РЕЗУЛЬТАТЫ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИТЕЛ К CYP11B2 ПРИ ПЕРВИЧНОМ ГИПЕРАЛЬДОСТЕРОНИЗМЕ

Романова Н.Ю.; Селиванова Л.С.; Платонова Н.М.; Бельцевич Д.Г.; Трошина Е.А.

Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии, Москва, Россия

Обоснование. Альдостерон-продуцирующая аденома (АПА) — наиболее частая причина диагностированного первичного гиперальдостеронизма (ПГА). Известно, что ключевым ферментом синтеза альдостерона, участвующим в патогенезе ПГА, является альдостеронсинтаза (CYP11B2). Недавние исследования показали, что различные факторы влияют на экспрессию и функцию CYP11B2 при АПА. В частности, соматические мутации, приводящие к повышенной и сниженной функции CYP11B2, были идентифицированы в нескольких генах, каждый из которых кодирует ключевой белок, влияющий на кальциевый сигнальный путь, экспрессию CYP11B2 и продукцию альдостерона. С другой стороны, CYP11B2 также катализирует превращение кортизола в 18-гидроксикортизол и впоследствии превращает 18-гидроксикортизол в 18-оксокортизол. Также в статье обсуждается клиническое значение 18-оксокортизола — важного биомаркера для диагностики ПГА. Соматические мутации в генах-драйверах альдостерона тесно связаны с экспрессией CYP11B2 и были обнаружены только в CYP11B2-положительной области опухоли, что указывает на неоднородную экспрессию CYP11B2 в опухолевых клетках.

Цель. Оценить экспрессию антител к CYP11B2 в новообразованиях коркового слоя надпочечников при первичном гиперальдостеронизме.

Материалы и методы. Ретроспективная оценка опухолей надпочечников, удаленных в ходе адреналэктомии, у пациентов с лабораторно подтвержденным ПГА (n=20). По данным мультиспиральной компьютерной томографии односторонняя аденома была выявлена у 19 пациентов (95% от общего числа), во всех случаях подтверждена односторонняя гиперпродукция альдостерона данными сравнительного селективного забора крови из надпочечни-ковых вен. На отобранных опухолях проводилось иммуногистохимическое исследование с использованием антител к CYP11B2. В соответствии со стандартными протоколами использовался biotin-free Bond Polymer Refine Detection system (Leica) с автоматизированной системой Bond max (Leica). В каждой опухоли было выбрано окрашенное поле, увеличенное в 200 раз. Эти поля были оцифрованы в виде изображений JPEG с использованием цифровой камеры (Leica, DFC 490). После чего была оценена экспрессия CYP11B2 в аденоме и в соседней коре надпочечников. Результаты. При иммуногистохимическом исследовании опухоли надпочечников у пациентов с ПГА (n=20) получена положительная экспрессия с антителом к CYP11B2 во всех случаях, при этом: в 50% случаев (n=10) — выявлена интенсивная реакция в опухоли и прилежащем корковом слое, в 10% случаев (n=2) — умеренная реакция в опухоли и прилежащем корковом слое, в 15% (n=3) — слабая реакция в опухоли и прилежащем корковом слое, а также в 25% случаев (n=5) — интенсивная реакция в прилежащем корковом слое более выражена, чем в опухоли надпочечника. Заключение. Доказана функциональная гетерогенность опухоли надпочечников при ПГА.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: первичный гиперальдостеронизм; альдостерон-продуцирующая аденома, альдостеронсинтаза, 18-оксокор-тизол.

THE RESULTS OF IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY OF ANTIBODIES TO CYP11B2 IN PRIMARY HYPERALDOSTERONISM

BACKGROUND: Aldosterone-producing adrenocortical adenoma (APA) is responsible for the majority of cases clinically diagnosed as primary aldosteronism. Aldosterone synthase (CYP11B2) is one of the enzymes that play essential roles in aldosterone synthesis and is involved in the pathogenesis of primary aldosteronism. Recent studies have demonstrated that various factors influence the expression and function of CYP11B2 in APA. In particular, somatic mutations, such as gain-of-function and loss-of-function mutations have been identified in several genes, each of which encodes a pivotal protein that affects the calcium signaling pathway, the expression of CYP11B2, and aldosterone production. On the other hand, CYP11B2 also catalyzes the conversion of cortisol to 18-hydroxycortisol and subsequently converts 18-hydroxycortisol to 18-oxocortisol. The article also discusses the clinical significance of 18-oxocortisol, an important biomarker for the diagnosis of primary aldosteronism. Somatic mutations in aldosterone-driver genes are strongly associated with CYP11B2 expression and have been only detected in the CYP11B2-positive tumor area, that indicating heterogeneous expression of CYP11B2 in tumor. AIM: to assess the functional heterogeneity of adrenal tumors in primary aldosteronism

MATERIALS AND METHODS: Retrospective evaluation adrenal tumors from patients with primary aldosteronism (n=20).

*Автор, ответственный за переписку / Corresponding author. Ожирение и метаболизм. - 2021. - Т. 18. - №3. - С. 245-253 doi: https://doi.org/10.14341/omet12741 Obesity and metabolism. 2021;18(3):245-253

According to CT unilateral macrohyperplasia was detected in 19 patients (95% of total), all of them were confirmed to have unilateral hyperproduction of aldosterone according to AVS. Selected tumors werestained with anty-CYP11B2 antibody. We evaluated the CYP11B2 expression in the adenoma and in the adjacent adrenal cortex.

