CC BY
12
© Группа авторов, 1999
Результаты биотестирования на мышцах физиологической активности низкомолекулярных полипептидов из костной
ткани собак
К.С. Десятниченко, С.Н. Лунева, С.Н. Асонова, М.А. Ковинька, Л.С. Кузнецова
Results of muscular biotesting of physiologic activity оf low-molecular polypeptides from canine bone tissue
K.S. Desiatnichenko, S.N. Luniova, S.N. Asonova, M.A. Kovinka, L.S. Kuznetsova
Государственное учреждение Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. академика Г. А. Илизарова, г. Курган (Генеральный директор — академик РАМТН, д.м.н., профессор, заслуженный деятель науки РФ В.И. Шевцов)
В зрелой компактной костной ткани выявлено наличие, по меньшей мере, 4 полипептидов с функцией инсулиноподобных факторов роста, имеющих индивидуальные физико-химические и биологические свойства и выполняющих важную роль в регуляции хондро - и остеогенеза. При их биотестировании установлено, что эти низкомолекулярные полипептиды костной ткани имеют выраженное влияние на физиологический хондро - и остеогенез. Результаты данного исследования представляют интерес в плане изучения механизмов регуляции репаративной регенерации тканей опорно-двигательного аппарата, а также создают основу для конструирования фармпрепаратов, потенцирующих эти процессы.
Ключевые слова: биотестирование, неколлагеновые белки, инсулинподобные факторы роста, хондрогенез, остео-генез.
At least 4 polypeptides with a function of insulin-like growth factors are revealed in mature compact bone tissue, which have individual physical-chemical and biological properties and are of great importance for regulation of chondro- and osteogenesis. It is established during their biotesting, that these low-molecular polypeptides of bone tissue have a marked effect on physiologic chondro- and osteogenesis. Results of the study are interesting in terms of studying mechanisms of reparative regeneration regulation in the locomotor system tissues and, besides, they form the basis of production of the pharmpreparations, potentiating these processes.
Keywords: biotesting, noncollagenous proteins, insulin-like growth factors, chondrogenesis, osteogenesis.
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы достигнуты значительные успехи в химии и физиологии полипептидных гормонов, раскрыты многие аспекты их влияния на метаболизм и функцию различных органных систем. На основе этих достижений в клиническую практику внедрены новые способы лечения неэндокринных заболеваний с использованием гормональных препаратов. Так, при патологии опорно-двигательного аппарата все большее применение находят препараты кальцито-нина (КТ) и соматотропного гормона роста (СТГ). Поиски фармакологической формы КТ привели к созданию его рекомбинантного аналога - "миокальцика" (Sandoz, Швейцария), нашедшего применение в лечении остеопороза различной этиологии [1]. Показанием к применению СТГ являются: гипоталамо-гипофизарная низкорослость, задержки развития, синдром Тернера, а также некоторые формы остеопороза у взрослых [2]. Существенным недостатком
фармакологических форм СТГ является их чрезвычайная дороговизна, вызванная видоспеци-фичностью гормона [3]. В СССР 10 лет тому назад совместными усилиями полудюжины НИИ и НПО был создан генноинженерный препарат СТГ человека - "соматоген", было освоено его производство и выпущена опытная партия на Каунасском заводе эндокринных препаратов. Новое фармсредство так и не прошло клинических испытаний в России и недоступно для практического применения.
