CC BY
58
УДК: 619:616-07:579.841.93
результаты производственного испытания диагностикумов, изготовленных из бруцелл В L-ФОРМЕ
Л.Н. ГОРДИЕНКО, кандидат ветеринарных наук, директор
ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных Рос-сельхозакадемии
E-mail:vniibtg@rambler.ru
Резюме. В комплексе диагностических мероприятий при бруцеллезе животных основное место принадлежит лабораторным методам исследований. Существующими диагностическими средствами можно выявить животных с персистенцией типичных форм возбудителя. Вместе с тем часть особей, инфицированных измененными (L) формами бруцелл остаются невыявленными и представляют опасность для восприимчивого поголовья в стадах.
Производственное испытание диагностикумов, изготовленных из бруцелл в L-форме, проводили с целью определения их эффективности и возможности использования в общем комплексе лабораторных исследований.
В работе использовали экспериментальные образцы антигенов и гипериммунных сывороток из реверсибельных штаммов бруцелл, трансформированных in vitro, в стадах северных оленей неблагополучных по бруцеллезу.
Сыворотку крови исследовали в реакции агглютинации (РА) и реакции связывания комплемента (РСК). Индикацию культур бруцелл осуществляли с учетом типичных и измененных форм бруцелл на разных стадиях трансформации.
L-антигены обладают специфичностью. Их диагностическая активность с гомологичными сыворотками проявлялась при разведении 1:20...1:50.
Использование L-антигенов в общем комплексе серологических исследований дало возможность выявить дополнительно
0,36 %животных-бруцеллоносителей. При изучении культур, изолированных от северных оленей в очагах инфекции, L-сыворотки позволили дополнительно идентифицировать до 43 % бруцелл.
Антигены и сыворотки, изготовленные из бруцелл в L-форме, можно эффективно использовать при диагностике бруцеллеза животных.
Ключевые слова: бруцеллы, L-формы, диагностикумы, изготовление, производственное испытание, специфичность, активность, идентификация, выявление, культуры.
За два столетия изучения бруцеллёзной инфекции отечественные и зарубежные учёные разработали и апробировали в экспериментальных и производственных условиях множество прямых и косвенных методов, позволяющих выявлять инфицированных животных [1].
Однако все существовавшие до сегодняшнего дня методы ограничивались использованием диагностических препаратов и тест-систем на основе типичных (S-) или диссоциированных (R-) форм бруцелл [2].
Открытие изменчивости возбудителя бруцеллёза позволило установить особенности инфекционного процесса с необычной патологией и закономерности проявления эпизоотий, связанные с приживаемостью L-форм возбудителя в организме животных и циркуляцией их в очагах инфекции [3, 4, 5].
Бруцеллы, как и многие другие микроорганизмы, под действием индуцирующих факторов способны трансформироваться in vitro и in vivo и в таком состоянии адаптироваться к искусственным питательным средам и персистировать в организме животных в течение длительного времени [5, 6]. Под действием множества индуцирующих факторов происходит частичная или полная утрата клеточной стенки, что приводит к поте-
ре способности сохранять на её поверхностных слоях специфические антигенные детерминанты, характерные для S- и R-форм бруцелл [7]. При этом на поздних стадиях трансформации отмечается активный синтез цитоплазматического L-антигена,- который служит основным дифференциальным признаком трансформированных форм бруцелл и играет решающую роль в лабораторной диагностике.
Персистенцию бруцелл в L-форме невозможно выявить стандартными лабораторно-диагностическими методами, в которых важное значение имеют фенотипические и биологические (антигенные и агглютина-бельные) свойства возбудителя.
В условиях лаборатории мы выделили L-варианты бруцелл, изучили их основные признаки на разных стадиях трансформации и определили возможность использования L-культур бруцелл для изготовления диагностикумов: антигенов и гипериммунных сывороток [8].
Изучение специфичности и диагностической активности опытных образцов L-антигенов и L-бруцеллёзных сывороток в экспериментах на лабораторных животных дало положительные результаты [9, 10].
В связи с этим цель наших исследований - изучить диагностические качества препаратов, изготовленных из L-форм бруцелл, в производственных условиях для усовершенствования методов диагностики бруцеллёза животных. Для ее достижения были определены следующие задачи: изучить диагностическую активность и специфичность антигенов, изготовленных из бруцелл в L-форме, изучить активность гипериммунных L-бруцеллёзных сывороток при идентификации культур бруцелл, изолированных от животных в очагах инфекции.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили в лаборатории экологии ВНИИ бруцеллеза и туберкулеза животных с 2004 по 2008 гг. в соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил [11]. Для изготовления диагностикумов использовали экспериментально полученные культуры бруцелл в L-форме, трансформированные из штамма B.abortus 19 in vivo под действием антибиотиков [12]. Морфологически культура бруцелл в L-форме представляла грам-положительные клетки эллипсоидной формы размером 2,5.. .3,0 х 5,0.. .6,0 мкм. Они утрачивали ригидную клеточную стенку с поверхностными антигенными детерминантами и неагглютининровались с S- и R-бруцеллёзными сыворотками из коммерческих наборов.
