of stud management in the Republic of Sacha.

Kokolova L.M., Gavriljeva L.Yu., Ivanova Z.K., Stepanova S.M. Yakut Scientific Research Institute of Agriculture.

Summary. Helminthoses of horses of stud management are widely spread in the conditions of the Far North. One has revealed 100% prevalence of Strongylata infections among youngsters of running year birth and adult population and Parascarisequorum infection in youngsters of the running year birth.

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ С МАТРИЧНО-АКТИВИРОВАННОЙ ЛАЗЕРНОЙ ДЕСОРБЦИЕЙ/ИОНИЗАЦИЕЙ (MALDI MS) -ИНСТРУМЕНТ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДИРОФИЛЯРИЙ

Криворотова Е.Ю., Нагорный С.А.,

Алешукина А.В., Коршунов С.О.

ФБУН Ростов НИИ микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора

119

Введение. До недавнего времени в диагностике дирофиляриоза человека в качестве «золотого стандарта» использовалась гистологическая идентификация удаленных гельминтов. Этот анализ оказывается ненадежным, если нематоды повреждены: Dirofilaria immitis может быть ошибочно принята за D.repens и наоборот. В качестве альтернативы видового определения филярий по морфологическим признакам применяются биомолекулярные методы.

Молекулярно-биологические методы идентификации вида организма все чаще вытесняют использование морфологических критериев. Тем не менее, стандартного анализа не существует: для большинства видов информацию о последовательности нуклеиновых кислот необходимо сначала получить. Несмотря на это, а также в связи с существенными расходами на приобретение и эксплуатацию оборудования, ПЦР стала «золотым стандартом» для видового определения, в связи с высокой специфичностью, воспроизводимостью и чувствительностью.

Для определения вида организма можно использовать не только морфологический и генетический анализы, но и протеомные исследования. Идентификация микроорганизмов с помощью MALDI-TOF MS хорошо изучена и широко используется в практике [1]. В меньшей степени протеомика применяется как таксономический инструмент для идентификации многоклеточных организмов. Использование MALDI-MS для определения видов членистоногих опробовано впервые более десяти лет назад на плодовых мушках [3]. C.Kaufmannetal. (2012) провели исследования по видовому составу мокрецов, A.Hoppenheitetal. (2013) - мух цеце и других насекомых.

Идентификация микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии широко используется во многих лабораториях мира, с большой вариацией аппаратных и программных решений и комплексными базами эталонных данных. MALDI-TOF MS обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами определения видов. Подготовка образца сравнительно проста и требует мало времени. Не требуются дорогостоящие расходные материалы и генетическая информация об организмах, рабочий процесс автоматизирован.

Цель данного исследования проверка возможности дифференциации видов D. repens и D. immitis методом масс-спектрометрии.

Материалы и методы. Гельминтов, удаленных у человека и собаки, многократно отмывали в физрастворе, гомогенизировали механически и ультразвуком. Для лизиса клеток добавляли лизис буфер из набора MALDI Sepsityper Kit (Bruker Daltonics) и встряхивали на вортексе 10 секунд. Для улучшения качества спектра проводили экстракцию в 20 ^1 70%-ной муравьиной кислоты. Затем в пробирку добавляли аналогичное количество (20 ^1) 50%-ного ацетонитрила. Гомогенаты центрифугировали при 13000 оборотах в минуту в течение 2 минут. Один ^1 супернатанта образца наносили на стальную пластину (Bruker Daltonics) в двух последовательностях. Мишень сушили в течение нескольких минут (5-15) при комнатной температуре. Затем

120

на каждый образец наносили 1 ц1 матрицы CHCA (a-Cyano-4-hydroxycinnamicacid), просушивали и помещали в масс-спектрометр для анализа.

Профили масс белка получены с использованием Microflex LT MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) с программным обеспечением Flex Control (Bruker Daltonics). Профили полученного спектра визуализированы с помощью программного обеспечения Flex analysis3.3 (Bruker Daltonics).

