CC BY
2
УДК 630.232.5
Хвойные бореальной зоны. 2022. Т. XL, № 5. С. 424-429
РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗА ДНК ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РАМЕТ НА ГИБРИДНО-СЕМЕННОЙ ПЛАНТАЦИИ СОСНЫ КЕДРОВОЙ СИБИРСКОЙ*
Ю. Е. Щерба1, А. А. Ибе2, Т. В. Сухих2, М. А. Шеллер2, Д. Е. Копченко3
1Сибирский государственный университет науки и технологий имени академика М. Ф. Решетнева Российская Федерация, 660037, г. Красноярск, просп. им. газ. «Красноярский Рабочий», 31 2Некомерческое партнерство «сибирский центр лесной сертификации» Российская Федерация, 660036, г. Красноярск, ул. Академгородок, 50а, 2 3Филиал ФБУ «Рослесозащита» - «Центра защиты леса Красноярского края» Российская Федерация, 660036, г. Красноярск, ул. Академгородок, 50а, 2 E-mail: shcherba_@mail.ru, aaibis@mail.ru, cherkesova-tv@yandex.ru
В статье приведены результаты генетического анализа плюсовых деревьев, произрастающих в Колыван-ском лесничестве Новосибирской области. Установлена генетическая принадлежность рамет клонов плюсовых деревьев на прививочном гибридно-семенном учебно-научном объекте (ГСП) Караульного участкового лесничества Учебно-опытного лесхоза СибГУ им М. Ф. Решетнева (юг Средней Сибири). В результате сопоставления результатов анализа ДНК клонов с генотипами плюсовых деревьев выявлены генетически подтвержденные урожайные раметы клонов 91/55 и 100/64.
Ключевые слова: сосна кедровая сибирская, плюсовые деревья, клоновое потомство, микросателлиты ядерной ДНК, генетическая паспортизация.
Conifers of the boreal area. 2022, Vol. XL, No. 5, P. 424-429
THE RESULTS OF DNA ANALYSIS FOR GENETIC IDENTIFICATION OF RAMETS ON A HYBRID SEED PLANTATION OF SIBERIAN CEDAR PINE
Iu. E. Shche^1, A. A. Ibe2, T. V. Sukhikh2, M. A. Sheller2, D. E. Kopchenko3
^eshetnev Siberian State University of Science and Technology 31, Krasnoyarskii Rabochii prospekt, Krasnoyarsk, 660037, Russian Federation 2Non-profit Partnership "Siberian forest certification center" 50a, 2, Akademgorodok str., Krasnoyarsk, 660036, Russian Federation 3Branch of the Federal State Institution "Roslesozashchita" - "Forest Protection Center
of the Krasnoyarsk Territory" 50a, 2, Akademgorodok str., Krasnoyarsk, 660036, Russian Federation E-mail: shcherba_@mail.ru, shcherba_@mail.ru, aaibis@mail.ru, cherkesova-tv@yandex.ru
The article presents the results of genetic analysis of plus trees growing in the Kolyvan forestry of the Novosibirsk region. The genetic affiliation of the ramets of clones ofplus trees growing on the grafting hybrid-seed educational and scientific facility (GSP) of the Sentry Precinct Forestry of the Educational and Experimental Forestry of the M.F. Reshetnev Siberian State University (south of Central Siberia) has been established. As a result of comparing the results of the DNA analysis of clones with the genotypes of plus trees, genetically confirmed yield ramets of clones 91/55 and 100/64 were revealed.
Keywords: siberian cedar pine, plus trees, clone progeny, grafting plantations, nuclear DNA microsatellites, genetic certification.
ВВЕДЕНИЕ
Сосна кедровая сибирская (Pinus sibirica Du Tour) -наиболее ценная лесообразующая древесная порода таежной зоны, играющая важную роль в формировании структуры и функции экосистем Сибири и России в целом. Леса с преобладанием данного вида - это почти 40 млн га или до 10 % покрытой лесом площа-
ди России. Кедровые леса, бесспорно, самые сложные и продуктивные среди сибирских и дальневосточных экосистем. Однако изменяющиеся условия окружающей среды и возникновение ряда стрессовых факторов, обусловленных хозяйственной деятельностью человека, оказывают существенное влияние на генотип и метаболизм вида, а также приводит к непосред-
Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ для молодых ученых - кандидатов наук МК-4099.2021.5.
ственной гибели кедровников. В связи с этим имеется необходимость сохранения существующего генофонда. Важнейшим этапом данного процесса, а также развитии селекции и семеноводства сосны кедровой сибирской является создание объектов единого гене-тико-селекционного комплекса (ЕГСК), в том числе архивов клонов плюсовых деревьев [3].