Физиологическое действие СТГ на органы-мишени осуществляется опосредовано через местные факторы роста, не обладающие видос-пецифичностью - соматомедины, - с гипоглике-мической активностью, в связи с чем названными инсулинподобными факторами роста (ИПФР) [4,5]. Известны две формы этого низкомолекулярного полипептида - ИПФР-1 и ИПФР-2, обнаруживаемые в печени и костной
ткани. Использование ИПФР, по нашему мнению, разрешило бы проблему коррекции дефектов эндогенного биосинтеза СТГ, а также ряда заболеваний обмена веществ, патологии опорно-двигательного аппарата. В настоящее время созданные за рубежом препараты ИПФР испы-
таны на животных и находятся на стадии клинической апробации [6]. Нами также предпринята попытка выделения полипептидов с гипоглике-мической функцией из костной ткани свиней и изучения их действия на гиалиновый хрящ и зоны роста длинных трубчатых костей у мышей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для получения низкомолекулярных регуля-торных пептидов использован ранее описанный лабораторный регламент выделения неколлаге-новых белков (НБК) из зрелой компактной кости свиней, забитых на Курганском мясоконсервном комбинате [7,8]. Из смеси водорастворимых неколлагеновых белков диссоциативного экстракта костной ткани посредством гельпрони-кающей и ионообменной хроматографии выделяли 5 недиализируемых фракций с относительной молекулярной массой от 5 до 10 кД основной и нейтральной природы. Хроматографиче-ски чистые фракции полипептидов лиофильно высушивали, растворяли в изотоническом растворе хлорида натрия и в дозе от 0,25 до 1,00 мг/кг массы тела вводили подкожно и перораль-но в дозе 1 мг/кг белым мышам линии СВА с массой тела 18-20 г. Через 1 ч после введения у животных измеряли уровни глюкозы в плазме крови. Контроль реакции на процедуру опыта осуществляли на группе мышей, которым вводили по 0,1 мл 0,15 М раствор №С1. Концентрацию глюкозы в плазме крови определяли ферментативным методом, наборами фирмы "LACHEMA" (Чехия).
Композиция гипогликемических факторов, способных снижать концентрацию глюкозы в крови на 20 - 25%, была тестирована на растущих мышах (11-12 г). Животных эвтаназировали через 3 нед после ее введения в дозе 0,5 мг/кг массы тела. Комплексный морфометрический и
стереологический анализ действия тестируемых факторов роста на суставной хрящ коленного сустава и эпифизарную хрящевую пластинку бедренной и большеберцовой костей производили на гистологических срезах парасаггиталь-ных распилов тазовых конечностей мышей, которые окрашивали альциановым синим-ШИК(9).
Для суставного хряща коленных суставов оценивали следующие параметры: высоту суставной выстилки, относительный объем хондро-цитов и межклеточного вещества, число хонд-роцитов в тестовом поле зрения (численную плотность хондроцитов), численную плотность двух- и четырехчленных изогенных групп хонд-роцитов и суммарную численную плотность пролиферирующих хондроцитов, а также величину пула пролиферирующих хондроцитов в процентах от общего числа хондроцитов.
В проксимальной эпифизарной хрящевой пластинке большеберцовой кости и дистальной эпифизарной хрящевой пластинке бедренной кости оценивали относительный объем межклеточного вещества, относительный объем гипертрофированных хондроцитов, относительный объем пролиферирующих хондроцитов, численную плотность гипертрофированных и проли-ферирующих хондроцитов, высоту зоны гипертрофированных хондроцитов и зоны пролифе-рирующих хондроцитов в эпифизарной хрящевой пластинке и также ее суммарную высоту.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При тестировании на гипогликемическую активность было выявлено, что введение физраствора повышало исходный уровень глюкозы на 8,5% (р<0,05), что, вероятно, связано со стрес-сирующим влиянием условий эксперимента. Инъекция одной из испытуемых фракций -II, 10,2к - давала практически такой же эффект -+6,8% (р>0,05). Другие фракции оказали статистически значимое гипогликемическое действие: 1,10,2к в - 18,5%, II, 10,1,5к - 19,5%, 11,10,0а,0к - 43,7% и П,10,1к - 58,7% (рис. 1). На рис. 2 показана дозозависимость этого действия, которая была определена для фракции с наиболее выраженным действием. Минимальный
гипогликемический эффект выявлялся при введении препарата в дозе 0,25 мкг/кг массы тела и линейно увеличивался до дозы в 1,00 мкг/кг массы тела. Дальнейшее увеличение дозы приводило к летальному исходу.
