CC BY
14Ветеринарный врач. 2022 . № 2 . С. 63-69.
The veterinarian. 2022; (2):63-69.
Научная статья
УДК 619:615.33:638.252.44
DOI 10.33632/1998-698Х.2022_63_69
Резистентность к антибиотикам фторхинолонового ряда микроорганизмов, выделенных от погибших личинок пчел, пораженных европейским гнильцом
Варис Рафкатович Туктаров1, Галина Сергеевна Мишуковская1, Альфия Васильевна Андреева1, Эльза Равилевна Исмагилова1, Зулейха Закуановна Ильясова1
1 Башкирский государственный аграрный университет, кафедра инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы, Уфа, Россия, [email protected]
Автор, ответственный за переписку: Альфия Васильевна Андреева, [email protected]
Аннотация. Статья посвящена комплексному исследованию оценки чувствительности возбудителей европейского гнильца к антибиотикам фторхинолонового ряда - пефлоксацину и энрофлоксацину, а также к окситетрациклину. Сравнительное изучение действия трех исследованных антибактериальных средств показало более высокую чувствительность возбудителей европейского гнильца к фторхинолонам по сравнению с окситетрациклином.
Ключевые слова: пчеловодство, европейский гнилец, фторхинолоны, пефлоксацин, энрофлоксацин.
Resistance to fluoroquinolone antibiotics microorganisms isolated from dead bee larvae, affected by European foulbrood
Varis R. Tuktarov1, Galina S. Mishukovskaya1, Alfiya V. Andreeva1, Elza R. Ismagilova1, Zuleikha Z. Ilyasova1
1Bashkir State Agrarian University, Department of Infectious Diseases, Animal Hygiene and Veterinary
Sanitary Expertise, Ufa, Russia, [email protected]
Corresponding author: Alfiya Vasilievna Andreeva, [email protected]
Annotation. The article is devoted to a comprehensive study of the sensitivity assessment of European foulbrood pathogens to fluoroquinolone antibiotics - pefloxacin and enrofloxacin, as well as to oxytetracycline. A comparative study of the action of the three studied antibacterial agents showed a higher sensitivity of European foulbrood pathogens to fluoroquinolones compared to oxytetracycline.
Keywords: beekeeping, European foulbrood, fluoroquinolones, pefloxacin, enrofloxacin.
Введение. Европейский гнилец - инфекционное заболевание пчелиных семей, поражающее в основном личинок в возрасте трех-четырех дневного возраста, что приводит к сильному ослаблению и/или гибели пчелиных семей. Больные европейским гнильцом пчелиные семьи являются источником возбудителя болезни. Факторами передачи могут быть зараженные рамки, соты и другой пасечный инвентарь. Развитию и распространению болезни способствует снижение резистентности пчел в результате различных стрес-
совых факторов: сильного переохлаждения пчелиного гнезда, особенно в период весенних заморозков; недостатка корма; неблагоприятных экологических условий в пасечном секторе [1,3].
Возбудителем этого заболевания являются грамположительные кокки Melissococcus plutonius [5]. Однако часто вместе с ними у больных личинок выявляется и сопутствующая микрофлора, в состав которой входят Enterococcus faecalis, PaembaciПш alvei, Bre-vibacШus laterosporus, Achromobacter eurydice,
Bacillus pumilus, Paenibacillus dendritiformis [6,7,8].
Изучение возможности использования антибиотиков для лечения европейского гнильца показало низкую эффективность пенициллина и достаточно высокую эффективность эритромицина и окситетрациклина [9]. Особенно высокую чувствительность Melis-sococcus plutonius проявил к ампициллину и амоксициллину. Однако эти антибиотики используются в медицине, и работа с ними может вызывать аллергические реакции у человека. Злоупотребление ими, также как и окситетрациклином, может привести к контаминации меда и других продуктов пчеловодства. К тому же в последние годы отмечен рост резистентности основных возбудителей европейского гнильца к окситетрациклину [9]. Поэтому не утрачивает актуальности проблема изыскания новых методов лечения и профилактики европейского гнильца [1,4]. Интерес представляет в этом отношении возможность использования фторхинолонов в терапии гнильцовых болезней пчел.
Фторхинолоны - группа препаратов с выраженным антибактериальным действием в отношении широкого спектра микроорганизмов. Бактерицидное действие фторхинолонов заключается в ингибировании ДНК-гиразы и топоизомеразы бактериальных клеток, что нарушает синтез ДНК и приводит к гибели бактерий [2]. В результате действия фтор-хинолонов снижаются агрессивные свойства бактерий, подавляется индукция экзотоксинов и экзоферментов, повышается чувствительность микроорганизмов к фагоцитозу. По механизму действия фторхинолоны принципиально отличаются от других противомик-робных препаратов, что обеспечивает их активность в отношении резистентных, в том числе полирезистентных штаммов микроорганизмов [2].
