CC BY
3
УДК 616-092.4:615.012:577.15.01 DOI 10.31684/25418475-2023-4-68
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ ПО РАЗРАБОТКЕ ВЫСОКООЧИЩЕННОЙ ГИАЛУРОНАТ-ЭНДО-0-N-АЦЕТИЛГЕКСОЗАМИНИДАЗЫ В КАЧЕСТВЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ ДЛЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА
1Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии -филиал Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск
630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
2Новосибирский государственный медицинский университет, г. Новосибирск 630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52
Швецова А. М.1, Ершов К. И.12, Королев М. А.1, Мадонов П. Г.12
Резюме
Ферментные препараты, среди которых и гиалуронидаза, нашли широкое применение в медицинской практике. Большинство присутствующих на фармацевтическом рынке средств с данным действующим веществом производятся в основном из тестикулярной гиалуронидазы, сырьем для которой выступают семенники крупного рогатого скота. Технологии получения энзимного препарата достаточно известны и многообразны. Но между тем, создание иного способа позволит получить высокоочищенную гиалуронат-эндоф^-ацетил-гексозаминидазу с высокой удельной ферментативной активностью.
Цель: разработать технологию и получить по ней лабораторную партию высокоочищенной фармацевтической субстанции гиалуронат-эндоф^-ацетилгексозаминидазы.
Материал и методы. В экспериментальном исследовании были взяты препараты экстрактов бычьих семенников для получения высокоочищенной гиалуронат-эндо-р^-ацетилгексозаминидазы. На первом этапе произведено изучение белкового спектра вытяжки семенников, дробное высаливание белков, фракционированы вещества различной химической природы методами хроматографии. На втором этапе проведена разработка способа получения фармацевтической субстанции гиалуронат-эндоф^-ацетилгексозаминидазы методами, описанными далее в работе.
Результаты.. На основании результатов, полученных в ходе экспериментального исследования, в качестве исходной субстанции неочищенной гиалуронидазы для дальнейших исследований был выбран П-II - препарат вытяжки бычьих семенников, производства ООО «Самсон-Мед» (г. Санкт-Петербург). Наиболее оптимальной является схема очистки, которая включает в качестве основного метода аффинную хроматографию на гепарин-сефарозе с использованием аффинной элюции раствором гепарина в буфере с концентрацией 3 мг/мл. Заключение. В результате проведенного экспериментального исследования представлена оптимальная схема технологии получения фармацевтической субстанции ГЭБНА с высокой ферментативной суммарной активностью 289 ЕД, и получена лабораторная партия высокоочищенной гиалуронат-эндо-р^-ацетилгек-созаминидазы.
Ключевые слова: гиалуронат-эндо-р^-ацетилгексозаминидаза, фармацевтическая субстанция, разработка технологии.
EXPERIMENTAL RESULTS ON THE DEVELOPMENT OF HIGHLY PURIFIED HYALURONATE-ENDO- p-N-ACETYLHEXOSAMINIDASE AS A PHARMACEUTICAL SUBSTANCE FOR A DRUG PRODUCT
1Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology - Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia 630117, Novosibirsk, Timakova St., 2
2Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk, Russia
630091, Novosibirsk, Krasny Ave., 52
Shvetsova A. M.1, Ershov K. I.12, Korolev M. A.1, Madonov P. G.12 Abstract
Enzyme preparations, including hyaluronidase, are widely used in medical practice. Most drugs with this active substance on the pharmaceutical market are produced mainly from testicular hyaluronidase, the raw material for which are bovine testes. The technologies of enzyme preparation production are quite well known and diverse. However, the creation of a different method will allow the highly purified hyaluronate-endo-fi-N-acetylhexosaminidase with high specific enzymatic activity.
Objective: develop a technology and obtain a laboratory batch of the highly purified pharmaceutical substance hyaluro-nate-endo-^-N-acetylhexosaminidase.
Materials and Methods. In the experimental study, preparations of bovine testes extracts were taken to obtain highly purified hyaluronate-endo-p-N-acetylhexosaminidase. In the first stage the protein spectrum of the testes extracts was studied, proteins were fractionally precipitated, and substances of different chemical nature were fractionated by chromatography methods. At the second stage, the development of a method to obtain the pharmaceutical substance hyaluro-nate-endo-p-N-acetylhexosaminidase was carried out using the methods described further in the work. Results. Based on the results obtained during the experimental study, P-II, a preparation of bovine testes extract produced by Samson-Med LLC (St. Petersburg), was chosen as the initial substance of crude hyaluronidase for further studies. The most optimal is the purification scheme, which includes as the main method affinity chromatography on heparin-sepharose using affinity elution with heparin solution in buffer with a concentration of 3 mg/ml. Conclusions As a result of the experimental study, the optimal scheme was presented to obtain the pharmaceutical substance HEBNA with high enzymatic total activity of289 (unit of action) was presented, and a laboratory batch of highly purified hyaluronate-endo-p-N-acetylhexosaminidase was obtained.
Keywords: hyaluronate-endo-p-N-acetylhexosaminidase, pharmaceutical substance, technology development
Введение
В современной медицинской практике используются препараты гиалуронидазы. Среди многообразия гиалуронидаз в медицине, преимущественно, используется тестикулярная бычья гиалуронидаза - bovine hyaluronidase, в меньшей степени применяется овечья - ovine hyaluronidase. В России опыт применения препаратов гиалуронидазы имеет многолетнюю историю. Первым зарегистрированным препаратом была bovine-гиалуронидаза под торговым наименованием «Лидаза». По литературным данным [1] препарат «Лидаза» содержит около 17 белковых фракций с молекулярной массой от 10 до 250 кДа. Есть также препарат конъюгированной гиалуронидазы - азоксимер, под торговым названием «Лонгидаза». Активным фармакологическим ядром этих препаратов является экстракт тестикулярной ткани крупного рогатого скота, обладающий определенной гиалуронидазной активностью. Следует отметить, что ферментативная активность препаратов Лидазы составляет всего 64 ЕД (1280МЕ) в ампуле и это обстоятельство предопределяет парентеральный (подкожный) способ применения, ингаляционный, а также через неповрежденные слизистые и кожу с помощью электрического тока, используя метод электрофореза. У препарата Лонгидаза активность 3000 МЕ в суппозитории/флаконе и 1500 МЕ во флаконе [2]. Между тем в ранее приведенных исследованиях [3, 4, 5] установлено, что яркие регенеративные эффекты гиалуронидазы отмечаются в достаточно высоких дозах, которые превышают терапевтические. Таким образом, существует очевидная необходимость создания лекарственного препарата (ЛП) на основе высо-коочищенного фермента с высокой удельной активностью. Нами разработана технология выделения фермента тестикулярной гиалуро-нидазы (гиалуронат-эндо-р-^ацетилгексоза-минидаза - ГЭБНА) из экстракта семенников крупного рогатого скота.