Для созданных несколько десятилетий назад архивов клоновых деревьев актуальными становятся генетическая паспортизация отобранного плюсового генофонда. Она позволяет установить генетическую принадлежность клонов заявленным плюсовым деревьям. В последние годы широкое применение в изучении генетических особенностей хвойных получил SSR-метод, в котором в качестве ДНК-маркеров используют кодо-минантно наследуемые ядерные микросателлитные локусы (nSSRs). Отмеченный полиморфизм микросателлитов позволяет с высокой точностью идентифицировать организм и выявить биологическое родство [9].
Цель данного исследования - идентификация клонов плюсовых деревьев сосны кедровой сибирской на учебно-научном объекте «Гибридно-семенная плантация» Учебно-опытного лесхоза СибГУ им. М.Ф. Ре-шентева. Данный объект является важнейшей базой для изучения адаптивно значимых и хозяйственно ценных селекционных признаков сосны кедровой сибирской, служит фондом генетического разнообразия этого вида.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектами исследования явились образцы хвои девяти плюсовых деревьев сосны кедровой сибирской 89/53, 90/54, 91/55, 94/58, 95/59, 97/61, 99/63, 100/64, 101/65, произрастающих в 12 выделе 36 квартала (Г33) Орско-Симанского участкового лесничества Колыванского лесничества Новосибирской области, а также результат генотипирования вегетативно раз-
Таблица 1
Таксационная характеристика плюсового древостоя
множенных деревьев сосны кедровой сибирской с использованием черенков разных вариантов, произрастающее на учебно-научном объекте «Гибридно-семенная плантация» Учебно-опытного лесхоза Сибирского государственного университета науки и технологий им. М. Ф. Решетнева [7].
Плюсовые деревья были аттестованы по урожайности в 1977 году. Таксационная характеристика древостоя, отнесенного к плюсовому по семеношению, на момент аттестации приведена в табл. 1.
Показатели сосны кедровой сибирской, аттестованной по семенной продуктивности приведены в табл. 2.
Показатели семеношения и процент приживаемости черенков плюсовых деревьев представлены по запросу сотрудниками Колыванского лесничества Новосибирской области из карточек оценки состояния плюсовых деревьев и приведены в табл. 3.
Архив клонов плюсовых деревьев был заложен на гибридно-семенной плантации (ГСП) под руководством проф. Р.Н. Матвеевой. ГСП расположена в южной части Красноярского края, на территории Мининского лесничества, в Емельяновском административном районе, в 42 квартале 5 выделе и 43 квартале 1 выделе Караульного участкового лесничества, в 1,5 километрах от краевого центра г. Красноярск [5]. Отобранные для исследования плюсовые деревья в 1988 году были размножены прививкой способом «сердцевиной на камбий» по Е.П. Проказину [4]. В качестве подвоя были взяты сеянцы сосны кедровой сибирской местного (бирюсинского) происхождения, а также подрост сосны обыкновенной. После удаления обвязки частично подверглись обрезке боковые ветви верхней мутовки подвоя, чтобы исключить опережение роста подвоя над привоем. Привитые растения располагались на расстоянии 5*5 м, густота посадки составила 400 шт. на 1 га [2].
Состав Возраст класс/лет Средняя высота, м Средний диаметр, см Класс бонитета Тип леса Полнота
9К1С 4/160 18 52 III Крт 0,6
6/110 20 44
Таблица 2
Возраст и показатели плюсовых деревьев
Номер плюсового Возраст, Высота Диаметр ствола Крона
дерева лет м % к Хср см % к Хср диаметр, м протяженность, м женский ярус, м форма
89/53 120 19 105 52 100 6,5 17,0 9,0 шаровидная
90/54 110 18 100 46 88 8,5 15,5 8,0 шаровидная
91/55 140 19 105 72 138 8,5 нет данных шаровидной
94/58 150 23 128 72 138 10,0 20,0 10,0 овально продолговатая
95/59 130 22 122 53 102 6,5 20,0 6,0 узкоцилиндрическая
97/61 140 19 105 62 120 7,0 16,0 7,0 шаровидная
99/63 120 20 111 54 104 7,0 18,0 5,0 шаровидная
100/64 110 17 94 44 84 7,0 15,0 5,0 шаровидная
101/65 130 21 116 52 100 8,0 14,5 5,0 нет данных
В рамках проведения генетических исследований был осуществлен отбор экспериментального материала с 47 изучаемых экземпляров. Методической основой проведения работ стал метод микросателлитного анализа, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Микросателлитные локусы - это участки генома с повторяющимися короткими (2-6 нуклеоти-дов) последовательностями, называемыми мотивами [6]. Число повторов в каждом локусе изменчиво от организма к организму, поэтому каждая особь характеризуется фактически уникальным многолокусным генотипом. С помощью метода электрофореза можно обнаружить изменчивость этого параметра, определив молекулярную массу изменчивого фрагмента - в данном случае аллеля. Более тяжелые молекулы (с большим числом повторов) мигрируют медленнее и на результирующей электрофореграмме можно наблюдать полиморфизм отражающий разное число повторяющихся мотивов [1].