RESULTS: Immunohistochemistry studies of the resected adrenals from 20 patients with PA operated due to unilateral production of aldosterone using CYP11B2 staining showed that 10 of those with an adenoma on CT scanning showed CYP11B2 staining in the adenoma. Furthermore, 5 cases of an unilateral adenoma, showed CYP11B2 staining in the adjacent adrenal cortex and an absence of staining for CYP11B2 in the adenoma. 5 cases showed CYP11B2 expression is heterogeneously immunolocalized throughout the tumor area.

CONCLUSION: Thus, the functional heterogeneity of adrenal tumors in primary aldosteronism has been proven. It is necessary to compare the data of immunohistochemical studies on the expression of CYP11B2 with the indicators of the level of 18-hydroxycortisol, 18-oxocortisol.

KEYWORDS: primary aldosteronism; aldosterone-producing adrenocortical adenoma; CYP11B2; gene mutation; transcription factor; 18-oxocortisol.

ОБОСНОВАНИЕ

Альдостеронсинтаза (АС) — фермент, кодируемый геном СУР11В2, принадлежит к семейству ци-тохрома Р450 и регулирует синтез гормона альдо-стерона. Ген расположен в области д21 8 хромосомы и состоит из девяти экзонов и восьми интронов [1]. Ген СУР11В2 катализирует последнюю стадию синтеза альдостерона из дезоксикортикостерона [2]. АС участвует в ключевых реакциях синтеза альдостеро-на — 11-гидроксилировании, 18-гидроксилировании и, наконец, 18-окислении [2]. Вначале происходит 11-бета-гидроксилирование 11-дезоксикортикостеро-на до кортикостерона, затем — 18-гидроксилирование кортикостерона до 18-гидроксикортикостерона и, наконец, 18-оксидирование 18-гидроксикортикостеро-на до альдостерона. Ген СУР11В2 кодирует ключевой фермент синтеза альдостерона 18-гидроксилазу, которая присоединяет гидроксильную группу (ОН) к С18 остатку [3]. Этот ген в высокой степени гомологичен гену СУР11В1, кодирующему также митохондриальный фермент 11-бета-гидроксилазу, который катализирует синтез кортизола в стероидогенезе [3]. Таким образом, заключительный и ключевой этап в биосинтезе альдостерона регулируется СУР11Б2.

В структуре надпочечника человека нет четкого разделения клубочковой и пучковой зон, и клетки с положительной экспрессией СУР11В2 присутствуют очагово в субкапсулярной области, а также в кластерах — альдостерон-продуцирующих клеточных кластерах (АПКК) [4]. При морфологическом исследовании эти кластеры имеют выраженную однородную иммунореактивность экспрессии СУР11В2 в клубоч-ковой зоне, которая простирается к пучковой зоне без экспрессии СУР11В1 [4]. При морфологическом исследовании надпочечников в норме в детском возрасте (0-11 лет) есть четкое распределение областей с экспрессией СУР11В2, занимающих большую часть клубочковой зоны, а также отсутствуют АПКК. Эта закономерность расположения зон надпочечника претерпевает изменения с возрастом, при этом в клубочко-вой зоне уменьшается экспрессия СУР11В2, в то время как число АПКК увеличивается [4].

Значительным достижением в патогенезе альдосте-рон-продуцирующей аденомы (АПА) является открытие соматических мутаций в активировании С белка калиевого канала С1КК4 [5], кодируемого геном КСЫ]5, который, как было показано, присутствует в 35-70% случа-

ев [6-8]. Более высокая распространенность мутации была обнаружена у лиц Восточной Азии [6, 7]. Мутации в ионных каналах, включая мутации в гене ATP1A1 (аль-фа-субъединица 1 АТФазы), гене ATP2B3 и субъединице кальциевого канала Cav1.3 (ген CACNA1D), объясняют приблизительно 50-80% случаев АПА [9]. В некоторых случаях односторонней гиперпродукции альдостеро-на с микро- или макронодулярной гиперплазией могут встречаться различные мутации в ионных каналах [10]. Интересно, что частота мутаций CACNA1D и ATP1A1 при АПКК достигает 30%, но при этом АПКК с мутацией KCNJ5 не были обнаружены [11].

Одним из механизмов гиперпродукции альдостерона в АПА является повышенная экспрессия CYP11B2 [12]. Исследование Bassett et al. (2005) с использованием микрочипа и количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) обратной транскриптазы показало, что уровни мРНК CYP11B2 пвыше в АПА в сравнении с мРНК в нормальной ткани надпочечников [12]. Кроме того, экспрессия CYP11B2 в АПА в недавнее время изучена из-за наличия CYP11В2-специфического моноклональ-ного антитела [13]. Аминокислотная последовательность CYP11B2 на 93% идентична 110-гидроксилазе (CYP11B1), которая участвует в заключительном этапе синтеза кортикостерона [14]. Gomez-Sanchez et al. разработали специфические моноклональные антитела к CYP11B1 и CYP11B2, что позволило проводить анализ экспрессии CYP11B1 и CYP11B2 в ткани АПА [13]. В другом исследовании было показано, что уровень экспрессии CYP11B1 значительно ниже, в то время как CYP11B2 значимо выше в АПА меньшего размера, чем в АПА большего размера [15]. Кроме того, была выявлена корреляция уровня экспрессии CYP11B1 с размерами опухоли, в то время как экспрессия CYP11B2 имела обратную корреляцию [15]. Эти открытия легли в основу предположения, что оба фермента, CYP11B1 и CYP11B2, играют определенную роль в продукции альдостерона в АПА. Кроме того, существует небольшое число опухолевых клеток, коэкс-прессирующих CYP11B1/B2 (гибридная клетка типа А), гибридные гены CYP11B2/17 (гибридная клетка типа B), CYP11B1/17 (гибридная клетка типа C) и CYP11B1/B2/17 в АПА [16].