Цель настоящего исследования заключается в получении валидированной лабораторной партии высокоочищенной фармацевтической субстанции ГЭБНА с высокой удельной ферментативной активностью для создания на ее основе лекарственного препарата.
Материалы и методы
Для получения высокоочищенной ГЭБНА нами были взяты препараты вытяжки бычьих семенников производства АО НПО «Микроген» (г. Москва) и ООО «Самсон-Мед» (г. Санкт-Пе-
тербург), далее обозначены как П-1 и П-П.
Была проведена разработка способа получения фармацевтической субстанции ГЭБНА, которая включает в себя следующие этапы:
1. Выбор метода очистки.
1.1. Предварительные экспериментальные исследования очистки гиалуронидазы.
1.2. Включение метода аффинной хроматографии на гепарин-сефарозе.
1.3. Разработка и исследование оптимальных вариантов схем очистки гиалуронидазы.
2. Выбор исходной субстанции неочищенной гиалуронидазы.
2.1. Фракция 40%-ного насыщения сульфатом аммония.
2.2. Фракция 70%-ного насыщения сульфатом аммония.
3. Очистка исходной субстанции гиалурони-дазы согласно разработанным схемам.
1. Выбор метода очистки.
1.1. Предварительные экспериментальные исследования очистки ГЭБНА.
Предварительно провели экспериментальные исследования по получению очищенной ги-алуронидазы от исходного сырья по следующим методикам:
1.1.1. Изучение белкового спектра вытяжки семенников.
Вертикальный электрофорез в 8% полиакри-ламидном геле в присутствии додецилсульфа-та натрия (SDS) по методу [6]. Одновременно с ним была проведена зимография (субстратный гель-электрофорез) исследуемых вытяжек по методу [7], с целью определения локализации целевых белков по их субстратной активности.
1.1.2. Дробное высаливание белков различными концентрациями сульфата аммония.
Один из наиболее широко применяемых способов предварительной очистки ферментов. Фракционирование сульфатом аммония основано на том, что при повышении концентрации соли в водном растворе, содержащем белки, происходит агрегация гидрофобных участков на поверхности белка. Белки, содержащие на поверхности молекул большое число гидрофобных аминокислотных остатков, агрегируют и выпадают в осадок быстрее, а белки с меньшим содержанием неполярных остатков остаются в растворе [8]. Важное преимущество этого метода - фракционирование сульфатом аммония приводит к стабилизации белков и предотвращению потери ферментативной активности. Использовалась фракция 40%-ного и 70%-ного насыщения сульфатом аммония.
1.1.3. Эксклюзионная хроматография (Гель-фильтрация).
Метод позволяет фракционировать вещества различной химической природы в соответствии с их молекулярными массами. Гель-фильтрация основана на принципе разделения молекул в хроматографической системе за счет их разной способности проникать в поры стационарной фазы. Первыми выходят из хрома-тографической колонки наиболее крупные молекулы, способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. При проведении экспериментов по фракционированию субстанции БТГ в качестве подвижной фазы (элюента) был использован 20мМ ацетатный буферный раствор рН=4,0, содержащий 0,3М натрий хлористый. Детекцию пиков проводили на проточном спектрофотометре (Gilson HM Holochrome) при длине волны 280нм, скорость потока элюента 15мл/час. В качестве неподвижной фазы был взят Sephadex G-100 (GE Healthcare) с пределами фракционирования молекулярных масс по глобулярным белкам от 4000 до 150000Да [9]. Длина выбранной хрома-тографической колонки 800мм, диаметр 10мм. Перед началом фракционирования по голубому декстрану (молекулярная масса 2 млн Да) был определен свободный объем колонки (V0) равный 9мл. Объем наносимой пробы БТГ на колонку составил 200мкл. Под контролем планшетного самописца (Gilson) собирались пиковые фракции, которые далее анализировались вертикальным электрофорезом в полиакрила-мидном геле.
1.1.4. Ионообменная хроматография.
Представляет собой процесс, который позволяет осуществить разделение ионов и полярных молекул в зависимости от их заряда. Белки как амфотерные молекулы содержат и кислотные, и основные функциональные группы. Общий заряд белка определяется боковыми группами аминокислот, которые могут быть положительно или отрицательно заряженными, нейтральными или полярными. При pH ниже изоэлектрической точки (ИТ) белковая молекула заряжена положительно, а при pH выше ИТ общий заряд белка — отрицательный. Данное свойство позволяет подобрать неподвижную фазу и условия для проведения хроматографического разделения белковых смесей. Как было представлено выше, теоретические изоэлектрические точки целевых белков составляют 8,62 и 8,79. Таким образом, при нейтральных и кислых значениях рН среды они будут положительно заряженными, что позволяет использовать для их разделения и очистки катионнообменные сорбенты, имеющие отрицательно заряженные функциональные группы, удерживающие положительно заряженные молекулы исследуемого материала. Элюцию сорбированного материала осуществляют повышением ионной силы раствора или изменением значения рН элюирующего буфера. При проведении экспериментов по фракционированию субстанции БТГ в качестве раствора для
нанесения был взят: 20мМ ацетатный буферный раствор рН=5,2 (нулевой буфер). Элюцию сорбированного материала осуществляли линейным градиентом 2М хлористого натрия в нулевом буфере. Детекцию пиков проводили на проточном ВЭЖХ-спектрофотометре (SYKAM) при длине волны 280нм, скорость потока элюента 1мл/мин. В качестве неподвижной фазы был взят катионнообменный сорбент SP-Sep-harose Fast Flow (GE Healthcare). Перед началом хроматографии колонка с сорбентом (объем 5мл) была уравновешена нулевым буфером до значения рН=5,2+0,05. Объем наносимой пробы БТГ на колонку составил 500мкл. Собирали фракции по 2мл, которые затем анализировали вертикальным электрофорезом в полиакрила-мидном геле.
1.2. Аффинная хроматография на гепарин-се-фарозе.
Для полной очистки целевых ферментов необходимо использование высокоселективных методов аффинной хроматографии, таким является данный метод. Метод очистки и разделения белков, основанный на их избирательном взаимодействии с лигандом (в данном случае с гепарином), ковалентно связанным с инертным носителем (с сефарозой).
1.3. Разработка и исследование оптимальных вариантов схем очистки гиалуронидазы.