При стереометрическом анализе суставной выстилки коленного сустава в опыте, при введении тестируемых полипептидов, по сравнению с контролем не выявлено достоверных различий в значениях относительного объема хондроцитов, относительного объема межклеточного вещества, отношения объема межклеточного вещества к объему хондроцитов и суммарной численной плотности хондроцитов.
мМоль/л 11 ■
10
7 Ф.Р.
0,060
0,125
0,250
0,500 1,000 мг/кг жив. веса
Рис. 1. Зависимость гипогликемического эффекта фракции II, 10, Ж
6,75 6^0 Я ли
3 50
5
5,07 й
Ф.Р. 11,10,2К 11,10,1 К 11,10,0К 11,10,1,5К |,10,2К
Рис. 2. Тестирование фракций костного белка на гипогликемический эффект
В то же время в опыте и контроле достоверно различается высота суставного хряща в коленном суставе. Наблюдается существенный прирост высоты гиалинового хряща - на 100 мкм в суставной выстилке мыщелков бедренной кости (115% от контрольного значения) (^<0,001) (рис. 3). и почти на 200 мкм в суставной выстилке большеберцовой кости (132% от контрольного значения) (^<0,001) (рис. 4).
820 800 780. 760' 740. 720 700. 680. 660 640
/
/
/
/
_708,9 ±12,3
Л
2 г
7\-
контроль опыт
Рис. 3. Высота гиалинового хряща суставной поверхности мыщелка бедра в коленном суставе (мкм)
950 900 850 800 750 700 650 600 550 500
контроль опыт
Рис.4. Высота гиалинового хряща суставной поверхности большеберцовой кости в коленном суставе (мкм)
При этом в суставной выстилке мыщелков бедренной кости отмечается снижение величины пула пролиферирующих хондроцитов в процентах от общего числа хондроцитов с 26% в контроле до 19% (^<0,001) в опыте. Снижение в опыте величины этого параметра в абсолютных значениях представлено на рис. 5. В суставной выстилке большеберцовой кости пул пролифе-рирующих хондроцитов в процентах от общего числа хондроцитов снижается с 19% в контроле до 14% в опыте (^<0,05). В абсолютных значениях это снижение численной плотности проли-ферирующих хондроцитов показано на рис. 6.
1800' 1600. 1400' 1200' 1000' 800 600 400 200 0
7
контроль
Рис. 5. Численная плотность пролиферирующих хондроцитов в суставной выстилке мыщелка бедра в коленном суставе (мм-2)
9
8
6--
5,01
4
2,57
2--
0
1616+72
815 + 17,8
1261 +74
1400 1200. 1000 800 600. 400 200 0
1616 + Z 91 1
' I 1261 ++ 85
А /
/
/
/
/
Г У
контроль опыт
Рис. 6. Численная плотность пролиферирующих хондроцитов в суставной выстилке большеберцовой кости в коленном суставе (мм-2)
Следует отметить, что хотя абсолютные значения величины пула пролиферирующих хондроцитов отличаются в суставной выстилке бедренной и суставной выстилке большеберцовой кости в коленном суставе, относительное снижение этого показателя в эксперименте по сравнению с контрольным значением одинаково в обеих суставных выстилках и составляет 1,4 раза. Эта же тенденция наблюдается в отношении интенсивности пролиферации хондроцитов, которую оценивали по числу двух- и четырехчленных изогенных групп в суставной выстилке коленного сустава. Число четырехчленных изо-генных групп хондроцитов в опыте достоверно снижается по сравнению с контролем (рис. 7, 8). Это снижение достигает почти 50 % (р<0,05).
565 +25
600 500
400
300 ^
200'
100 К-0
контроль опыт
Ч 2-х членные группы ■ 4-х членные группы
Рис. 7. Численная плотность 2х- и 4х-членных изо-генных групп хондроцитов в суставной выстилке мыщелка бедра в коленном суставе (мм-2)
500 400 300 200 100 0
контроль
□ 2-х членные группы
опыт
I 4-х членные группы
Рис. 8. Численная плотность 2х- и 4х-членных изо-генных групп хондроцитов в суставной выстилке большеберцовой кости в коленном суставе (мм-2)
В опытной группе снижение пула пролиферирующих хондроцитов в суставной выстилке как бедренной, так и в большеберцовой костей приводит к увеличению экспрессирующей части популяции хондроцитов. В суставной выстилке бедренной кости этот показатель увеличивается с 74% до 81% (р<0,001) (рис. 9). Аналогичный показатель в суставной выстилке большеберцо-вой кости возрастает с 81% до 86% (р<0,05) (рис. 10).