Следовательно, существует гипотеза о том, что АПА состоит из гетерогенных клеток или же из смеси кортикальных клеток разных зон надпочечника. Кроме того, эти гибридные клетки могут представлять собой происхождение «автономных» опухолевых клеток, образующих АПА.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценить экспрессию антител к СУР11В2 в новообразованиях коркового слоя надпочечников при первичном гиперальдостеронизме (ПГА).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Место проведения. Все клинические, лабораторные и инструментальные манипуляции, выполненные в рамках данного исследования, были проведены на базе одного учреждения (ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России, Москва) в 2017-2019 гг.

Время исследования. В исследовании использовали биологический материал пациентов, прооперированных с 2017 по 2019 гг. по поводу альдостеромы.

Изучаемые популяции

В исследование вошли пациенты с альдостеромой, верифицированной данными сравнительного селективного забора крови из надпочечниковых вен (ССВЗК).

Критерии включения:

• подтвержденный диагноз ПГА [1];

• возраст старше 18 лет.

Критерии исключения: в исследование не были включены и не подвергались анализу ткани: в случае малого количества ткани опухоли, предоставленной для морфологического исследования; опухоли надпочечника с обильными кровоизлияниями различной степени давности.

Способ формирования выборки из изучаемой

популяции (или нескольких выборок из нескольких

изучаемых популяций)

Простая случайная выборка.

Дизайн исследования

Проведено одноцентровое интервенционное одномоментное одновыборочное неконтролируемое исследование.

Методы

Для иммуногистохимического исследования были отобраны достаточные по объему образцы опухолей надпочечников пациентов с подтвержденным диагнозом ПГА — уровень альдостерон-ренинового соотношения более 91 пмоль/мЕд, постинфузионный уровень альдостерона более 277 пмоль/л в ходе теста с физиологическим раствором и/или уровень альдостерона крови более 550 пмоль/л в сочетании с низким уровнем прямого ренина плазмы крови и гипокалиемией у пациентов в возрасте до 35 лет. Хирургическое вмешательство проводилось у пациентов с лабораторно подтвержденным ПГА. В качестве визуализирующего метода пациентам проведена мультиспиральная компьютерная томография (МСКТ) надпочечников. Средний размер образования составлял 2 см (1,5-3), плотность — от -1 до +10 Ни. В случаях одностороннего образования по данным МСКТ у пациентов старше 35 лет и при двусторонних образованиях надпочечников с целью уточнения латерализации гиперсекреции альдостерона проводился ССВЗК в утренние часы.

Материал, полученный от пациентов, фиксировали в 10% забуференном формалине, обрабатывали в аппарате гистологической проводки фирмы Leica и заливали в парафин. Суммарное время фиксации, проводки и заливки материала не превышало, как правило, 48 ч. Затем готовили серийные срезы (не менее 10) толщиной 3-4 мкм, которые помещали на полилизиновые стекла (Leica, Германия) и инкубировали в термостате при температуре 370C в течении 12 ч. Далее срезы депарафини-ровали последовательно в ряде растворов, состоящих из 3 ксилолов, 2 абсолютных спиртов, 80% и 70% спирта и дистиллированной воды. Затем препараты окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Исследование проводили на полностью автоматизированном иммуногистостейнере Leica Bond max (Германия), позволяющем депарафинизировать срезы, проводить инкубацию с антителами при постоянной заданной температуре, проводить энзиматическую демаскировку антигенов, высокотемпературную демаскировку антигенов в буфере pH 7,2, подкрашивать препараты гематоксилином. Исследование проводилось по стандартным протоколам, рекомендованным фирмой-производителем с антителами CYP11B2 (PA5-61902) Thermo Fisher Scientific, использовали разведение 1:100.

Для иммуногистохимических реакций ставили положительные и отрицательные контроли, которые выбирали в соответствии со спецификациями от фирмы-производителя. При микроскопическом исследовании обработанных иммуногистохимическим методом тканей аденом с увеличением х200 на каждом срезе было выбрано поле с максимальной реакцией. Полуколичественным методом оценивали долю (в процентах) позитивно окрашенных клеток в опухоли надпочечника и прилежащей ткани. Оценка им-муногистохимической реакции проводилась полуколичественным методом в баллах по количеству позитивно окрашенных клеток. Оценку интенсивности реакции проводили в опухоли и прилежащем корковом слое надпочечника по 3-бальной шкале: 3 балла — от 80 до 100% окрашенных клеток; 2 балла — от 40 до 80% окрашенных клеток; 1 балл — до 40% окрашенных клеток. Фиксацию цифровых изображений выбранных полей проводили с помощью камеры Leica DFC 490. Для обработки цифровых изображений использовали программное обеспечение Leica Application Suite V3. Все препараты были отсканированы на сканирующей системе Leica.

Основным исходом исследования считалось наличие или отсутствие экспрессии антител к CYP11B2 в ткани новообразования коры надпочечника полуколичественным методом.

Этическая экспертиза

Одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России (протокол No8 от 25.04.18). Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В работу было включено 20 альдостером, при макроскопическом исследовании которых в корковом слое надпочечника чаще обнаруживали одиночный, хорошо очерченный узел охряно-желтого цвета небольших

Таблица 1. Клинико-морфологические характеристики пациентов.