Цель исследования - оценить чувствительность возбудителей европейского гнильца к антибиотикам фторхинолонового ряда - пеф-локсацину и энрофлоксацину.
Материалы и методы. Для проведения исследований были отобраны образцы патологического материала из пчелиных семей с клиническими проявлениями признаков ев-
ропейского гнильца с пасек ряда районов Республики Башкортостан.
После внешнего осмотра сотов с расплодом и выявления характерных признаков повреждения расплода были взяты пробы из сотов размером 10 х 15 см с больными и погибшими личинками. По 10-15 погибших личинок и корок вынимали из ячеек стерильным пинцетом, помещали в ступку, заливали 5 мл стерильного физиологического раствора и растирали до получения однородной суспензии. Подготовленный таким образом патологический материал высевали в мясо-пеп-тонный бульон (МПБ) и на мясо-пептонный агар (МПА).
Для культивирования возбудителя европейского гнильца Melisococcus plutonius готовили среду Черепова. В ходе просмотра посевов на этой среде, проведенного на пятые сутки инкубирования, выявлены колонии M. plutonius, которые имели округлую зернистую форму, жемчужно-белого цвета, диаметром 1,0-1,5 мм.
Идентификацию Enterococcus faecalis, Bacillus alvei, Brevibacillus laterosporus проводили общепринятыми методами, основанными на морфологических, тинкториальных и биохимических признаках.
Для дальнейших исследований из выросших колоний были выделены чистые бактериальные культуры возбудителей европейского гнильца.
Чувствительность возбудителей бактериальных болезней пчел, выделенных из патологического материала, к тестируемым антибиотикам определяли в лабораторных условиях методом индикаторных дисков и методом серийных разведений.
Для изучения минимальной бактерицидной концентрации пефлоксацина (ПФЦ), энрофлоксацина (ЭФЦ) и октитетрациклина (ОТЦ) в стерильных пробирках с мясо-пеп-тонным бульоном готовили последовательные десятикратные разведения испытуемых антибиотиков методом серийных разведений: 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 и 0,00001. Одновременно рост возбудителей контролировали на среде без содержания антибиотиков. Результаты бактерицидного действия испытуемых антибиотиков фиксировали ежедневно. Бакте-
рицидными считали концентрации антибиотиков, при которых не наблюдалось роста культур (отсутствие помутнения, выпадения осадка) через 72 часа (3 суток), а для анаэробов - через 144 часа (шесть суток). Концентрации, задерживающие рост культур на 48-72 часа, а для анаэробов - 120-144 часа, считали бактериостатическими.
При определении чувствительности возбудителей к антибиотикам методом индикаторных дисков, их обрабатывали десятикратными разведениями антибиотиков: 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 и 0,00001. Непосредственно перед экспериментом готовили необходимые для культивирования плотные питательные среды, которые разливали в чашки Петри. Соответственно, для Melisococcus plutonius готовили среду Черепова, а для остальных возбудителей европейского гнильца - мясо-пептонный агар с добавлением 3% глюкозы. Не позднее чем через 15 мин после посева культуры возбудителя на поверхность питательной среды, наносили диски с тестируемыми антибиотиками. При этом рост возбудителей на среде контролировали с помощью дисков без антибиотиков. Чашки Петри помещали в термостат для инкубации сразу после нанесения дисков, чтобы предотвратить предварительную диффузию антибиотика. По окончании инкубации диаметр зон задержки роста измеряли с точностью до 1 мм. При этом считалось, что отсутствие зоны стерильности свидетельствует об устойчивости возбудителя к данной концентрации антибиотика, диаметр зоны стерильности до 14 мм свидетельствует о низкой чувствительности, диаметр 15-25 мм указывает на достаточную чувствительность, диаметр более 25 мм указывает на высокую чувствительность возбудителя к заданной концентрации антибиотика.
Принцип определения чувствительности возбудителей к антибиотикам методом серийных разведений заключается в посеве микроорганизмов на чашки Петри с агаром, содержащим последовательные разведения антибиотиков. Для этого метода предварительно готовили несколько пробирок с разведением исследуемых антибиотиков в разведениях: 0,1; 0,01; 0,001 и 0,0001. При смеши-
вании с агаром в чашку сначала наливали раствор антибиотика, а затем агар, нагретый до 45-50°С. После тщательного перемешивания и равномерного распределения антибиотика в среде чашки оставляли для застывания и подсушивания на 10-12 часов. Посев чистой бактериальной культуры каждого возбудителя на агар осуществляли бактериологической петлей, а затем чашки помещали в термостат. Результаты регистрировали, помещая чашку на темную неотражающую поверхность. За бактерицидную концентрацию принимали концентрацию антибиотика, вызывающую полное торможение видимого роста культуры. Параллельно рост возбудителей контролировался на среде без содержания антибиотиков.