Для исследования изменчивости микросателлит-ных локусов ядерной ДНК исследовали хвою, предварительно высушенную в сухожаровом шкафу при температуре +40 °С в течение 2-3 дней. Выделение ДНК из хвои проводилось по стандартному протоколу для растительных тканей (метод СТАВ) с применением цетилтриметил аммониумбромида [8]. Генетическую экспертизу проводили с помощью исследования 8 микросателлитных локусов ядерной ДНК (табл. 4).
Для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали коммерческий набор реагентов
GenPak®PCR Core (ООО «НПФ Генлаб», Россия), согласно инструкции фирмы-производителя. Амплификацию микросателлитных локусов проводили при следующем режиме: предварительная денатурация ДНК при 94 °C - 15 мин; далее 10 циклов, включающие 1 мин плавления при 94 °C, отжиг праймеров 1 мин при 60-50 °C (-1 °C на каждый цикл) и 1 мин. элонгации при 72 °C, следующие 25 циклов состоят из 1 мин плавления при 94 °C, отжиг праймеров 1 мин при 53 °C и 1 мин элонгации при 72 °C. Завершающий цикл элонгации проходил при 72 °C в течение 20 мин.
Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили в 6 % полиакриламидном геле (ПААГ), с использованием 1хТАЕ буфера в камерах для вертикального электрофореза (VE-20, ООО «Хе-ликон») при напряжении 200В в течение 2,5 часов. В качестве маркера стандартных длин использовалась ДНК плазмиды PBR322 E.coli, обработанная рестрик-тазой Нра11. Окрашивание гелей проводили раствором бромистого этидия с дальнейшей визуализацией ам-пликонов в УФ-свете с помощью системы гель-документации Gel-Imager. В результате были получены электрофореграммы ДНК образцов (рис. 2). Считывание результатов анализа осуществляли с помощью программы Photo-Capt V.12.4 (Vilber Lourmat). Анализ установленных генотипов проводили с помощью программы (макроса) GenAlEx, свободно распространяемой надстройки для MS Excel [9].
Таблица 3
Показатели семеношения и процент приживаемости привоя
Номер плюсового дерева Среднее количество шишек на дереве, шт. Удельная энергия семеношения, шт./см Среднее количество шишек на одном побеге, шт. Длина шишек, см Выход семян из одной шишки Приживаемость привоя, %
шт. % к ХСр
89/53 328 6,3 1,5 6,5 106 133 73,0
90/54 470 10,2 1,8 6,5 100 125 83,0
91/55 нет данных 88,0
94/58 336 4,7 2,0 6,7 94 118 90,0
95/59 353 6,6 1,7 7,8 119 149 86,0
97/61 281 4,5 1,5 7,1 108 136 90,0
99/63 253 4,7 1,7 6,4 101 126 60,0
100/64 309 7,0 1,8 8,5 122 152 97,0
101/65 243 5,9 1,6 7,6 103 118 нет данных
Таблица 4
Характеристика использованных для работы ядерных микросателлитных локусов сосны кедровой сибирской
№ п/п Локус Мотив Размер фрагмента Число аллелей, шт.
1 Ps 80612 (AAG)10 162-180 5
2 Ps 364418 (TGA)10 163-178 5
3 Ps 1502048 (AAT)n 183-201 5
4 Ps 1915155 (TAT)„ 162-183 7
5 Ps 1375177 (CAT)10 203-236 4
6 Ps 31489 (AGA)6 186-189 2
7 Ps 25981 (TATT)5 170-178 3
8 Ps 39709 (ATGT)5 202-226 3
Р51502048 Рз 1Э15155
201 МЧ 201 17? 180
18& 1Й6 183 1« ' 16Й
41 42 43 44 45 46 47 М 33 34 35 36 37 38 39 40 23 24 26 27
Р& 25981 —
17® № ^ - _ ^ 17а . 17В
1*0-
41 42 43 44 45 46 47 М 33 34 35 36 37 38 39 40
_
Р£ 31435 —
( ш
1В6
41 42 43 44 45 46 47 М 33 34 35 36 37 38 39 40
Рис. 1. Электрофореграммы продуктов амплификации локусов Ps_80612, Ps_364418, Ps_1502048, Ps_1915155, Ps_3175177, Ps_25981, Ps_31489, Ps_39709:
1-47 - порядковые номера образцов деревьев; М - маркер длины стандартных фрагментов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
По результатам исследования ДНК 9 плюсовых деревьев сосны кедровой сибирской по 8 полиморфным ядерным микросателлитным локусам были выявлены многолокусные генотипы и сопоставлены с генотипами 47 деревьев вегетативно размноженного потомства, произрастающего на плантации ГСП для установления их генетической идентичности. Результаты генотипирования плюсовых деревьев и выявления общих ДНК-профилей представлены в табл. 5.