■fl

1- <j ¡5

О О X

1-X fS 2 1- X IB и X IB и < .fl i- X 1-X <v X s о a г и 2 к а i= s с S и ¡с X (N GQ

<v £ IB E Е u ■ о 5 С IB a <v i- О .а X с >!S .с о 1- IB 2 £ S

s J IB P s a m О Z ■i о с о et < а 2 et < а 2 l-s с z ■i Q с 2 о et ■fl С с о 2 S X ф "¡1 Ш и CL S С IB с о 2 m О л CL >-

с s CQ с и 2 ES 2 ES sc < с CL 2 < 2 S и

1 31,8 54 м 180 85 10 3 455 0,04 11,3 3,7 аденома +

2 32,3 50 ж 225 100 3 5 972 0,73 1,315 2,6 аденома +

3 22,8 62 ж 210 100 19 3 1160 2,8 414 2,9 аденома +

4 31,6 70 м 220 110 20 4 970 0,8 1212 2,8 аденома +

5 23,3 35 ж 200 120 3 1 1660 0,78 2128 2,8 аденома +

6 43,4 60 ж 300 150 9 2 1400 1,72 813 2,4 аденома +

7 26,0 63 ж 170 115 7 3 452 2,034 222 3,9 аденома +

8 35,7 52 ж 160 90 20 2 750 1,37 547 3,3 аденома +

9 21,4 32 ж 150 100 1 1 2270 1,2 1897 3,5 аденома +

10 24,2 49 ж 300 200 1 1 27700 3,1 8935 2,0 аденома +

11 20,3 36 ж 250 140 7 1 2770 10,1 274 2,2 аденома +

12 23,2 52 ж 200 100 9 4 2770 0,5 5540 2,4 аденома +

13 31,1 46 ж 180 100 10 3 396 0,82 482 3,8 аденома +

14 20,6 41 ж 170 100 10 4 971 0,5 1942 2,6 аденома +

15 20,8 40 ж 170 100 2 2 805 2,3 350 3,6 аденома +

16 24,9 55 ж 240 120 12 3 378 0,5 756 3,4 аденома +

17 32,3 31 м 260 140 3 4 846 5,2 162 2,7 аденома +

18 31,7 64 м 220 120 20 4 1130 0,5 2260 3 аденома +

19 18,5 35 ж 220 120 2 3 1960 0,51 3843 2,3 аденома +

20 30,2 56 м 215 120 26 3 282 0,1 2820 2,6 аденома +

размеров (обычно не более 2,0 см). Клинико-морфологи-ческие характеристики пациентов сведены в табл. 1.

При микроскопическом исследовании опухоли состояли преимущественно из светлых, богатых липидами клеток, напоминающих клетки пучковой зоны коры надпочечника, местами отмечались признаки внутриопухо-левой гетерогенности: среди участков, представленных зрелыми мономорфными клетками коры, встречались очаги с выраженным клеточным и ядерным полиморфизмом. Прилежащий корковый слой надпочечника, как правило, не характеризовался признаками атрофии. При оценке злокачественного потенциала по шкале Weiss все опухоли имели сумму баллов 0.

В результате иммуногистохимического исследования во всех опухолях (n=20) получена положительная экспрессия с антителами к CYP11B2, при этом: в 50% случаев (n=10) — выявлена интенсивная реакция в опухоли и прилежащем корковом слое, в 10% случаев (n=2) — умеренная реакция в опухоли и прилежащем корковом слое, в 15% (n=3) — слабая реакция в опухоли и прилежащем корковом слое, а также в 25% случаев (n=5) — интенсивная реакция в прилежащем корковом слое более выражена, чем в опухоли надпочечника (рис. 1, 2). CYP11B2 обычно характеризовался диффузным окрашиванием, но в части случаев отмечалась неоднородная очаговая экспрессия.

ОБСУЖДЕНИЕ

Сопоставление с другими публикациями

Внутриопухолевая гетерогенность при АПА достаточно изучена и является актуальной темой, представляющей интерес в этой области. АПА обладает внутриопухолевой гетерогенностью в клеточной морфологии и молекулярной физиологии [17]. Интересно, что соматические мутации САСУА10:Р747С, КСШ5:1_168Р! и АГР1А1:И04П были обнаружены только в СУР11В2-позитивной области опухоли [18]. СУР11В2 в опухолевых тканях обычно иммуно-локализованы диффузно, неоднородно. Было показано, что примерно 15% АПА имеют выраженную гетерогенность в СУР11В2-позитивной и негативной областях [18]. В исследовании ЫапЬа et а1. (2016) сообщили, что только в одном случае были обнаружены различные соматические мутации генов в одной и той же опухоли в различных СУР11В2-позитивных участках [18] Однако не было подтверждено наличие этих мутаций в генах-драйверах альдостерона. Эти соматические генные мутации играют существенную роль в автономной секреции альдостеро-на и могут быть ассоциированы с туморогенезом; однако патофизиология остается спорной и требует дальнейшего изучения. Наличие факторов транскрипции гена СУР11В2 считается ключевым моментом патофизиологии АПА.

Рисунок 1. Интенсивная реакция антител к СУР11В2 с экспрессией и в опухоли, и в окружающей коре. А — альдостерома. Интенсивная реакция антител к СУР11В2 с экспрессией и в опухоли, и в окружающей коре. Окрашивание гематоксилином и эозином. Увеличение х 50.

Б — альдостерома. Интенсивная реакция антител к СУР11В2 с экспрессией и в опухоли, и в окружающей коре. Увеличение х 50. В — альдостерома. Интенсивная реакция антител к СУР11В2 с экспрессией и в опухоли, и в окружающей коре. Увеличение х 100.