Результаты исследований. Как показали исследования, наименьшей чувствительностью к изучаемым антибиотикам обладают бактерии Melisococcus plutonius. Для полного подавления их роста в течение всего периода опыта требуются концентрации препаратов более высокие, чем для подавления других выделенных микроорганизмов: ПФЦ - 0,01; ЭФЦ -0,1 (таблица 1). Бактериостатическими для данного возбудителя являются концентрации: ПФЦ - 0,001; ЭФЦ - 0,01 и ОТЦ - 0,1. ПФЦ и ОТЦ в этих концентрациях вызывают задержку роста бактерий на сутки, ЭФЦ - на двое суток.
Для Bacillus alvei бактерицидными и бактериостатическими являются те же концентрации ПФЦ, что и для Melisococcus plutonium. Бактерицидный эффект ЭФЦ проявлялся при концентрации 0,01, бактериоста-тический - 0,001 (задержка роста на сутки), ОТЦ - соответственно 0,01 (задержка на трое суток) и 0,001 (двое суток).
В этом эксперименте Enterococcus fae-calis показал наибольшую чувствительность к антибактериальным препаратам. Для их подавления требовались минимальные концентрации исследуемых препаратов: ПФЦ - 0,001, ЭФЦ - 0,01 и ОТЦ - 0,1. Бактериостатический эффект проявлялся в концентрациях ПФЦ -0,0001 и ЭФЦ - 0,001 соответственно, при этом ОТЦ в концентрации 0,001.
Оценка чувствительности возбудителей к изучаемым препаратам методом серийных разведений показала, что минимальная
концентрация для проявления бактерицидной активности пефлоксацина в отношении всех возбудителей составляет 100 мкг/мл (0,01), для энрофлоксацина - 1000 мкг/мл (0,1).
Применение метода индикаторных дисков позволило получить более наглядные результаты. Визуальная оценка культур, выращенных в опыте с пефлоксацином, показала, что, несмотря на отсутствие зоны стерильности в чашках с наименьшими концентрациями препарата, рост возбудителя в них был очень слабым. Это свидетельствует о том, что даже в таких концентрациях ПФЦ ока-
Возбудитель ЕШегососсш faecalis показал наибольшую чувствительность к пефлокса-цину, концентрация антибиотика 0,001 уже является бактерицидной. При возрастающих концентрациях чувствительность этого возбудителя быстро возрастает и с концентрации 0,01 диаметр зоны задержки в 2-3 раза больше, чем у других возбудителей. Наиболее устойчива к воздействию пефлоксацина Meliso-соссш рШотш. При первых двух концентрациях эти культуры растут равномерно по
зывает ингибирующее действие на возбудителей гнильца.
При концентрации антибиотика 0,00001 у Bac. alvei появляются незначительные (d 6-8 мм) зоны задержки роста. Для этого возбудителя характерно постепенное повышение чувствительности с ростом концентрации, что, скорее всего, связано с его способностью образовывать споры. Концентрация пефлоксацина 0,1 является порогом для Bacillus alvei, выше которого эти бактерии проявляют очень высокую чувствительность, диаметр зоны задержки роста достигает 26 мм.
всей поверхности чашки и проявляют низкую чувствительность только при разведении 0,001 (d зоны задержки - 7-11 мм). И хотя Meli-sococcus plutonius и Bacillus alvei при одинаковой концентрации 0,01 начинают проявлять достаточную чувствительность к препарату, Melisococcus plutonius остается в этом диапазоне и при концентрации 0,1, тогда как Bacillus alvei имеет высокую чувствительность.
Таблица 1 - Изучение концентраций исследуемых антибиотиков
Антибиотик Разведение антибиотика Рост культуры возбудителя
Время после посева, сут.