Анализ мультилокусных комбинаций аллелей по 8 микросателлитным локусам показал, что из 56 иссле-
дованных образцов 29 относятся к разным генотипам. Выявлены 4 общих ДНК-профиля: генотип В - образец ПД 100/64 и образцы рамет 7-18, 4-18, 4-17, 3-19, 2-19, 6-17; генотип С - образец ПД 91/55 и образцы рамет 12-16, 11-16, 10а-16, 9а-16, 8-16, 8а-16, 5-15а, 316, 3-15; генотип Е - образец ПД 89/53, образец раме-ты 21-16(3); генотип G - образец ПД 94/58 и образец раметы 17-13.
В июле 2022 года на прививочной плантации ГСП был проведен учет формирования шишек у подтвержденных генетическим анализом рамет плюсовых деревьев (табл. 6).
Таблица 5
Многолокусные генотипы опытных образцов от деревьев сосны кедровой сибирской
Идентификационный номер образца (номер плюсового дерева или раметы) Многолокусные генотипы Обозначение генотипов
100/64 183192163175165177180183236236189189174178202226g В
2-19
3-19
4-17
4-18
7-18
6-17
Окончание таблицы 5
Идентификационный номер образца (номер плюсового дерева или раметы) Многолокусные генотипы Обозначение генотипов
91/55 186186163178165177177180236236186189170178214226g С
3-15
3-16
5-15а
8а-16
8-16
9а-16
10а-16
11-16
12-16
89/53 186186175175177180174180236236189189178178214226g Е
21-16(3)
94/58 186201166175168177177180236236186189178178202226g G
17-13
90/54 186186175175177177177183236236186189178178214214g 1
95/59 186186163175165177177180236236189189174178214226g 16
97/61 186192163175177180177180236236186189170178214226g 17
99/63 186186166175162177177180236236186189170178202214g 18
101/65 186186163175165177180180236236186189178178202202g 29
Таблица 6
Образование шишек на раметах разных клонов
Номер Количество шишек на дереве Максимальное количество шишек на побеге «в пучке»
клона раметы шт. % к ХСр. шт. % к Хср.
100/64 2-19 26 66,7 4 114,3
3-19 27 69,2 3 85,7
4-17 27 69,2 3 85,7
4-18 38 97,4 4 114,3
6-17 56 143,6 4 114,3
7-18 60 153,8 3 85,7
Среднее значение по клону 39 100,0 3,5 100,0
91/55 3-15 21 176,6 2 94,7
3-16 19 159,8 3 142,1
5-15а 1 8,4 1 47,4
8-16 15 126,2 2 94,7
8а-16 12 100,9 2 94,7
9а-16 9 75,7 3 142,1
10-16а 11 92,5 2 94,7
11-16 3 25,2 2 94,7
12-16 16 134,6 2 94,7
Среднее значение по клону 11,9 100,0 2,1 100,0
89/53 21-16 (3) 29 - 3 -
94/58 17-13 6 3
Максимальное количество шишек на дереве сформировали раметы 7-18, 6-17 клона 100/64 и 3-15, 3-16 клона 91/55, превысив среднее значение по клону на 43,6-76,6%. Клон 100/64 отличается наибольшим количеством формируемых шишек на побеге «в пучке» - 3,5 шт.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Исследование клонового потомства сосны кедровой сибирской, выращенного на гибридно-семенной плантации Учебно-опытного лесхоза Сибирского государственного университета им М. Ф. Решетнёва,
подтвердило их принадлежность к четырём заявленным плюсовым деревьям и прояснило схему их расположения на объекте. Результаты данной работы могут быть использованы при разработке комплекса мероприятий по дальнейшему использованию генетически ценного потомства.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Белоконь М.М., Политов Д.В., Мудрик Е.А., Полякова Т.А., Шатохина А.В., Белоконь Ю.С., Орешкова Н.В., Путинцева Ю.А., Шаров В.В., Кузьмин Д.А., Крутовский К.В. Разработка микросател-
литных маркеров сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica Du Tour) по результатам полногеномного de novo секвенирования // Генетика. 2016. № 12 (52). С. 1418-1427.