Рисунок 2. Интенсивная реакция антител к СУР11В2 с экспрессией в прилежащей коре надпочечника, умеренная в опухоли. А — альдостерома. Интенсивная реакция антител к СУР11В2 с экспрессией в прилежащей коре надпочечника, умеренная в опухоли. Увеличение х 50.

Б — альдостерома. Интенсивная реакция антител к СУР11В2 с экспрессией в прилежащей коре надпочечника, умеренная в опухоли. Окрашивание гематоксилином и эозином. Увеличение х 100.

Клиническое значение СУР11В2

Биосинтез альдостерона происходит в клубочковой зоне надпочечников через множество ферментативных реакций из холестерина. Большинство ферментов, участвующих в биосинтезе альдостерона, также экспресси-руются в пучковой зоне, однако терминальный фермент биосинтеза альдостерона СУР11В2 экспрессируется только в клубочковой зоне, в то время как СУР11В1 — только пучковой и сетчатой зонах [19, 20]. Наличие СУР11В2 верифицирует клетки надпочечников, которые вырабатывают альдостерон. В пучковой зоне надпочечника имеется два уникальных фермента — СУР17А1 и СУР11В1; которые отвечают за синтез кортизола. Первые специфические поликлональные антитела к СУР11В1 и СУР11В2 были описаны Нишимото и использовались для иммуногисто-химии с низкой амплификацией [21]. Высокоспецифичные моноклональные антитела затем были широко изучены и в настоящее время используются для иммуногистохими-ческого исследования надпочечников, полученных в ходе адреналэктомии у пациентов с ПГА [22-24].

Недавние исследования также осветили еще одну характеристику СУР11В2 — это участие в преобразовании кортизола в 18-оксокортизол (18охоР) [25]. 18-оксо-кортизол — это так называемый «гибридный стероид», т.к. в своей структуре имеет особенности как глюкокор-

тикоидов, так и минералокортикоидов [25]. Шск et а1. (1983) впервые сообщили о наличии 18охоР в тканях надпочечников, но в небольшом количестве [26]. Однако у пациентов с глюкокортикоид-зависимым гипе-ральдостеронизмом (редкая разновидность ПГА, проявляющаяся аутосомно-доминантным наследованием) отмечается чувствительность секреции альдостерона к АКТГ и более высоким уровнем 18охоР вследствие генетической рекомбинации между СУР11В1 и СУР11В2 (химерный ген СУР11В1/ СУР11В2) [27].

Разработка антител к альдостеронсинтетазе СУР11В2 позволила охарактеризовать нормальную ткань надпочечника и удаленную в ходе адреналэктомии у пациентов с ПГА [28]. В нормальной ткани надпочечника присутствуют два типа клеточной экспрессии СУР11В2: относительно равномерная экспрессия фермента по всей клубочковой зоне и группы клеток, экспресси-рующие СУР11В2, называемые АПКК. Существует также группа клеток внутри АПА, которые экспрессируют различные ферменты, в отличие от нормальной ткани надпочечника [27]. Примерно у 30% пациентов с односторонним вариантом ПГА не визуализируется АПА, но при этом наблюдаются либо микроаденомы с положительной экспрессией СУР11В2, либо гиперплазия клубочко-вой зоны [28].

Иммуногистохимическое исследование при ПГА.

ССВЗК используется для уточнения латерализации гиперсекреции альдостерона. В большинстве случаев односторонняя выработка альдостерона возникает вследствие АПА обычно больше 0,5 см в диаметре, что видно на исследовании МСКТ. Существуют данные, что одновременно при АПА в надпочечнике также могут присутствовать АПКК в гиперплазированной клубочко-вой зоне [29-31]. Односторонняя гиперсекреция при ПГА может быть обусловлена и более редкими формами. Одностороннюю гиперплазию надпочечника, на которую приходится 2-3% ПГА, следует заподозрить в случае выявления латерализации по данным ССВЗК в отсутствии изменений на КТ [32]. Кроме того, в 1% случаев ПГА обсу-ловлен альдостерон-продуцирующей карциномой [32].

У пациентов с более крупными по размерам аденомами выработка альдостерона обычно больше, чем у пациентов с таковыми, меньшими по размерам [33]. В исследовании Опо et а1. [33] в группе пациентов с более крупными аденомами площадь опухоли была в 9 раз больше, чем в группе меньших аденом, однако концентрация альдостерона в плазме была всего в 2,0-2,5 раза выше в группе пациентов с большими аденомами. Таким образом, продукция альдостерона гораздо больше в опухолях, меньших по размеру аденом, а также более высокая экспрессия СУР11В2 наблюдалась в группе меньших опухолей [33]. Кроме того, количество имму-нореактивных клеток с экспрессией СУР11В2 в группе более крупных аденом было очень вариабельно, причем некоторые аденомы проявляли относительно однородную экспрессию в сравнении с гетерогенной экспрессией фермента в других клетках с большим количеством иммунореактивно-отрицательных клеток [33]. Экспрессия других ферментов, в том числе СУР17А1, была ниже в группе меньших аденом [33].