При разработке технологии получения фармацевтической субстанции ГЭБНА одной из главных задач было получение очищенной гиалуронидазы из исходного сырья. На основе анализа литературы и проведенных экспериментов, которые указаны в работе по очистке гиалуронидазы, были сформулированы и исследованы различные схемы с целью выбора оптимального варианта:
Схема № 1.
1. Дробное высаливание (фракционирование) белков сульфатом аммония.
2. Гель-фильтрация на Sephadex G-100.
3. Концентрирование и ультрафильтрация на Vivaspin 20 MWCO 50 кДа.
4. Ионообменная хроматография на SP-Sep-harose Fast Flow.
5. Концентрирование и ультрафильтрация на Vivaspin 20 MWCO 50 кДа.
Схема № 2.
1. Дробное высаливание (фракционирование) белков сульфатом аммония.
2. Концентрирование и ультрафильтрация на Vivaspin 20 MWCO 50 кДа.
3. Ионообменная хроматография на SP-Sep-harose Fast Flow.
4. Концентрирование и ультрафильтрация на Vivaspin 20 MWCO 50 кДа.
5. Аффинная хроматография на Hep-arine-Sepharose Fast Flow.
6. Концентрирование и ультрафильтрация на Vivaspin 20 MWCO 50 кДа.
Схема № 3.
1. Дробное высаливание (фракционирование) белков сульфатом аммония.
2. Концентрирование и ультрафильтрация на Vivaspin 20 MWCO 50 кДа.
3. Аффинная хроматография на Hep-
arine-Sepharose Fast Flow.
4. Концентрирование и ультрафильтрация на Vivaspin 20 MWCO 50 кДа.
Провели масштабирование - подбор размеров колонок, объемов сорбентов, количества исходной неочищенной субстанции таким образом, чтобы получить в итоге за один цикл очистки необходимое для дальнейших исследований количество очищенной фармацевтической субстанции.
2. Выбор исходной субстанции неочищенной гиалуронидазы.
Проводили фракционирование сульфатом аммония препаратов вытяжки бычьих семенников П-I и П-II.
2.1. Фракция 40%-ного насыщения сульфатом аммония.
Навески препаратов экстракта семенников (ЭС КРС) П-I и П-II растворяли в 5 мл ацетатного буфера (20 мМ ацетата натрия, 0.15 мМ натрия хлорида, рН 4,0). В раствор при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке добавляли сульфат аммония (Ultra Pure Grade, 99,5%) до 40% насыщения (1,21 г). После перемешивания в течение 30 мин., раствор с агрегировавшим белком помещали в холодильник на 4 часа, после центрифугировали 20 мин. при 5000g. Происходило осаждение небольшого количества белка на дне центрифужной пробирки в обоих вариантах субстанций, и образование значительного слоя «флотирующего» осадка белка в верхней части в варианте субстанции «П-I». В этом варианте супернатант фильтровали через бумажный фильтр «красная лента», фильтр промывали 40%-ным раствором сульфата аммония в ацетатном буфере и объединяли смыв с супернатантом, при этом объем доводили до 10 мл 40%-ным раствором сульфата аммония в буфере. Осадок белка смывали с фильтра 5 мл ацетатного буфера, после чего в этом же смыве перерастворяли осадок белка, полученный после центрифугирования. После измерения точного объема полученного раствора белка измеряли концентрацию белка (метод Брэдфорда [10]) и гиалуронидазную активность [13]. В варианте субстанции «П-II» флотирующий слой белка не образовывался. Супернатант сливали в пробирку, осадок после центрифугирования промывали 2 мл 40%-ного раствора сульфата аммония в буфере, повторно центрифугировали 20 мин. при 5000g, суперна-танты объединяли и доводили объем до 10 мл 40%-ным раствором сульфата аммония в буфере. Осадок белка перерастворяли в 5 мл ацетатного буфера и измеряли концентрацию белка и гиалуронидазную активность.
2.2. Фракция 70%-ного насыщения сульфатом аммония.
Полученный после осаждения 40%-ным сульфатом аммония супернатант (10 мл) помещали в пенициллиновый флакон. В раствор при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке добавляли сульфат аммония (Ultra Pure Grade, 99,5%) до 70% насыщения (2,02 г). После перемешивания в течение 30 мин. раствор с агрегировавшим белком помещали в холодильник на 4 часа, после чего центрифуги-
ровали 20 мин. при 5000g. Супернатант сливали в пенициллиновый флакон и измеряли его точный объем. Осадок перерастворяли в 1 мл ацетатного буфера. В супернатанте и перерастворенном в буфере осадке измеряли концентрацию белка и гиалуронидазную активность. Полученный при 70% насыщении сульфатом аммония осадок содержал активную фракцию гиалуронидазы.
3. Очистка исходной субстанции гиалуронидазы согласно разработанным схемам.
3.1. Очистка исходной субстанции гиалуронидазы по схеме № 1.
3.1.1. Дробное высаливание (фракционирование) белков сульфатом аммония.
Полученная при 70% насыщении сульфатом аммония активная фракция содержала гиа-луронидазу (объем 1 мл, 8 мг/мл белка, 140 Ед активности) и была подвергнута дальнейшей очистке методом гель-фильтрации.
3.1.2. Гель-фильтрация на колонке с Sephadex G-100.
При проведении экспериментов по фракционированию гиалуронидазы в качестве элюента был использован 20мМ ацетатный буферный раствор, рН=4,0, содержащий 0,3 М натрий хлористый. Детекцию пиков проводили на проточном спектрофотометре (Gilson HM Ho-lochrome), длина волны 280нм, скорость потока элюента 15мл/час. В качестве неподвижной фазы был взят Sephadex G-100 (GE Healthcare) с пределами фракционирования молекулярных масс по глобулярным белкам от 4000 до 150000 Да. Длина выбранной хроматографической колонки 80 см, диаметр 10 мм. Объем наносимой на колонку пробы белка, содержащего гиалу-ронидазу, составил 1 мл. Под контролем планшетного самописца (Gilson) собирали пиковые фракции, которые далее анализировали на наличие гиалуронидазной активности.
3.1.3. Концентрирование и ультрафильтрация.