2. Матвеева Р.Н., Буторова О.Ф. Коллекция клонов, полусибов, разных морфологических форм кедра сибирского на плантациях СибГТУ (юг Средней Сибири). Красноярск : СибГТУ, 2012. 47 с.
3. Ибе А.А., Чубугина И.В., Лозицкая Г.М., Дыга-ло И.П., Шапрун Е.Н., Беляев В.В. Оценка состояния архива клонов сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica) в Западно-Саянском ОЛХ // Хвойные бореальной зоны. 2012. XXX, № 1-2. С. 77-79.
4. Проказин Е.П. Новый метод прививки хвойных для создания семенных участков // Лесн. хоз-во. 1960. № 5. С. 22-28.
5. Матвеева Р.Н., Буторова О.Ф. Селекционные объекты кедровых сосен, сосны обыкновенной, лиственницы сибирской в СибГТУ (1958-1993 гг.). Красноярск, 2013. 56 с.
6. Хедрик Ф. Генетика популяций. М. : Техносфера, 2003. 592 с.
7. Щерба Ю.Е., Ибе А.А., Сухих Т.В., Копченко Д.Е. Воспроизводство сосны кедровой сибирской на генетико-селекционной основе // Хвойные бореальной зоны. 2021. Т. 39, № 5. С. 401-407.
8. Devey M. E., Bell J. C., Smith D. N., Neale D. B., Moran G. F. A genetic linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers // Theoretical and Applied Genetics, 1996. Vol. 92, No. 6. P. 673-679.
9. Peakall R., Smouse P.E. GenAlEx V6: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research // Molecular Ecology Notes, 2006. Vol. 6, No. 1. P. 288-295.
REFERENCES
1. Belokon' M.M., Politov D.V., Mudrik E.A., Polyakova T.A., Shatokhina A.V., Belokon' Yu.S., Oreshkova N.V., Putintseva Yu.A., Sharov V.V.,
Kuz'min D.A., Krutovskiy K.V. Razrabotka mikro-satellitnykh markerov sosny kedrovoy sibirskoy (Pinus sibirica Du Tour) po rezul'tatam polnogenomnogo de novo sekvenirovaniya // Genetika. 2016. № 12 (52). S. 1418-1427.
2. Matveyeva R.N., Butorova O.F. Kollektsiya klonov, polusibov, raznykh morfologicheskikh form kedra sibirskogo na plantatsiyakh SibGTU (yug Sredney Sibiri). Krasnoyarsk : SibGTU, 2012. 47 s.
3. Ibe A.A., Chubugina I.V., Lozitskaya G.M., Dygalo I.P., Shaprun E.N., Belyayev V.V. Otsenka sostoyaniya arkhiva klonov sosny kedrovoy sibirskoy (Pinus sibirica) v Zapadno-Sayanskom OLKh // Khvoy-nyye boreal'noy zony. 2012. XXX, № 1-2. S. 77-79.
4. Prokazin E.P. Novyy metod privivki khvoynykh dlya sozdaniya semennykh uchastkov // Lesn. khoz-vo. 1960. № 5. S. 22-28.
5. Matveyeva R.N., Butorova O.F. Selektsionnyye ob"yekty kedrovykh sosen, sosny obyknovennoy, listvennitsy sibirskoy v SibGTU (1958-1993 gg.). Krasnoyarsk, 2013. 56 s.
6. Khedrik F. Genetika populyatsiy. M. : Tekhno-sfera, 2003. 592 s.
7. Shcherba Yu.E., Ibe A.A., Sukhikh T.V., Kopchenko D.E. Vosproizvodstvo sosny kedrovoy sibirskoy na genetiko-selektsionnoy osnove // Khvoynyye boreal'noy zony. 2021. T. 39, № 5. S. 401-407.
8. Devey M. E., Bell J. C., Smith D. N., Neale D. B., Moran G. F. A genetic linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers // Theoretical and Applied Genetics, 1996. Vol. 92, No. 6. P. 673-679.
9. Peakall R., Smouse P.E. GenAlEx V6: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research // Molecular Ecology Notes, 2006. Vol. 6, No. 1. P. 288-295.
© Щерба Ю. Е., Ибе А. А., Сухих Т. В., Шелер М. А., Копченко Д. Е., 2022
Поступила в редакцию 20.06.2022 Принята к печати 01.09.2022