Многие АПА проявляют внутриопухолевую гетерогенность экспрессии ферментов, которые обычно специфичны для определенной зоны надпочечников. В недавнем исследовании с использованием двойной и тройной иммунофлуоресценции окрашивания АПА с антителами к СУР11В2, СУР11В1 и СУР17А1 Ыакатига et а1. [34] показали, что существуют клетки ко-экспрессии СУР11В2 и СУР11В1 (2,1%), СУР11В2 и СУР17А1 (0,6%), СУР11В1 и СУР17А1 (0,6%) и небольшое количество тройных им-мунореактивно-окрашенных клеток (0,03%). Однако пропорции смешанных иммунофлуоресцентных клеток были очень вариабельны между аденомами. Наличие клеток, которые совместно экспрессируют СУР11В2 и СУР17А1, вероятно, объясняет повышенную секрецию гибридных стероидов — 18-гидроксикортизола и 18-ок-сокортизола [35].

Таким образом, изучение экспрессии альдостерон-синтазы, которая осуществляет последние этапы биосинтеза альдостерона, подтверждает значительную сложность в гистологических особенностях надпочечников при ПГА. В то время как нормальный надпочечник имеет характерную экспрессию стероидных гормонов определенными зонами, многие аденомы характеризуются неупорядоченным стероидогенезом и, как следствие, появлением гибридных стероидов. Вариабельность гистопатологических особенностей аденом и одновременное наличие АПКК повышают вероятность того, что

большинство случаев односторонней продукции альдостерона на самом деле может представлять собой двустороннюю асимметричную узловую гиперплазию, часто вследствие соматических мутаций.

Клиническая значимость результатов

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

В ходе данного пилотного исследования, включавшего 20 пациентов, было показано наличие экспрессии с антителами к СУР11В2 в альдостеромах различной морфологической структуры. При этом альдостеромы характеризовались как морфологической, так и иммуногисто-химической внутриопухолевой гетерогенностью.

Ограничения исследования

К основным ограничениям исследования относятся довольно небольшой объем выборки, а также отсутствие оценки экспрессии антител к СУР11В1 и СУР11В2 в корти-зол-альдостерон-продуцирующих аденомах, что не входило в протокол настоящего исследования.

Направления дальнейших исследований

Целесообразно исследование стероидов конечного звена синтеза альдостерона, таких как 18-гидроксикор-тикостерон, 18-гидроксикортизол, 18-оксокортизол, методом ВЭЖХ-МС для уточнения дефекта стероидогенеза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подтверждено наличие экспрессии антител к СУР11В2 в альдостеромах, что позволяет верифицировать АПА. Полученные данные могут служить основой для дальнейших исследований экспрессии антител к СУР11В2 в аденомах надпочечников с целью анализа ее взаимосвязи с морфологическими и иммуногистохимическими характеристиками опухолей и роли в прогнозе заболеваний.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Исследование выполнено в рамках темы научно-исследовательской работы «Клинико-патогенетиче-ские механизмы и факторы, определяющие развитие кардиомиопатий при сахарном диабете и других эндокринопатиях», регистрационный номер: АААА-А20-120011790178-1 на 2020-2022 гг.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Романова Н.Ю. — существенный вклад в получение, анализ данных, написание статьи, ведение пациентов; Селиванова Л.С. — существенный вклад в получение, анализ данных и интерпретацию результатов, гистологическое, иммуногистохимическое исследование опухолей, подготовку иллюстративного материала; Платонова Н.М. — существенный вклад в концепцию исследования, внесение в рукопись правки с целью повышения научной ценности статьи; Бельцевич Д.Г. — существенный вклад в дизайн исследования, ведение пациентов, внесение в рукопись правки с целью повышения научной ценности статьи; Трошина Е.А. — существенный вклад в концепцию исследования, внесение в рукопись правки с целью повышения научной ценности статьи. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES

1. Funder JW, Carey RM, Mantero F, et al. The Management of Primary Aldosteronism: Case Detection, Diagnosis, and Treatment: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab. 2016;101(5):1889-1916. doi: https:IIdoi.orgI10.1210Ijc.2015-4061

2. Curnow KM, Tusie-Luna M-T, Pascoe L, et al. The Product

of the CYP11B2 Gene Is Required for Aldosterone Biosynthesis in the Human Adrenal Cortex. Mol Endocrinol. 1991;5(10):1513-1522. doi: https:IIdoi.orgI10.1210Imend-5-10-1513

3. Reincke M, Fischer E, Gerum S, et al. Observational Study Mortality in Treated Primary Aldosteronism. Hypertension. 2012;60(3):618-624. doi: https:IIdoi.orgI10.1161IHYPERTENSIONAHA.112.197111

4. Nishimoto K, Seki T, Hayashi Y, et al. Human Adrenocortical Remodeling Leading to Aldosterone-Producing Cell Cluster Generation. Int J Endocrinol. 2016;2016:1-6.

doi: https:IIdoi.orgI10.1155I2016I7834356

5. Choi M, Scholl UI, Yue P, et al. K+ Channel Mutations

in Adrenal Aldosterone-Producing Adenomas and Hereditary Hypertension. Science (SC-). 2011;331(6018):768-772. doi: https:IIdoi.orgI10.1126Iscience.1198785

6. Williams TA, Monticone S, Mulatero P. KCNJ5 Mutations Are the Most Frequent Genetic Alteration

in Primary Aldosteronism. Hypertension. 2015;65(3):507-509. doi: https:IIdoi.orgI10.1161IHYPERTENSIONAHA.114.04636

7. Fernandes-Rosa FL, Williams TA, Riester A, et al. Genetic Spectrum and Clinical Correlates of Somatic Mutations in Aldosterone-Producing Adenoma. Hypertension. 2014;64(2):354-361.