Собранные после гель-хроматографии активные фракции концентрировали ультрафильтрацией на центрифужных мембранных концентраторах Vivaspin с MWCO 50 кДа. Белки с молекулярным весом более 50 кДа не проходят через ультрафильтрационную мембрану и в процессе центрифугирования концентрируются в специальном вкладыше в пробирку для центрифугирования. Концентрирование проводили 20 мин. при 5000g. Концентрат переносили в чистую пробирку, остатки раствора белка во вкладыше смывали ацетатным буфером и объединяли с концентратом. Конечный объем раствора белка составил 300 мкл, количество белка 1,8 мг, суммарная гиалуронидазная активность 75 ЕД, удельная активность 42 ЕД/мг белка. Использование этого метода позволяет быстро и легко проводить смену буфера. Исходный белок был растворен в ацетатном буфере, содержащем 0,3 М натрия хлорида. После концентрирования белок был переведен в ацетатный буфер без натрия хлорида, что необходимо для следующего этапа очистки - ионообменной хроматографии.
3.1.4. Ионообменная хроматография.
Представляет процесс, который позволя-
ет осуществить разделение ионов и полярных молекул в зависимости от их заряда. Как было показано ранее, позволяет использовать для разделения белковых смесей и их очистки ка-тионнообменные сорбенты, имеющие отрицательно заряженные функциональные группы, удерживающие положительно заряженные молекулы исследуемого материала. Элюцию сорбированного материала осуществляют повышением ионной силы раствора или изменением значения рН-элюирующего буфера. При проведении экспериментов по очистке гиалу-ронидазы в качестве раствора для нанесения был взят: 20мМ ацетатный буферный раствор рН=4,0 (нулевой буфер). Элюцию сорбированного белка осуществляли линейным градиентом 2М хлористого натрия в нулевом буфере. Детекцию пиков проводили на проточном ВЭЖХ-спектрофотометре (SYKAM) при длине волны 280нм, скорость потока элюента 1мл/ мин. Неподвижная фаза - катионнообменный сорбент SP-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare). Перед началом хроматографии колонка с сорбентом (объем 5мл) была уравновешена нулевым буфером до значения рН=4,0. Объем наносимой пробы на колонку составил 300мкл. Собирали фракции по 2мл, которые анализировали на наличие гиалуронидазной активности. Активные фракции объединяли и концентрировали на Vivaspin 20 MWCO 50 кДа.
3.1.5. Концентрирование и ультрафильтрация.
Собранные после ионообменной хроматографии активные фракции концентрировали ультрафильтрацией на центрифужных мембранных концентраторах Vivaspin с MWCO 50 кДа. В процессе ультрафильтрации белок был переведен в ацетатный буфер с 0,15 М натрия хлорида.
3.2. Очистка исходной субстанции гиалуронидазы в соответствии со схемой № 2.
В процессе очистки по схеме №1 двухступенчатое фракционирование сульфатом аммония необходимо для того, чтобы перерастворить осажденный белок, содержащий активную фракцию, в небольшом объеме буфера (не более 1 мл) для нанесения на гель-фильтрационную колонку. В схемах очистки 2 и 3 после осаждения сульфатом аммония использовали ультрафильтрацию, что позволило отказаться от второй ступени фракционирования (насыщение от 40 до 70%). Использование центрифужных мембранных концентраторов Vivaspin с пределом исключения 50 кДа позволило исключить длительную и трудоемкую стадию гель-фильтрации на колонке с Sephadex G-100.
3.2.1. Дробное высаливание (фракционирование) белков сульфатом аммония.
Навеску субстанции 100 мг растворяли в 10 мл ацетатного буфера (20 мМ ацетата натрия, 0,15 мМ натрия хлорида, рН 4,0). В раствор при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке добавляли сульфат аммония (Ultra Pure Grade, 99,5%) до 40% насыщения (2,42 г). После перемешивания в течение 30 мин. раствор с агрегировавшим белком помещали в холодильник на 4 часа, после центрифугировали 20 мин. при 5000g. Осадок выбрасывали. Супер-
натант, содержащий активную фракцию гиалу-ронидазы, подвергали дальнейшей очистке.
3.2.2. Концентрирование и ультрафильтрация на Vivaspin 20 MWCO 50 кДа.
Супернатант, полученный на стадии 1, концентрировали ультрафильтрацией на центрифужных мембранных концентраторах Vivaspin с MWCO 50 кДа. Проводили смену буфера - конечный раствор белка получали в ацетатном буфере 20 мМ, рН 4,0 без натрия хлорида. Конечный объем образца составил 500 мкл.
3.2.3. Ионообменная хроматография на SP-Sep-harose.
Полученный на стадии 2 раствор белка (500 мкл) наносили на колонку с SP-Sepharose Fast Flow. Хроматографию проводили как для стадии 4, но с небольшими отличиями. Поскольку количество белка и объем образца, наносимого на колонку, были существенно больше, собирали фракции по 4 мл. Конечный объем активных фракций в этом варианте очистки составил 12 мл.
3.2.4. Концентрирование и ультрафильтрация на Vivaspin 20 MWCO 50 кДа.
Активные фракции, полученные на стадии 3, концентрировали ультрафильтрацией на центрифужных мембранных концентраторах Vivaspin с MWCO 50 кДа. При этом проводили смену буфера - конечный раствор белка получали в ацетатном буфере 20 мМ, рН 4,0 без хлорида натрия. Конечный объем образца составил 500 мкл.
3.2.5. Аффинная хроматография на Heparine-Sep-harose Fast Flow.
Аффинную очистку проводили на колонке с аффинным сорбентом гепарин-сефарозой (Hep-arine-Sepharose FF, GE Healthcare). Длина колонки 8 см, диаметр 1 см, объем сорбента 5,5 мл. Концентрат, полученный при ультрафильтрации на стадии 4, наносили на колонку. Гиалуронидаза из концентрата при этом аффинно связывается с сорбентом. Колонку промывали буферным раствором (ацетатный буфер 20 мМ, рН 4,0 без хлорида натрия) в количестве 100 мл. Скорость подачи буфера 1 мл/мин. Детекцию пиков проводили на проточном спектрофотометре (Gilson HM Holochrome) при длине волны 280нм. Объем наносимой на колонку пробы белка, содержащего гиалуронидазу, составил 500 мкл. Аффинную элюцию гиалуронидазы с гепарин-сефарозы проводили раствором гепарина с концентрацией 3 мг/мл в ацетатном буфере. Объем элюи-рующего буфера 30 мл, скорость подачи 0,5 мл/ мин. Элюат собирали в центрифужные мембранные концентраторы Vivaspin 20 MWCO 50 кДа и концентрировали на следующей стадии.
3.2.6. Концентрирование и ультрафильтрация на Vivaspin 20 MWCO 50 кДа.