контроль опыт
■ - непролиферирующие хондроциты Рис. 9. Величина пула непролиферирующих хонд-роцитов в суставной выстилке мыщелка бедра в коленном суставе (%)
Анализируя предполагаемый механизм действия тестируемых факторов роста на суставной хрящ, можно считать, что введение исследуемых полипептидов изменяет активность клеток-мишеней их физиологического действия. Это приводит к снижению пролиферативной активности хондроцитов и уменьшает величину соответствующего пула клеток. По-видимому, тестируемые полипептиды также оказывают влияние и на частоту вступления хондроцитов в следующий митотический цикл. Об этом свидетельствует достоверное уменьшение численной плотности четырехчленных изогенных групп. В результате, выключение хондроцитов из проли-феративного цикла, наблюдаемое в опыте, стимулирует их цитодифференцировку и возрастание биосинтетической активности. Это приводит к показанному приросту высоты гиалинового хряща суставной выстилки в опыте. Следовательно, вторым и главным по значению эффектом, который наблюдается в ответ на введение исследуемых полипептидов является прирост массы гиалинового хряща за счет усиления его продукции.
контроль опыт
■ - непролиферирующие хондроциты Рис.10. Величина пула непролиферирующих хонд-роцитов в суставной выстилке большеберцовой кости в коленном суставе (%)
Второй задачей данного исследования был анализ влияния тестируемых низкомолекулярных полипептидов с гипогликемическим эффектом на физиологический энхондральный остеогенез. Нами
установлено, что в ответ на введение тестируемых полипептидов в дистальной эпифизарной хрящевой пластинке бедренной кости достоверно по сравнению с контролем возрастает численная плотность пролиферирующих хондроцитов (¿<0,001) (рис. 11) и численная плотность гипертрофированных хондроцитов (¿<0,001) (рис. 12). Возрастает относительный объем пролиферирующих хондроцитов (¿<0,001). В тоже время суммарная высота эпифизарной хрящевой пластинки в опыте достоверно снижается (¿<0,001) (рис 13), что происходит за счет снижения высоты зоны пролиферирующих хондроцитов (¿<0,001) (рис.
14).
Выявленные в опыте изменения параметров дистальной эпифизарной хрящевой пластинки бедренной кости могут свидетельствовать о стимулирующем влиянии тестируемого инсулиноподоб-ного фактора роста как на пролиферацию хондро-цитов в зонах роста трубчатых костей, так и на их дифференцировку в гипертрофированные хондро-циты. Этот вывод подтверждает увеличение численной плотности этих клеток и параллельное снижение высоты зоны пролиферирующих хонд-роцитов и суммарной высоты эпифизарной хрящевой пластинки в опыте.
В проксимальной эпифизарной хрящевой пластинке большеберцовой кости реакция на тестируемые полипептиды аналогична. Также, как и в дистальной пластинке бедренной кости, в проксимальной эпифизарной хрящевой пластинке боль-шеберцовой кости численная плотность пролифе-рирующих (рис. 15) и гипертрофированных (рис. 16) хондроцитов возрастает (¿<0,001). При этом высота зоны пролиферирующих хондроцитов и, в целом, высота эпифизарной хрящевой пластинки снижается (¿<0,001) (рис. 17, 18). Это может свидетельствовать, во-первых, о стимулирующем действии тестируемого фактора на пролиферацию хондроцитов в проксимальной эпифизарной хрящевой пластинке большеберцовой кости и, во-вторых, на их дифференцировку в гипертрофированные хондроциты.