doi: https:IIdoi.orgI10.1161IHYPERTENSIONAHA.114.03419

8. Taguchi R, Yamada M, Nakajima Y, et al. Expression and Mutations of KCNJ5 mRNA in Japanese Patients with Aldosterone-Producing Adenomas. J Clin Endocrinol Metab. 2012;97(4):1311-1319.

doi: https:IIdoi.orgI10.1210Ijc.2011-2885

9. Scholl UI, Stölting G, Nelson-Williams C, et al. Recurrent gain

of function mutation in calcium channel CACNA1H causes early-onset hypertension with primary aldosteronism. Elife. 2015;4. doi: https:IIdoi.orgI10.7554IeLife.06315

10. Yamazaki Y, Nakamura Y, Omata K, et al. Histopathological classification of cross-sectional image-negative hyperaldosteronism. J Clin Endocrinol Metab. 2017;102:1182-1192. doi: https:IIdoi.orgI10.1210Ijc.2016-2986

11. Nishimoto K, Tomlins SA, Kuick R, et al. Aldosterone-stimulating somatic gene mutations are common in normal adrenal glands. Proc Natl Acad Sci. 2015;112(33):E4591-E4599. doi: https:IIdoi.orgI10.1073Ipnas.1505529112

12. Bassett MH, Mayhew B, Rehman K, et al. Expression Profiles for Steroidogenic Enzymes in Adrenocortical Disease. J Clin Endocrinol Metab. 2005;90(9):5446-5455. doi: https:IIdoi.orgI10.1210Ijc.2005-0836

13. Gomez-Sanchez CE, Qi X, Velarde-Miranda C, et al. Development of monoclonal antibodies against human CYP11B1 and CYP11B2. Mol Cell Endocrinol. 2014;383(1-2):11 1-117.

doi: https:IIdoi.orgI10.1016Ij.mce.2013.11.022

14. Nakamura Y, Felizola SJA, Satoh F, et al. Dissecting the molecular pathways of primary aldosteronism. Pathol Int. 2014;64(10):482-489. doi: https:IIdoi.orgI10.1111Ipin.12200

15. Ono Y, Nakamura Y, Maekawa T, et al. Different Expression of 11ß-Hydroxylase and Aldosterone Synthase Between Aldosterone-Producing Microadenomas

and Macroadenomas. Hypertension. 2014;64(2):438-444. doi: https:IIdoi.orgI10.1161IHYPERTENSIONAHA.113.02944

16. Nakamura Y, Kitada M, Satoh F, et al. Intratumoral heterogeneity of steroidogenesis in aldosterone-producing adenoma revealed by intensive double- and triple-immunostaining for CYP11B2IB1 and CYP17. Mol Cell Endocrinol. 2016;422:57-63. doi: https:IIdoi.orgI10.1016Ij.mce.2015.11.014

17. Романова Н.Ю., Селиванова Л.С., Платонова Н.М.,

и др. Иммуногистохимическиехарактеристики аденом надпочечников при первичном гиперальдостеронизме/ Сборник тезисов VIII (XXVI) Национального конгресса эндокринологов с международным участием «Персонализированная медицина и практическое здравоохранение». 2019. С. 278. [Romanova NYu, Selivanova LS, Platonova NM, et al. Immunogistokhimicheskie kharakteristiki adenom nadpochechnikovpri pervichnom

giperal'dosteronizme. In: Sbornik tezisov VIII (XXVI) Natsional'nogo kongressa endokrinologov s mezhdunarodnym uchastiem «Personalizirovannaya meditsina i prakticheskoezdravookhranenie». 2019. P. 278. (In Russ.)].

18. Nanba K, Chen AX, Omata K, et al. Molecular Heterogeneity in Aldosterone-Producing Adenomas. J Clin Endocrinol Metab. 2016;101(3):999-1007. doi: https://doi.org/10.1210/jc.2015-3239

19. Miller WL, Auchus RJ. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr Rev. 2011;32(1):81-151. doi: https://doi.org/10.1210/er.2010-0013

20. Hattangady NG, Olala LO, Bollag WB, Rainey WE. Acute and chronic regulation of aldosterone production. Mol Cell Endocrinol. 2012;350(2):151-162. doi: https://doi.org/10.1016/j.mce.2011.07.034

21. Nishimoto K, Nakagawa K, Li D, et al. Adrenocortical Zonation in Humans under Normal and Pathological Conditions. J Clin Endocrinol Metab. 2010;95(5):2296-2305. doi: https://doi.org/10.1210/jc.2009-2010

22. Yamazaki Y, Nakamura Y, Omata K, et al. Histopathological classification of cross-sectional image negative hyperaldosteronism. J Clin Endocrinol Metab. 2017;102:1182-1192. doi: https://doi.org/10.1210/jc.2016-2986

23. Nakamura Y, Maekawa T, Felizola SJA, et al. Adrenal CYP11B1/2 expression in primary aldosteronism: Immunohistochemical analysis using novel monoclonal antibodies. Mol Cell Endocrinol. 2014;392(1-2):73-79. doi: https://doi.org/10.1016/j.mce.2014.05.002

24. Teo AE Der, Garg S, Johnson TI, et al. Physiological and Pathological Roles in Human Adrenal of the Glomeruli-Defining Matrix Protein NPNT (Nephronectin). Hypertension. 2017;69(6):1207-1216.

doi: https://doi.org/10.1161/HYPERTENSIONAHA.117.09156

25. Freel EM, Shakerdi LA, Friel EC, et al. Studies on the Origin

of Circulating 18-Hydroxycortisol and 18-Oxocortisol in Normal Human Subjects. J Clin Endocrinol Metab. 2004;89(9):4628-4633. doi: https://doi.org/10.1210/jc.2004-0379