Культура L-варианта бруцелл имела положительную реакцию термоагглютинации и пробу с трипаф-лавином, не агглютинировалась в физиологическом растворе и нормальной кроличьей сыворотке, выделяла сероводород, хорошо росла на средах с тианином и фуксином. В опытах на лабораторных животных проявляла слабую вирулентность с индексом инфицированности от 3 до 10 %.
Родовую принадлежность L-вариантов бруцелл подтверждали при многократных пересевах на искусственных питательных средах без индуцирующего фактора и методом реверсии при двух-трёхкратном пассировании через организм морских свинок, а также в полимеразной цепной реакции.
Таблица1. диагностическая активность антиге-
■ ».W. W . W W. .. . Разведения сыворотки — Ч 1 — — — ■ • - Разведения антигена
1:10\1:20\ 1:5011:75\1:100\1:150\1:200
1:25 ++++++++++++++++++++ ++ -1:50 ++++++++++++++++++++ + -1:100 +++ +++ ++ ++ + - -
Предельная концентрация, в которой проявляется активность антигенов, изготовленных из L-форм бруцелл химическим способом, в РСК составляет 1:50 (табл. 2). Следовательно, для диагностических исследований с помощью РСК нужно использовать L-антигены в разведении 1:20.
Таблица 2. диагностическая активность анти-
Разведения Разведения антигена
L-сыворотки 1:1011:2011:50 \1:75\ 1:100\ 1:150\ 1:200
1 5 ++++ ++++ ++++ +++ - - -
1 :10 ++++ ++++ ++++ - - - -
1 :20 ++++ +++ + + - - -
1 40 ++++ + -----
1 80 + - - - - - -
1 160
Г ипериммунную сыворотку к бруцеллам в L-форме получали путём иммунизации кроликов собственным способом [13].
Экспериментальные исследования на лабораторных животных осуществляли в соответствии с правилами [14, 15].
Антигены из бруцелл в L-форме готовили физическим (для реакции агглютинации) и химическим (для реакции связывания комплемента) способами, на которые поданы заявки на изобретение.
Диагностические качества L-бруцеллёзных сывороток изучали в пластинчатой реакции агглютинации с культурами бруцелл, изолированными от северных оленей из стад с различной эпизоотической обстановкой по бруцеллёзу.
Активность L-бруцеллёзных сывороток определяли общепринятыми методами [16]. Специфичность антигенов, изготовленных из L-форм бруцелл, определяли в реакции агглютинации (РА) и реакции сывороточного комплимента (РСК) с гипериммунными гетерологичны-ми (S-, R-) бруцеллёзными сыворотками, контролем служили культуры бруцелл в типичной (S-) и диссоциированной (SR-, R-, RS-) форме. В качестве антигенов использовали гомологичные культуры бруцелл в L-форме, полученные in vitro, и культуры бруцелл, изолированные от животных.
Производственное испытание L-бруцеллёзных сыворотки и антигенов проводили на поголовье северных оленей общей численностью 7917 голов, принадлежащих трём оленеводческим хозяйствам Ямало-Ненецкого автономного округа (СПК «Тазовский», СПК «Антипаютинский» Тазовского района и совхоз «Верх-непуровский» Пуровского района), оздоравливаемых от бруцеллёза. В качестве биоматериала для бактериологических исследований использовали кусочки паренхиматозных органов, лимфатических узлов, содержимое бурс, половые органы, плоды и околоплодную жидкость от 532 голов северных оленей всех половозрастных групп во время убойной Kowirahrn^ *s - культуры, которые агглютинировались в S-бруцеллёзной сыворотке; R -
а также кусочки пантов 224 культуры, которые агглютинировались в R-бруцеллёзной сыворотке, L- культуры, животных в период их мас- которые агглютинировались в L-бруцеллёзной сыворотке.
При использовании L-антигенов с гипериммунными бруцеллезными (S- и R-) сыворотками во всех разведениях получен отрицательный результат, что свидетельствует об их специфичности.
В ходе производственных испытаний все культуры, выделенные от северных оленей (от 756 гол. было выделено 237 изолятов) и отнесённые при первичной идентификации к роду Brucella классифицированы по агглютинабельным свойствам, как типичные (S-), диссоциированные (R-, SR-) и глубоко измененные (L-) формы бруцел (табл. 3).