2 3 4 5 2 3 4 5 2 3 4 5
Bac. alvei Ent. faecalis Mel. plutonius
ПФЦ 0,1
0,01
0,001 - - - + - - - - - + + +
0,0001 + + + + - + + + + + + +
0,00001 + + + + + + + + + + + +
ЭФЦ 0,1
0,01 + +
0,001 - + + + - - + + + + + +
0,0001 + + + + + + + + + + + +
0,00001 + + + + + + + + + + + +
ОТЦ 0,1 - - - - - - - - - + + +
0,01 - - - + - - - - + + + +
0,001 - - + + - + + + + + + +
0,0001 + + + + + + + + + + + +
0,00001 + + + + + + + + + + + +
Примечание: ОТЦ - окситетрациклин, ПФЦ - пефлоксацин, ЭФЦ - энрофлоксацин; + наличие видимого роста, -отсутствие видимого роста
Рисунок 1 - Чувствительность возбудителей европейского гнильца пчел к разведениям антибиотиков. Примечание: линии а и б - границы зон чувствительности: выше линии а - высокая чувствительность, между линиями а и б - достаточная чувствительность, ниже линии б - низкая чувствительность.
При визуальном осмотре выращенных культур возбудителей европейского гнильца путем нанесения дисков с энрофлоксацином зоны задержки роста вокруг колоний были незначительными или не наблюдались. Особенностью действия этого антибиотика являются неровные, слегка вдавленные края зон задержки роста. Для количественной оценки этих зон измеряли диаметры внешнего круга (по краям, наиболее удаленным от центра) и внутреннего круга (по краям, наиболее близким к центру), после чего определяли среднее значение.
Энрофлоксацин, как и пефлоксацин, действует на Bacillus alvei уже при минимальной концентрации 0,00001, образуя зону задержки роста до 10 мм. Enterococcus faecalis оказался немного более устойчивым к препарату, чем Bacillus alvei при незначительных концентрациях. Однако концентрация энро-флоксацина от 0,01 является пороговым значением для Enterococcus faecalis, зона задержки роста резко увеличивается до 34 мм в диаметре, а при разведении 0,1 достигает 42-45 мм. Дальнейшее увеличение концентрации приводит к образованию стерильной зоны, превышающей половину общей площади посева культуры (до 52 - 56 мм).
Эффект исходных концентраций энро-флоксацина на Melisococcus plutonium почти идентичен эффекту пефлоксацина. Слабая чувствительность выявляется при дозе 0,001, и только при концентрации 0,01 диаметр стерильной зоны превышает порог 14 мм, что свидетельствует о достаточной чувствительности возбудителя. При концентрациях энро-флоксацина 0,1 происходит постепенное увеличение зоны задержки роста. Высокая чувствительность к этому антибиотику (диаметр стерильной зоны 27-30 мм).
При визуальной оценке посевов, содержащих окситетрациклин, отмечается пожелтение внешней среды вокруг дисков. Такое изменение окраски, характерное для этого антибиотика, позволяет визуально наблюдать его диффузию из диска в среду. Показатели диаметра зон задержки роста при действии окситетрациклина свидетельствуют примерно об одинаковом воздействии на возбудителей, хотя в данном эксперименте оказалось, что наиболее чувствительным к действию антибиотика является возбудитель Enterococcus faecalis, а наиболее устойчивым - Melisococcus plutonium.
Заключение. Таким образом, сравнительное изучение действия трех иссле-
дованных антибактериальных средств показало более высокую чувствительность возбудителей европейского гнильца к фторхино-лонам по сравнению с окситетрациклином. Два представителя вторичной микрофлоры, Enterococcus faecalis и Bacillus alvei, проявляли высокую чувствительность к пефлоксацину даже в разведениях 0,001 и 0,01, соответственно. Для ОТЦ эти цифры соответствуют значению 0,1. Чувствительность Melisococcus plu-tonius была несколько ниже. Тем не менее, ПФЦ оказал более выраженное воздействие на этот возбудитель. Достаточная чувствительность к ПФЦ наблюдалась при разведении препарата 0,01, к ОТЦ - при разведении 0,1.
Для полного ингибирования роста всех изученных возбудителей самым низким показателем среди испытуемых препаратов является разведение пефлоксацина 0,01.
В настоящее время отказ от антибиотиков при лечении пчелиных семей, пораженных европейским гнильцом, не представляется возможным. Высокая степень чувствительности как основного возбудителя, так и сопутствующей микрофлоры к пефлоксацину позволит использовать его в более низких концентрациях по сравнению с окситетрацик-лином, и, следовательно, снизить риск контаминации продуктов пчеловодства антибиотиками.
Список источников
1. Клочко, Р. Т. Лечение и профилактика европейского гнильца / Р. Т. Клочко, С. Н. Луганский // Пчеловодство. - 2019. - № 6. - С. 18-20.
2. Петров, В. В. Фторхинолоны и их применение в клинической ветеринарии / В. В. Петров // Ветеринарное дело (Минск). - 2013. - № 8. - С. 3-9.