Элюент, полученный на предыдущей стадии, концентрировали ультрафильтрацией на центрифужных мембранных концентраторах Vivaspin 20 с MWCO 50 кДа. При этом содержащийся в элюате гепарин, обладающий меньшим молекулярным весом, проходит через мембрану, тогда как гиалуронидаза задерживается. Получившийся концентрат, содержащий очищенную гиалуронидазу и остаточные коли-
чества гепарина, разбавляют 10 мл ацетатного буферного раствора с натрий хлоридом (20 мМ натрий ацетата, 0,15 М натрий хлорида, рН 4,0) непосредственно в концентраторе и повторяют процедуру концентрирования. Разбавление буфером и концентрирование проводят еще два раза. Конечный объем раствора очищенной гиалуронидазы доводят до 500 мкл.
3.3. Очистка исходной субстанции гиалурони-дазы в соответствии со схемой №3.
В процессе очистки по схеме № 2 наиболее эффективной стадией была аффинная хроматография на Heparine-Sepharose. Большое число стадий в схеме 2, по-видимому, приводит к увеличению суммарных потерь активности в процессе очистки, поэтому в схеме 3 мы исключили ионообменную хроматографию.
3.3.1. Дробное высаливание (фракционирование) белков сульфатом аммония.
Проводили по методике, описанной в схеме №2.
3.3.2. Концентрирование и ультрафильтрация на Vivaspin 20 MWCO 50 кДа.
Проводили по методике, описанной в схеме №2.
3.3.3. Аффинная хроматография на Hep-arine-Sepharose Fast Flow.
Аффинную очистку проводили на колонке с аффинным сорбентом гепарин-сефарозой (Heparine-Sepharose FF, GE Healthcare). Длина колонки 8 см, диаметр 1 см, объем сорбента 5,5 мл. Концентрат, полученный при ультрафильтрации на стадии 2, наносили на колонку. Да-
лее проводили по методике, описаннои в схеме №2.
3.3.4. Концентрирование и ультрафильтрация на Vivaspin 20 MWCO 50 кДа.
Проводили по методике, описанной в аналогичной стадии схемы №2.
Результаты и обсуждение
1. Выбор метода очистки.
1.1. Предварительные экспериментальные исследования очистки гиалуронидазы.
1.1.1. Изучение белкового спектра вытяжки бычьих семенников.
С помощью гель-электрофореза было обнаружено, что вытяжка бычьих семенников, содержащая БТГ, получаемая П-II, представляет собой смесь веществ с широким спектром белковых молекул, которые не отвечают за специфическую ферментативную активность (рис. 1). Однако зимография (субстратный гель-электрофорез) в выбранных инкубационных условиях позволила идентифицировать в составе вытяжки бычьих семенников П-I две белковые фракции, обладающие гидролитической активностью в отношении гиалуроновой кислоты (рис. 1, дорожки 8, 9) и одну в составе вытяжки бычьих семенников П-II. При помощи денситоме-трической обработки данных рисунка 1 в пакете программы «Gel-Pro Analyzer Ver 3.1.00 Media Cybernetics USA» были определены молекулярные массы активных белков, значения которых составили для вытяжки бычьих семенников П-I: 54+0,5кДа и 64+0,5кДа; для гомогената бычьих семенников П-II - 80кДа+0,5кДа.
Рисунок 1. Субстратный гель-электрофорез в 8% полиакриламидном геле, содержащем 170 мкг/мл
натриевой соли гиалуроновой кислоты.
Примечание: 1 - вытяжка бычьих семенников П-I (Змкл/лунка); 2 - гомогенат бычьих семенников П-I (6мкл/лун-ка); 3 - вытяжка бычьих семенников П-II (3 мкл/лунка); 4 - вытяжка бычьих семенников П-II (6 мкл/лунка); 5 -Белки-стандарты молекулярного веса; 6 - вытяжка бычьих семенников П-II, разбавленная в 5 раз (3 мкл/лунка); 7 - вытяжка бычьих семенников П-II, разбавленная в 5 раз (6 мкл/лунка); 8 - вытяжка бычьих семенников П-I, разбавленная в 5 раз (3 мкл/лунка); 9 - вытяжка бычьих семенников П-I, разбавленная в 5 раз (3 мкл/лунка). (После электрофореза дорожки 1, 2, 3, 4, 5 были окрашены Coomassie Brilliant Blue G-250. Дорожки 6, 7, 8, 9 после инкубации в 0,1М ацетатном буфере (рН=4,0) были окрашены Alcian Blue 8x).
бычьих семенников П-I, специфическая гиалу-ронидазная активность которого обусловлена двумя изоформами фермента гиалуронидазы. Теоретические значения изоэлектрических точек и определенные экспериментально значения молекулярных масс исследуемых белков позволили провести ряд экспериментов по подбору методов очистки целевых ферментов от балластных примесей. Из широкого спектра возможных способов очистки на данном этапе исследования выбор был сделан в пользу изучения методов, позволяющих провести предварительную очистку целевых белков. Проведены эксперименты по дробному высаливанию белковых примесей различными концентрациями сульфата аммония, фракционированию белков эксклюзионной и ионообменной хроматогра-фиями.
1.1.2. Использование дробного высаливания белков вытяжки бычьих семенников различными концентрациями сульфата аммония.
Белковые фракции, полученные осаждением различными концентрациями сульфата аммония, были проанализированы методом вертикального электрофореза в 12% полиакри-ламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) по вышеуказанному методу (рис. 2). Использованная схема дробного высаливания сульфатом аммония позволила провести фракционирование и удаление части балластных белков, не отвечающих за специфическую активность (рис. 2).
!
I
* 2
Рисунок 2. Вертикальный гель-электрофорез в 12% полиакриламидном геле фракций гомогената бычьих семенников после осаждения сульфатом аммония
Примечание: 1 - вытяжка бычьих семенников (5мкл/лунка); 2 - Фракция 1, белок, осажденный насыщением до 35% сульфата аммония («флотирующий» белок); 3 - Фракция 2, белок, осажденный насыщением 35-65% сульфата аммония; 4 - Фракция 3, белок, осевший после осажденная 35% сульфата аммония; 5 - Супернатант после осаждения 65% сульфата аммония; 6 - Белки-стандарты молекулярного веса (Лизоцим-14кДа, рчГ-КСФ-18кДа, Химотрипси-ноген-25кДа, Овальбумин-45кДа, БСА-б6кДа).
Таким образом, идентифицированные нами 2 активных белка в субстанции П-I с молекулярными массами 64 кДа и 54 кДа являются различными формами гиалуронидазы РН-20 известной также как SPAM-1 (Sperm Adhesion Molecule). Анализ базы данных белковых молекул [14] позволил определить аминокислотные последовательности данных белков, а также рассчитать их теоретические изоэлектрические точки.