Пероральное введение фракции П,10,1к, показавшей максимальное снижение концентрации глюкозы в крови при ее подкожном введении, обнаружило статистически достоверный гипогли-кемический эффект - понижало уровень глюкозы на 9,7% (р<0,05). Это наблюдение дает надежду на создание фармпрепарата с активностью ИПФР для перорального применения. Однако, для получения одинакового с подкожным введением эффекта при пероральном приеме такого препарата, очевидно, необходимы в 5 раз большие дозы активного полипептида. В настоящее время в пероральной заместительной терапии используются дозы гормонов белковой и полипептидной природы, в 40-50 раз превышающие таковые при внутримышечном введении [10].
2750 2700. 2650 2600. 2550. 2500 2450. 2400. 2350. 2300. 2250
/ 2715
/
/
/
/
/ 2424 +60
1 г
контроль опыт
Рис. 11. Численная плотность пролиферирующих хондроцитов в дистальной эпифизарной хрящевой пластинке бедренной кости (мм-2)
1314 +30
1112+ 23
1350 1300 1250 1200 1150 110 1051 1000
контроль опыт
Рис. 12. Численная плотность гипертрофированных хондроцитов в дистальной эпифизарной хрящевой пластинке бедренной кости (мм-2)
/ 1 2584,9+40
г Л 1
!■ 2360, 7+29,9
г Л
•
У У // У
Рис. 13. Высота дистальной эпифизарной хрящевой пластинки бедренной кости (мкм)
1 1 ГХ
■-0||л
и ГХ //////
1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350
Рис. 14. Высота слоя пролиферирующих (ПХ) и гипертрофированных хондроцитов (ГХ) в дистальной эпифизарной хрящевой пластинке бедренной кости (мкм)
контрол ь
2200
2300
2400
2500
2600
контрол ь
2800 2750 2700 2650 2600 2550 2500 2450 2400 2350 2300 2250
контроль
Рис.15. Численная плотность пролиферирующих хондроцитов в проксимальной эпифизарной хрящевой пластинке большеберцовой кости (мм2)
1300' 1250 1200 1150 1100. 1050 1000. 950.
/ 1266 + 25
/
/
/ 1088 +85
/
/ / w /
контроль опыт
Рис.16. Численная плотность гипертрофированных хондроцитов в проксимальной эпифизарной хрящевой пластинке большеберцовой кости (мм2)
г-—7 12307,9+31,7 2430,7+55,5
i
г Л
i
У У У У У
Рис.17. Высота проксимальной эпифизарной хрящевой пластинки большеберцовой кости (мкм)
6-qj*
"И |х
=L_
--иIIX
ЫГХ / / / / / /
Рис.18. Высота слоя пролиферирующих (ПХ) и гипертрофированных хондроцитов (ГХ) в проксимальной эпифизарной хрящевой пластинке больше-берцовой кости (мкм)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
контроль
2200
2250
2300
2350
2400
2450
контрол ь
1050
1100
1150
1200
1250
1300
Таким образом, проведенные нами исследования выявили в зрелой компактной костной ткани наличие, по меньшей мере, 4 полипептидов с функцией инсулиноподобных факторов роста, имеющих индивидуальные физико-химические и биологические свойства и выполняющих важную роль в регуляции хондро - и остеогенеза. При их биотестировании нами было установлено, что эти низкомолекулярные полипептиды диссоциативного экстракта костной ткани собак имеют выраженное влияние на физиологический хондро - и остеогенез с различными регуляторными механизмами. Результаты данного исследования представляют интерес в плане изучения механизмов регуляции
репаративной регенерации тканей опорно-двигательного аппарата, а также создают основу для конструирования фармпрепаратов, потенцирующих эти процессы. К настоящему времени предложен потенциальный фармпрепарат -стимбон-3 - содержащий композицию полипептидов костной ткани с гипогликемическим действием*. Он апробирован и проявил положительный эффект в эксперименте на собаках с дегенеративно-дистрофическими изменениями в суставном хряще посредством внутриартику-лярного введения. Мы полагаем, что сможем в ближайшем будущем предложить и другие фар-мсредства для лечения ортопедо-травматологических больных.