Таблица 3. Результаты идентификации культур бруцелл, изолированных
Показатель Формы бруцелл
типичные диссоции- рованные изменённые
Условные обозначения
антигенных комплексов* S- R- SR- SL- RL- SRL- L-
Количество 53 38 36 2 16 25 67
Доля от общей численности, % 22,3 16 15,2 0,9 6,7 10,6 28,3
совой заготовки.
Биоматериал в зимнее время консервировали методом замораживания, летом - в 30 %-ном водном растворе глицерина и доставляли в лабораторию экологии ВНИИБТЖ для исследования.
Диагностические качества L-бруцеллёзных сывороток изучали в пластинчатой РА с культурами бруцелл, изолированными от животных.
Постановку и учет реакции проводили по методикам, регламентированным наставлением [16].
Сыворотку и антигены готовили в серийных разведениях и в необходимых объёмах вносили в пробирки для проведения реакций.
Результаты и обсуждение. Для производственного испытания были выбраны серии опытных образцов гипериммунных бруцеллёзных L-сывороток, которые при предварительном серологическом исследовании обладали диагностической активностью в разведении 1:25 или 1:50. Предельное рабочее разведение L-антигена, полученного физическим способом, в РА составило 1:100 (табл. 1). Следовательно, для диагностических исследований в РА необходимо использовать L-антиген в разведении 1:75.
Примерно половина культур идентифицирована как бруцеллы в типичной (53 культуры, или 22,3 %) или диссоциированной (74 культуры, или 31,2 %) форме. У остальных 110 культур (46,5 %) отмечали частичную или полную утрату ригидной клеточной стенки. У части из них (43 культуры, или 18,3 %) сохранялись поверхностные антигенные комплексы S- или R-форм. У остальных (67, или 28,2 %) отмечали наличие активного цитоплазматического антигена, выявляемого в реакции агглютинации с гомологичными L-сыворотками.
В ходе испытания опытных образцов антигенов, изготовленных из культур бруцелл в L-форме на поголовье северных оленей в очагах бруцеллёзной инфекции выявляли животных, пробы от которых реагируют со стандартными ^-) бруцеллёзными антигенами и также отмечали случаи положительных реакций (0,36 %) с антигенами, изготовленными из L-форм бруцелл.
Антигены, полученные из культур бруцелл в L-форме, обладают специфичностью и проявляют диагностическую активность в РСК 1:20...1:50 с гомологичными сыворотками.
Выводы. Производственные испытания специфических сывороток, изготовленных из бруцелл в L-форме показали, что использование их в комплексе бактери-
ологических исследований позволяет выявить допол- ют специфичностью и диагностической активностью в
нительно до 43 % культур бруцелл, персистирующих в РА и РСК. Использование L-бруцеллёзных антигенов
организме инфицированных животных в изменённом повышает диагностическую эффективность иссле-
состоянии. Антигены, изготовленные из L-форм бру- дований. Их можно применять в общем комплексе
целл физическими и химическими методами, облада- лабораторной диагностики бруцеллёза.
Литература:
1. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. - Кишинёв. - 1982. - С.243 - 251.
2. Косилов И.А., Аракелян П.К., Димов С.К. Бруцеллёз сельскохозяйственных животных. - Новосибирск. - 1999. - С.50 - 68.
3. Тимаков В.Д., Каган Г.Я. Биология L-форм бактерий. - М. - 1961. - С.176.
4. Прозоровский С.В., Кац Л.Н. L-формы бактерий. - М. - 1981. - 178с.
5. Триленко П.А. МВБ и L-формы бруцелл/ Труды//ЛВИ. - 1971. - Вып.32. - С.35.
6. Гордиенко Л.Н. Свойства изменённых форм бруцелл, изолированных от северных оленей в очагах «оленьего» бруцеллёза / Эпизоотология, диагностика и профилактика хронических инфекционных болезней животных: Сб.науч.тр. / СО РАСХН. ВНИИБТЖ. - Омск. - 2003. - С.222 - 225.
7. Бакулов И.А., Зеленцова Т.Я. Проблема L-форм в ветеринарии // Ветеринария. - 1980. - №10. - С.23 - 27.
8. Гордиенко Л.Н. Получение L-вариантов бруцелл и их морфология на разных стадиях трансформации / Вестник КрасГАУ. - Красноярск. - 2011. - №7. - С.141 - 143.