Наиболее близкими к исследуемым белковым молекулам, согласно базе данных, являются следующие белки:
1. Бычья РН-20 гиалуронидаза (bovine PH-20 hyaluronidase http://www.uniprot.org/uniprot/ Q7YS45), состоящая из 474 аминокислотных остатков с молекулярной массой 53,5кДа и теоретической изоэлектрической точкой 8,62.
2. Бычья SPAM-1 (bovine Sperm Adhesion Molecule 1), состоящая из 553 аминокислотных остатков с молекулярной массой 62,3кДа и теоретической изоэлектрической точкой 8,79 (http://www.uniprot.org/uniprot/Q2YDK3).
В ряде работ [11, 12] показано наличие БТГ с молекулярной массой 80 кДа (sperm p80 protein), являющейся ортологом PH-20. Методом 2-мерного электрофореза было показано, что р80 мигрирует несколькими изоформами с изоэлектрическими точками, находящимися в интервале от 7,4 до 8,2 [11]. В связи с тем, что р80 во многом гомологичен РН-20, было принято решение взять для дальнейшей работы в качестве исследуемого материала вытяжку
Анализ гиалуронидазной активности показал, что при насыщении сульфатом аммония до 35% происходит осаждение 30-40% балластных белков, не обладающих специфической активностью. Активные ферменты при этом остаются в супернатанте. Дальнейшее насыщение полученного супернатанта до 65% сульфата аммония приводит к полному осаждению ферментов в составе агрегировавших белковых фракций (в оставшемся супернатанте отсутствует специфи-
ческая активность). Баланс по количеству белка и удельной активности показал, что при фракционировании практически не происходит потерь белка и ферментативной активности.
1.1.3. Использование эксклюзионной хроматографии для очистки субстанции.
Профиль хроматографической элюции и электрофоретический анализ собранных фракций представлен на рисунках 3 и 4.
Рисунок 3. Профиль элюции вытяжки бычьих семенников на Sephadex G-100
/
ЗбкДа
25кДа
V
18кДа 14кДа
4 5
Рисунок 4. Вертикальный гель-электрофорез в 12% полиакриламидном геле фракций вытяжки бычьих семенников после гель-фильтрации на Sephadex G-100
Примечание: 1 - вытяжка бычьих семенников (5мкл/лунка); 2 - Фракция 1, соответствующая пику 1 рисунка 3; 3 - Фракция 2, соответствующая пику 2 рисунка 3; 4 - Фракция 3, соответствующая пику 3 рисунка 3; 5 - Белки-стандарты молекулярного веса (Лизоцим-14кДа, рчГ-КСФ-18кДа, Химотрипсиноген-25кДа, Лактатдегидроге-наза-36кДа, Овальбумин -45кДа, БСА- 66кДа).
Представленные на рисунках 3 и 4 результаты хроматографии и гель-электрофореза свидетельствуют о частичном фракционировании как белковых молекул (пик 1 и 2 на рисунке 3; дорожка
2 и 3 на рисунке 4), так и веществ, не окрашивающихся специфическим белковым красителем Coomassie Brilliant Blue G-250, но поглощающих ультрафиолет при 280нм (пик 3 рисунок 3, дорожка 4 рисунок 4). Предположительно в пике
3 могут содержаться низкомолекулярные пигменты, пептиды, аминокислоты, остатки органических растворителей, присутствующие в исходной вытяжке бычьих семенников. Собранные пиковые фракции были проанализированы на специфическую гиалуронидазную активность (ФСП 42-0179-0546-00). Практически вся активность детектировалась в пике 1, что послужило
подтверждением результатов гель-электрофореза (рисунок 3, дорожка 2), демонстрирующего наличие в пике 1 белков с диапазоном молекулярных масс, включающих молекулярные массы целевых ферментов (54кДа и 64кДа).
Таким образом, эксклюзионная хроматография с выбранной неподвижной фазой Sephadex С-100 позволяет провести частичную очистку исследуемого материала от ряда балластных белков, а также от низкомолекулярных органических примесей.
1.1.4. Использование ионообменной хроматографии для очистки субстанции.
Профиль хроматографической элюции и электрофоретический анализ собранных фракций представлен на рисунках 5 и 6.
Рисунок 5. Профиль хроматографии вытяжки бычьих семенников на SP-Sepharose
Рисунок 6. Вертикальный гель электрофорез в 12% полиакриламидном геле пиковых фракций БТГ после катионнообменной хроматографии на SP-Sepharose Fast Flow
Примечание: 1 - вытяжка бычьих семенников (5мкл/лунка); 2 - Фракция 1 (проскок с колонки) рисунка 4; 3 - Белки-стандарты молекулярного веса (Лизоцим-14кДа, рчГ-КСФ-18кДа, Химотрипсиноген-25кДа, Лактатдегидроге-наза-36кДа, Овальбумин-45кДа, БСА- 66кДа, Кональбумин-76кДа); 4 - Фракция 2 рисунка 5; 5 - Фракция 3 рисунка 5; 6 - Фракция 4 рисунка 5; 7 - Фракция 5 рисунка 5; 8 - Фракция 6 рисунка 5; 9 - Фракция 7 рисунка 5; 10 - Фракция 8 рисунка 4. 76
С помощью данного метода получено фракционирование белков, элюирующихся с выбранного сорбента линейным градиентом NaQ (фракции 2-8). Также в проскоке наблюдалось отделение примесей, предположительно соответствующих компонентам третьего пика, образующегося при элюции на Sephadex С-100 (рис. 3). Собранные фракции были проанализированы на наличие специфической активности (по ФСП 42-0179-0546-00). Гиалуронидазная активность была обнаружена во фракциях 4, 5 и 6; анализ фракции 1 (проскок) и фракций 2, 3, 7, 8 не выявил наличие активных ферментов в их составе.
На основании представленных результатов можно сделать заключение о целесообразности включения в схему очистки субстанции БТГ, получаемой из вытяжки бычьих семенников, стадии катионнообменной хроматографии на
В обоих вариантах субстанций как осаждавшийся, так и «флотирующий» белок обладал низкой специфической гиалуронидазной активностью, то есть являлся балластным. При этом количество балластного белка в субстанции «П-11» составляло 13%, тогда как в субстанции «П-1» - 36 и 29%. Кроме того, удельная активность субстанции «П-11» была значительно выше. На основании этих результатов в качестве исходной субстанции неочищенной гиалу-ронидазы для дальнейших исследований была
выбранном сорбенте, позволяющем удалить значительное количество неактивных белковых примесей и тем самым повысить удельную активность исследуемого препарата. В то же время следует отметить, что для полной очистки целевых ферментов необходимо использование высокоселективных методов аффинной хроматографии, в частности хроматография на гепа-рин-сефарозе.