Результаты. Десять образцов (пять особей каждого вида дирофилярий) были подвергнуты MALDI-TOF MS анализу. Масс-спектрометрический анализ белковых экстрактов показал спектры с пиками высокой интенсивности в диапазоне 2 -20 кДа. Качество спектров и интенсивности спектральных пиков согласуется у всех образцов одного вида. При использовании Flex analysis отмечено, что профили спектров, полученные из белков дирофилярий 2-х видов, отличаются по восьми мажорным пикам, что делает возможным дифференцировать по белковому профилю один вид от другого (рис.1, рис. 2)

Рис. 1. Белковый масс- спектр

repens

D- Рис. 2. Белковый масс-спектр

D. immitis

Заключение. Полученные результаты показывают возможность дифференциации видов D. repens и D. immitis методом MALDI-TOF MS. Проведение анализа не требует больших материальных и трудовых затрат и опыта таксономических исследований в паразитологии. Основным препятствием для использования MALDI-TOF MS является стоимость приобретения аппаратуры, но его использование экономически оправдано. Следовательно, масс-спектрометрия может служить эффективным таксономическим инструментом не только при микробиологических, но и при паразитологических и энтомологических исследованиях.

Литература: 1. Giebel R., Worden C., Rust SM, Kleinheinz G.T., Robbins M., et al. // Adv.Appl.Microbiol.- 2010.- 71: 149-184. 2. Dingle T.C., Butler-Wu S.M. //Clin. Lab. Med. 2013 Sep;33(3):589-609. 3. Feltens R., Gorner R., Kalkhof

121

S., Groger-Arndt H., Von Bergen M. // BMC Evolutionary Biology.- 2010.-10: 95. 4. Kaufmann C., Schaffner F., Ziegler D., Pfluger V., MathisA.// Parasitology. -2012.- Feb;139(2):248-58. 5. Hoppenheit A., Murugaiyan J., Bauer B., Clausen P.H., Roesler U. // Parasitol. Res.- 2014.- Feb;113(2):723-6.

Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is the tool for specific identification of Dirofilaria repens and D. immitis. Krivorotova E.Yu., Nagorny S.A., Aleshukina A.V., Korshunov S.O. Rostov Scientific Research Institute of Microbiology and Parasitology.

Summary. The results of the carried out investigations show that MALDI-TOF MS can be applied for identification of D. repens and D. immitis. The analytical procedure doesn’t require large material and labour expenditures as while as the experience of taxonomic studies in parasitology. The main obstacle for application of MALDI-TOF MS is the cost of apparatus but it is covered expenses from the economical point of view. The procedure can serve as the effective taxonomic tool not only for microbiological but parasitological and entomological trials.

СЕЗОННАЯ ДИНАМИКА SCHELORIBATES, BERLESE, 1908 И GALUMNA, VON HEYDEN 1826, И ИХ ИНВАЗИРОВАННОСТЬ ЦИСТИЦЕРКОИДАМИ МОНИЕЗИЙ В ХОЗЯЙСТВАХ ВОЛОГОДСКОЙ ОБЛАСТИ

Кряжев А.Л.*, Никитин В. Ф.**

*ФГБОУ ВПО Вологодская государственная молочнохозяйственная

академия им. Н.В. Верещагина **ГНУ ВНИИ гельминтологии им.К.И. Скрябина

Введение. Орибатидные (панцирные) клещи служат промежуточными хозяевами в развитии мониезий. В числе их промежуточных хозяев зарегистрированы клещи 67 видов 28 родов 6 семейств, в их числе для М. expansa орибатиды 64-х и для М. benedeni 25-ти видов[2].

Местами обитания орибатид служат почва, остатки гниющих растений, лесная подстилка, деревья, мох, лишайники, и также значимые для профилактики мониезиоза - экскременты травоядных животных [4].

Большая часть работ отечественных и зарубежных ученых посвящена вопросам сезонной динамики орибатид. Oтмечается спад численности орибатид в зимнее и летнее время и повышение весной и осенью. Это обстоятельство имеет большое значение в отношении сроков заражения скота; в южных районах эти повышения численности клещей бывают значительными [1,3,5,6,7]

Материалы и методы. Изучение плотности популяций орибатидных клещейна естественномлесо-кустарниковом пастбище и сезонную динамику

122