*Препарат, стимулирующий хондрогенез - "Стимбон-3", и способ его получения // Приоритет 06.08.97.(Десятниченко К.С., Лунева С.Н., Ларионов А.А.)
ЛИТЕРАТУРА
1. Остеопороз. Патогенез, диагностика и лечение: Практическое пособие для врачей / Сост.: С.С. Родионова, Л.Я. Рожинская, Е.И. Марова. - М., 1997. - 45 с.
2. Hesse V. Endokrinoologie des Kindes- und Jugendalters. - Leipzig: Thieme, 1982.
3. Клиническая эндокринология / Под ред. Н.Т. Старкова. - М.: Медицина, 1991. - 511 с.
4. Canalis E. Bone-related growth factors // Triangle. - 1988. - Vol. 27, N 1-2. - P. 11-19.
5. Differential effect of b FGF and JGF-I on matrix metabolism in calf and adult bovine cartilage explants / R.Z. San, A.C. Chem, A.J. Crodinsky, S.B. Trippel // Arch. Biochem. Biophys. - 1994. - Vol. 308, N 1. - P. 137-147.
6. Krieger D.T., Bardin C.W. Clinical endocrinology and metabolism. Principles and practice. - Grime and Stratton, 1993. - P. 43-46.
7. Выделение и биотестирование костных рострегулирующих факторов: Метод. рекомендации / ВКНЦ «ВТО»; Сост.: К.С. Де-сятниченко, Ю.П. Балдин, А.Н. Дьячков и др. - Курган, 1990. - 24 с.
8. Shevcov V.I., Desyatnitshenko K.S. Development and experimental evaluation of pharmpreparations from mature bone tissue // Skeletal Reconstruction and Bioimplantation /Ed. T.S. Lindholm. - Shringer, 1997. - P. 81-95.
9. Yamabayashi S. Periodic acid- Schiff- Alcian blue: a method for the differential staining of glycoproteins // Histochemical Journal. -1987. - N 19. - P. 565-571.
10. Гормонотерапия / Под ред. X. Шамбах, Г. Кнаппе, В. Карол. - М.: Медицина, 1997. - 414 с.
11. Способ количественной морфологической оценки действия биологически активных веществ на суставной хрящ / С.Н. Асоно-ва, К.С. Десятниченко, Г.Н. Филимонова и др. // Современные проблемы медицины и биологии : Материалы XXIX обл. науч.-практ. конф. врачей . - Курган, 1997. - С. 82-83.
Рукопись поступила 23.09.1998.
lMlirjOMi|t|i|i.ll IIÜMTiOlU Tjr^ iLDjDJH ttiütl.%^!!
Russian llizarov Scientific Centre for Restorative Traumatology and Orthopaedics runs international training courses on the Ilizarov method
The programme includes lectures, hands-on workshop and discussions of clinical cases, real-life surgeries, exposition of original Ilizarov fixators (10% discount for the course participants).
1. Introduction course on transosseous osteosynthesis after Ilizarov
Duration - 5 days Course fee - 1000 USD Participants: physicians (surgeons under 35 years old - free of charge)
2. Management of long bone fractures and their sequelae, elimination of deformities and limb lengthening
Duration - 10 days Course fee - 200 USD a day Participants - orthopaedic surgeons
3. Provision of surgeries for management of fractures and orthopaedic pathology with application of Ilizarov fixator
Duration - 5 days
Course fee - 150 USD a day
Participants - operation nurses
4. Physiotherapy in transosseous osteosynthesis after Ilizarov
Duration - 5 days
Course fee - 150 USD a day
Participants - physiotherapists
Discount is possible for large groups. The course date can be agreed upon. Additional information is obtained at:
Russian Ilizarov Scientific Centre for Restorative Traumatology and Orthopaedics
6, M.Ulianova st. Kurgan 640005 Russia Phone 35222 31732, 35121
33828
Fax 35222 36046 E-mail gip@rncvto.kurgan.ru Internet: www.ric.ru
www.rnc1.kurgan.ru