9. Ощепков В.Г., Гордиенко Л.Н., Милых Л.И. Изыскание специфических сывороток для индикации L-форм бруцеллёза / Бактериальные, вирусные и паразитарные заболевания с.-х. животных и птиц Сибири и Дальнего Востока // Сб.науч.тр. ОмСХИ. - Омск. - 1992. - С.93 - 100.
10. Ощепков В.Г., Гордиенко Л. Н. Получение и применение специфических сывороток для идентификации L-форм бруцелл // Паразиты и вызываемые ими болезни в Сибири // Тез. докл. 2-ой науч.конф. Новосибирского отделения Паразитологического общества РАН. - Новосибирск. - 1997. - С.86 - 87.
11. Санитарно-эпидемиологические правила. 1.3. Эпидемиология, безопасность работы с микроорганизмами I-II группы патогенности (опасности) СП 1.3.1285-03. - М., 2003. 61с.
12. Островская Н.Н., Грекова Н.А., Мирзаева М. Биологические свойства пенициллиновых сферопластов бруцелл // ЖМЭИ.- 1974. - №9. - С.130.
13. Ощепков В.Г., Гордиенко Л.Н., Братцев А.Ю. Способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в L-форме /Патент на изобретение № 268748. - М.,2006. - 6с.
14. Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных. Приказ Минздрава СССР 12.08.1977 N 755 « О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных. - М., 1977. - 7с.
15. Булдыгин Д.В., Гордиенко Л.Н., Шестаков В.А., Братцев А.Ю. Степень выраженности реакций организма лабораторных животных в зависимости от введения дозы L-культуры бруцелл // Матер. Всерос.науч.конф.факультета ветеринарной медицины НГАУ. - Новосибирск. - 2001. - С.133 - 134.
16. Наставление по диагностике бруцеллёза животных № 13 - 5 - 02/0850. Утв. Департаментом Ветеринарии Минсельхоза России 29.09.03г. - М.,2003. - 64с.
RESULTS OF PRODUCTION TEST DIAGNOSTICUMS MADE FROM L-FORM BRUCELLA L.G. Gordienko
Summary. The principal place is belong to the laboratory methods of studies in the complex diagnostic procedures for animal of brucellosis. The existing diagnostic agents can identify animals with persistent typical forms of the pathogenic organism. At the same time some of the animals infected with the modified (L) forms of Brucella remain undetected and pose a threat to susceptible livestock in herds. Production testing of diagnostic agents, made of Brucella in an L-shape, was carried out to determine its effectiveness and feasibility of the overall complex laboratory tests.
There were made experimental models of antigens and hyperimmune serum from reversibility Brucella strains transformed in vitro for the production tests.
The work was conducted in herds of reindeer disadvantaged brucellosis. There have found that L-antigens have specificity in the study of serum from healthy and infected animals.
The blood serum was studied in the agglutination test (RT) and the complement fixation reaction (CFT). The indication of cultures of Brucella was conducted in view of the typical and modified forms of Brucella in various stages of transformation.
There are shown of diagnostic activity L-antigens of Brucella with homologous antiserum at its breeding 1:20-1:50.
The use of L-antigens in the whole complex serological studies revealed an additional 0,36% of the animals carriers of brucella.
The L-serum permit additional to identify to 43% of Brucella in the study of cultures isolated from reindeer in the foci of infection.
It is established that the antigens and serum, made of Brucella in an L-shape, can be effectively used in the diagnosis of brucellosis in animals. Key words: brucella, L-forms, diagnosticums, prepared, production test, specifically, activity, identification, detection, cultures.
УДК 619:616-07:616.981.42:636.22/28
ДИАГГОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВШС^ R-БРУЦЕЛЛЕЗНЫХ АНТИГЕ^В ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ
КРУПШШ РGГАТGГG СТОТА
Л.В. ДЕГТЯРЕНКО, доктор ветеринарных наук, зав. сектором
М.Ю. КАРЛОВА, кандидат ветеринарных наук, младший научный сотрудник
ВНИИБТЖ Россельхозакадемии И.Н. КАЛИКИН, директор
ГУОО «Омская областная ветеринарная лаборатория
E-mail: vniibtg@rambler.ru
Резюме. Результаты производственных испытаний диагностической ценности R-бруцеллезных антигенов ВНИИБТЖ для реакции связывания комплемента (РСК) и реакции агглютинации (РА) при бруцеллезе крупного рогатого скота показали, что они обладают специфичностью и чувствительностью. R-бруцеллезные антигены можно применять в комплексе при дифференциальной диагностике и контроле иммунного ответа у крупного рогатого скота на введение диссоциированных слабоагглютиногенных вакцин из штаммов B. abortus 82 и 75/79-АВ. При этом контроль иммунного ответа