26. Ulick S, Chu MD, Land M. Biosynthesis

of 18-oxocortisol by aldosterone-producing adrenal tissue. J Biol Chem. 1983;258(9):5498-5502. doi: https://doi.org/10.1016/S0021-9258(20)81918-8

27. Takeda Y. Genetic Analysis of Aldosterone Synthase in Patients with Idiopathic Hyperaldosteronism. J Clin Endocrinol Metab. 1999;84(5):1633-1637. doi: https://doi.org/10.1210/jc.84.5.1633

28. Omura M, Sasano H, Saito J, et al. Clinical Characteristics

of Aldosterone-Producing Microadenoma, Macroadenoma, and Idiopathic Hyperaldosteronism in 93 Patients with Primary Aldosteronism. Hypertens Res. 2006;29(11):883-889. doi: https://doi.org/10.1291/hypres.29.883

29. Boulkroun S, Samson-Couterie B, Dzib J-FG, et al. Adrenal Cortex Remodeling and Functional Zona Glomerulosa Hyperplasia

in Primary Aldosteronism. Hypertension. 2010;56(5):885-892. doi: https://doi.org/10.1161/HYPERTENSIONAHA.110.158543

30. Nanba K, Tsuiki M, Sawai K, et al. Histopathological Diagnosis

of Primary Aldosteronism Using CYP11B2 Immunohistochemistry. J Clin Endocrinol Metab. 2013;98(4):1567-1574. doi: https://doi.org/10.1210/jc.2012-3726

31. Nanba AT, Nanba K, Byrd JB, et al. Discordance between imaging and immunohistochemistry in unilateral primary aldosteronism. Clin Endocrinol (Oxf). 2017;87(6):665-672. doi: https://doi.org/10.1111/cen.13442

32. Chao C-T, Wu V-C, Kuo C-C, et al. Diagnosis and management of primary aldosteronism: An updated review. Ann Med. 2013;45(4):375-83. doi: https://doi.org/10.3109/07853890.2013.785234

33. Ono Y, Nakamura Y, Maekawa T, et al. Different expression of 11beta-hydroxylase and aldosterone synthase between aldosterone-producing microadenomas and macroadenomas. Hypertension. 2014;64:438-444.

34. Nakamura Y, Kitada M, Satoh F, et al. Intratumoral heterogeneity of steroidogenesis in aldosterone-producing adenoma revealed by intensive double- and triple-immunostaining for CYP11B2/B1 and CYP17. Mol Cell Endocrinol. 2016;422:57-63. doi: https://doi.org/10.1016/j.mce.2015.11.014

35. Mulatero P, di Cella SM, Monticone S, et al. 18-Hydroxycorticosterone, 18-Hydroxycortisol, and 18-Oxocortisol in the Diagnosis

of Primary Aldosteronism and Its Subtypes. J Clin Endocrinol Metab. 2012;97(3):881-889. doi: https://doi.org/10.1210/jc.2011-2384

ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ [AUTHORS INFO]:

"Романова Наталья Юрьевна [Natalia Yu. Romanova, MD]; адрес: ул. Дмитрия Ульянова, д. 11, 117036 Москва, Россия [address: 11 Dm. Ulyanova street, 117036 Moscow, Russia]; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9117-4908; eLibrary SPIN: 5288-2968; e-mail: [email protected]

Селиванова Лилия Сергеевна, к.м.н. [Liliya S. Selivanova, MD, PhD]; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6891-0009; eLibrary SPIN: 5151-3675; e-mail: [email protected]

Платонова Надежда Михайловна, д.м.н. [Nadezhda M. Platonova, MD, PhD]; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6388-1544; eLibrary SPIN: 4053-3033; e-mail: [email protected]

Бельцевич Дмитрий Германович, д.м.н., профессор [Dmitriy G. Beltsevich, MD, PhD, professor]; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7098-4584; eLibrary SPIN: 4475-6327; e-mail: [email protected] Трошина Екатерина Анатольевна, д.м.н., профессор [Ekaterina A. Troshina, MD, PhD, professor]; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-8520-8702; eLibrary SPIN: 8821-8990; e-mail: [email protected]

"Автор, ответственный за переписку / rarresponding author.

ЦИТИРОВАТЬ:

Романова Н.Ю., Селиванова Л.С., Платонова Н.М., Бельцевич Д.Г., Трошина Е.А. Результаты иммуногистохимического исследования антител к CYP11B2 при первичном гиперальдостеронизме // Ожирение и метаболизм. — 2021. — Т. 18. — №3. — C. 245-253. doi: https://doi.org/10.14341/omet12741

TO CITE THIS ARTICLE:

Romanova NY, Selivanova LS, Platonova NM, Beltsevich DG, Troshina EA. The results of immunohistochemical study of antibodies to CYP11B2 in primary hyperaldosteronism. Obesity and metabolism. 2021;18(3):245-253. doi: https://doi.org/10.14341/omet12741

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Романова Н. Ю., Селиванова Л. С., Платонова Н. М., Бельцевич Д. Г., Трошина Е. А.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Романова Н. Ю., Селиванова Л. С., Платонова Н. М., Бельцевич Д. Г., Трошина Е. А.

THE RESULTS OF IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY OF ANTIBODIES TO CYP11B2 IN PRIMARY HYPERALDOSTERONISM

Текст научной работы на тему «РЕЗУЛЬТАТЫ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИТЕЛ К CYP11B2 ПРИ ПЕРВИЧНОМ ГИПЕРАЛЬДОСТЕРОНИЗМЕ»