2. Выбор исходной субстанции неочищенной гиалуронидазы и его обоснование.
Было проведено фракционирование сульфатом аммония препаратов вытяжки бычьих семенников П-1 и П-11, которое показало значительные различия.
Данные по количеству белка и ферментативной активности фракций при фракционировании сульфатом аммония суммированы и представлены в таблице 1.
выбрана субстанция П-11 - субстанция лидазы производства ООО «Самсон-Мед» (г. Санкт-Петербург).
3. Результаты по очистке исходной субстанции гиалуронидазы согласно разработанным схемам.
3.1. Очистка исходной субстанции гиалуронидазы по схеме № 1.
Данные по количеству белка и ферментативной активности в процессе очистки по схеме № 1 представлены в таблице 2.
Таблица 2
Количество белка, суммарная и удельная активность гиалуронидазы в процессе очистки по схеме №1
Фракция Сумм. белок, мг Суммарная активность, ЕД Удельная активность, ЕД/мг белка
Исходная субстанция 11 180 16,4
Осадок 70% СА 8 140 17,5
Sephadex G-100. 2 79 40
Ультрафильтрация 1,8 75 42
SP-Sepharose 0,43 53 123
Ультрафильтрация 0,35 43 123
Таблица 1
Количество белка, суммарная и удельная активность гиалуронидазы при фракционировании
сульфатом аммония (СА)
Фракция Сумм. белок, мг Суммарная активность, ЕД Удельная активность, ЕД/мг белка
Субстанция П-1
Исходная субстанция 25 192 7,7
Осадок 40% СА 9 21 1,2
Супернатант 40% СА 14 134 9,6
Осадок 70% СА 12 118 9,8
Супернатант 70% СА 0,6 0 0
Субстанция П-11
Исходная субстанция 11 180 16,4
Осадок 40% СА 1,5 11 7,3
Супернатант 40% СА 9 157 17,4
Осадок 70% СА 8 140 17,5
Супернатант 70% СА 0,5 0 0
3.2. Очистка исходной субстанции гиалурони-дазы в соответствии со схемой № 2.
В процессе очистки по схеме №1 двухступенчатое фракционирование сульфатом аммония было необходимо для того, чтобы перерастворить осажденный белок, содержащий активную фракцию, в небольшом объеме буфера (не более 1 мл) для нанесения на гель-фильтрационную колонку. В схемах очистки №2 и №3 после осаждения сульфатом аммония мы использовали ультрафильтрацию. Это позволило
Количество белка, суммарная и удельная активность
отказаться от второй ступени фракционирования (насыщение от 40 до 70%). Кроме того, использование центрифужных мембранных концентраторов Vivaspin с пределом исключения 50 кДа позволило исключить длительную и трудоемкую стадию гель-фильтрации на колонке с Sephadex G-100.
Данные по количеству белка и ферментативной активности в процессе очистки по схеме № 2 приведены в таблице 3.
Таблица 3
гиалуронидазы в процессе очистки по схеме №2
Фракция Сумм. белок, мг Суммарн. активность, ЕД Удельн. активность, ЕД/мг белка
Исходная субстанция 24 368 15,3
Осадок 40% СА 20 330 16,5
Ультрафильтрация 18 312 17,3
SP-Sepharose 8,5 273 32,1
Ультрафильтрация 7,7 261 33,9
Heparine-Sepharose 1,1 232 211
Ультрафильтрация 0,9 202 224
3.3. Очистка исходной субстанции гиалурони-дазы в соответствии со схемой №3.
В процессе очистки по схеме №2 наиболее эффективной стадией показала себя аффинная хроматография на Heparine-Sepharose. Большое число стадий, используемых в схеме №2, по-видимому, приводит к увеличению суммар-
Количество белка, суммарная и удельная активность
ных потерь активности в процессе очистки. Поэтому в схеме №3 мы исключили ионообменную хроматографию.
Данные по количеству белка и ферментативной активности в процессе очистки по схеме № 3 приведены в таблице 4.
Таблица 4
гиалуронидазы в процессе очистки по схеме №3
Фракция Сумм. белок, мг Суммарн. активность, ЕД Удельн. активность, ЕД/мг белка
Исходная субстанция 22 360 16,4
Осадок 40% СА 19 318 16,7
Ультрафильтрация 18 310 17,2
Heparine-Sepharose 1,2 289 241
Ультрафильтрация 1,0 248 248
Проведенные исследования показали, что наиболее эффективной является схема очистки №3, включающая в качестве основного метода аффинную хроматографию на гепарин-сефаро-зе с использованием аффинной элюции раствором гепарина в буфере с концентрацией 3 мг/мл.
Заключение
В результате проведенного экспериментального исследования нами была разработана технология очистки тестикулярной гиалуро-нат-эндо-р-^ацетилгексозаминидазы в качестве фармацевтической субстанции для создания ЛП. Нами была изготовлена лабораторная партия высокоочищенной ГЭБНА с удельной активностью 241 ЕД белка, что вполне пригодно для изготовления на ее основе фармацевтической субстанции, которая, в свою очередь, будет составлять фармакологически активное ядро ЛП. Нами фактически представлена оптимальная схема технологии получения фармацевтической субстанции, которая может быть
масштабирована до опытно-промышленного регламента производства.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Список литературы:
1. Барсуков А.К., Кожевникова О.В., Хохрякова А.В. Выделение и очистка бычьей тестику-лярной гиалуронидазы. Прикладная биохимия и микробиология. 2003; 39(6): 625.
2. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. Москва, 2022:1120.
3. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Влияние трансплантации мононуклеа-ров периферической крови, полученных с использованием гранулоцитарного колониести-мулирующего фактора и гиалуронидазы, на регенерацию кроветворной ткани при миело-супрессии. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2009; 3:136-142.
4. Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. Ре-
генеративная медицина: в поисках «эликсира жизни». Наука из первых рук. 2013; 3(51): 24-31.
5. Дыгай А.М., Першина О.В., Крупин В.А., Ермолаева Л.А., Ермакова Н.Н., Шилова М.А., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н., Скурихин Е.Г. Изучение антифибротической активности модифицированной и нативной гиалуронидазы при пневмофиброзе. Сибирский научный медицинский .журнал. 2017; 37(4): 5-10.
6. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259): 680-5. https://doi. org/10.1038/227680a0
7. Guntenhoner M.W., Pogrel M.A., Stern R. A substrate-gel assay for hyaluronidase activity. Matrix. 1992; 12(5): 388-96. https://doi.org/10.1016/ S0934-8832(11)80035-1
8. Скоупс Р. Методы очистки белков. Москва, 1985:385.
9. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. Москва, 1991:544.
10. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976; 72: 248-254. https://doi. org/10.1006/abio.1976.9999. PMID: 942051.
11. Lalancette C., Dorval V., Leblanc V., Leclerc P. Characterization of an 80-kilodalton bull sperm protein identified as PH-20. Biol Reprod. 2001; 65(2): 628-36. https://doi.org/10.1095/biolreprod65.2.628. PMID: 11466235.
12. Morin G., Lalancette C., Sullivan R., Leclerc P. Identification of the bull sperm p80 protein as a PH-20 ortholog and its modification during the epididymal transit. Mol Reprod Dev. 2005; 71(4): 523-34. https://doi.org/10.1002/mrd.20308. PMID: 15892045
13. Методика измерения гиалуронидазной активности. ЛСР-009264/09-171109 на субстанцию «Лидаза» ООО «Самсон-Мед».
14. http://www.uniprot.org/
References
1. Barsukov A.K., Kozhevnikova O.V., Khokhryakova A.V. Separation and purification of bovine testicular hyaluronidase. Prikladnaya biokh-imiya i mikrobiologiya=Applied Biochemistry and Microbiology. 2003; 39(6): 625. (In Russ.)
2. Vidal Directory. Medicinal preparations in Russia. Moscow, 2022:1120.
3. Dygai A.M., Zyuzkov G.N., Zhdanov V.V. et al. Effect of transplantation of peripheral blood mononuclear cells obtained using granulocyte colony-stimulating factor and hyaluronidase on he-matopoietic tissue regeneration in myelosuppres-sion. Kletochnye tekhnologii v biologii i meditsine = Cell Technologies in Biology and Medicine (Bull. Exp. Biol. Med.). 2009; 3:136-142. (In Russ.)
4. Dygai A.M., Zyuzkov G.N., Zhdanov V.V. Regenerative medicine: in search of the «elixir of life». SCIENCE First Hand. 2013; 3(51): 24-31.
5. Dygai A.M., Pershina O.V., Krupin V.A., Er-molaeva L.A., Ermakova N.N., Shilova M.A., Ma-donov P.G., Kinsht D.N., Skurikhin E.G. Study of antifibrotic activity of modified and native hyal-uronidase in pneumofibrosis. Sibirskij Nauchnyj Medicinskij Zhurnal = Siberian Scientific Medical Jour-
nal. 2017; 37(4): 5-10.
6. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259): 680-5. https://doi. org/10.1038/227680a0
7. Guntenhoner M.W., Pogrel M.A., Stern R. A substrate-gel assay for hyaluronidase activity. Matrix. 1992; 12(5): 388-96. https://doi.org/10.1016/ S0934-8832(11)80035-1
8. Scopes R. Methods of protein purification. Moscow. 1985: 385.
9. Dawson R., Elliott D., Elliott W., Jones K. Handbook of Biochemist. Moscow. 1991: 544.
10. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976; 72: 248-254. https://doi. org/10.1006/abio.1976.9999. PMID: 942051.
11. Lalancette C., Dorval V., Leblanc V., Leclerc P. Characterization of an 80-kilodalton bull sperm protein identified as PH-20. Biol Reprod. 2001; 65(2): 628-36. https://doi.org/10.1095/biolreprod65.2.628. PMID: 11466235.
12. Morin G., Lalancette C., Sullivan R., Leclerc P. Identification of the bull sperm p80 protein as a PH-20 ortholog and its modification during the epididymal transit. Mol Reprod Dev. 2005; 71(4): 523-34. https://doi.org/10.1002/mrd.20308. PMID: 15892045
13. Methodology for measuring hyaluronidase activity. LSR-009264/09-171109 for Lidaza substance Samson-Med LLC.
14. http://www.uniprot.org/
Контактные данные
Автор, ответственный за переписку: Швецова Александра Михайловна, младший научный сотрудник, НИИ клинической и экспериментальной лимфологии - филиал ИЦиГ Со РАН, г. Новосибирск. E-mail: [email protected] ORCID: 0009-0002-7735-6032
Информация об авторах
Сведения об авторах:
Ершов Константин Игоревич, к. б. н., доцент, НИИ клинической и экспериментальной лим-фологии - филиал ИЦиГ Со РАН; Новосибирский государственный медицинский университет, г. Новосибирск. E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0003-4139-036X
Королев Максим Александрович, д. м. н., НИИ клинической и экспериментальной лимфоло-гии - филиал ИЦиГ Со РАН, г. Новосибирск. E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0002-0471-652X
Мадонов Павел Геннадьевич, д. м. н., доцент, НИИ клинической и экспериментальной лим-фологии - филиал ИЦиГ Со РАН; Новосибирский государственный медицинский университет, г. Новосибирск. Email: [email protected] ORCID: 0000-0002-1093-8938
Contact information Corresponding author: Alexandra M. Shvetsova, Junior Researcher, Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology - Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia.
E-mail: [email protected] ORCID: 0009-0002-7735-6032
Author information
Konstantin I. Ershov, Cand. Sci. (Biol.), Assistant, Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology - Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk, Russia. E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0003-4139-036X
Maksim A. Korolev, Dr. Sci. (Med.), Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology - Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia. E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0002-0471-652X
Pavel G. Madonov, Dr. Sci. (Med.), Associate Professor, Research Institute of Clinical and Experi-
mental Lymphology - Branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk, Russia. Email: [email protected] ORCID: 0000-0002-1093-8938
Поступила в редакцию 08.09.2023 Принята к публикации 27.10.2023
Для цитирования: Швецова А. М., Ершов К. И., Королев М. А., Мадонов П. Г. Результаты экспериментов по разработке высокоочищен-ной гиалуронат-эндо-р-Ы-ацетилгексозамини-дазы в качестве фармацевтической субстанции для лекарственного препарата. Бюллетень медицинской науки. 2023; 4(32): 68-80. https://doi. org/10.31684/25418475-2023-4-68
Citation: Shvetsova A. M., Ershov K. I., Korolev M. A., Madonov P. G. Experimental results on the development of highly purified hyaluronate-en-do-p-N-acetylhexosaminidase as a pharmaceutical substance for a drug product. Bulletin of Medical Science. 2023; 4(32): 68-80. https:// doi.org/10.31684/25418475-2023-4-68 (In Russ.)