3. Смирнов, А. М. Эффективность ветеринарно-санитарных мероприятий в пчеловодстве / А. М. Смирнов // Пчеловодство. - 2019. - № 8. - С. 48-50.
4. Туктаров, В. Р. Исследование бактерицидного воздействия новых препаратов на возбудителей европейского гнильца. / В. Р. Туктаров, Г. Я. Суюндукова // Аграрная наука, 2012. - №1. - С. 27-28.
5. Bailey, L. Melissococcus pluton, the cause of European foulbrood of honey bees (Apis spp.) / L. Bailey // J. Appl. Bacteriol. - 1983. - С. 55, 65-69.
6. Erler, S. The curious case of Achromobacter eurydice, a Gram-variable pleomorphic bacterium associated with European foulbrood disease in honeybees / S. Erler , O. Lewkowski, A. Poehlein, E. Forsgren // Microbial Ecology. - 2018. - С. 75.
7. Forsgren, E. European foulbrood in honey bees / Е. Forsgren // Journal of Invertebrate Pathology. - 2010. - С. 103.
8. Gaggia F. Microbial investigation on honey bee larvae showing atypical symptoms of European foulbrood / F. Gaggia, L. Baffoni, V. Stenico, D. Alberoni, E. Buglione, A. Lilli, C.Porrini // Bulletin of Insectology. - 2015. - C. 321-327.
9. Stephen Doughty, Russell Goodman, Joanne Luck. Evaluating Alternative Antibiotics for Control of European Foulbrood Disease: A Report for the Rural Industries Research and Development Corporation / Stephen Doughty, Russell Goodman, Joanne Luck // Rural Industries Research and Development Corporation. - 2004. - C. 45.
References
1. Klochko, R. T. Treatment and prevention of European foulbrood / R. T. Klochko, S. N. Lugansky // Beekeeping. - 2019. - No. 6. - S. 18-20.
2. Petrov, VV Fluoroquinolones and their use in clinical veterinary medicine / VV Petrov // Veterinary business (Minsk). - 2013. - No. 8. - P. 3-9.
3. Smirnov, A. M. The effectiveness of veterinary and sanitary measures in beekeeping / A. M. Smirnov // Beekeeping. - 2019. - No. 8. - S. 48-50.
4. Tuktarov, V. R. Study of the bactericidal effect of new drugs on pathogens of European foulbrood. / V. R. Tuktarov, G. Ya. Suyundukova // Agrarian science, 2012. - No. 1. - S. 27-28.
5. Bailey, L. Melissococcus pluton, the cause of European foulbrood of honey bees (Apis spp.) / L. Bailey // J. Appl. Bacteriol. - 1983. - S. 55, 65-69.
6. Erler, S. The curious case of Achromobacter eurydice, a Gram-variable pleomorphic bacterium associated with European foulbrood disease in honeybees / S. Erler , O. Lewkowski, A. Poehlein, E. Forsgren // Microbial Ecology. - 2018. - P. 75.
7. Forsgren, E. European foulbrood in honey bees / E. Forsgren // Journal of Invertebrate Pathology. - 2010. - S. 103.
8. Gaggia F. Microbial investigation on honey bee larvae showing atypical symptoms of European foulbrood / F. Gaggia, L. Baffoni, V. Stenico, D. Alberoni, E. Buglione, A. Lilli, C. Porrini // Bulletin of Insectology. - 2015. - C. 321-327.
9. Stephen Doughty, Russell Goodman, Joanne Luck. Evaluating Alternative Antibiotics for Control of European Foulbrood Disease: A Report for the Rural Industries Research and Development Corporation / Stephen Doughty, Russell Goodman, Joanne Luck // Rural Industries Research and Development Corporation. - 2004. - C. 45.
Вклад авторов:
Туктаров В.Р.- научное руководство, обработал литературные данные.
Мишуковская Г.С. - провела исследование.
Андреева А.В. - составила и редактировала рукопись.
Исмагилова Э.Р. - провела оценку и анализ данных.
Ильясова З.З. - выполнила статистический анализ полученных данных.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Contribution of the authors:
Tuktarov V.R. - scientific guidance, research concept. Mishchukovskaya G.S. - conducted a study.
Andreeva A.V. - processed literary data, compiled and edited the manuscript. Ismagilva E.R. - conducted an assessment and analysis of the data. Ilyasova Z.Z. - performed a statistical analysis of the data obtained. Contribution of the authors: the authors contributed equally to this article. The authors declare no conflicts of interests.
Статья поступила в редакцию 18.02.2022; одобрена после рецензирования 11.03.2022; принята к публикации 30.03.2022.
The article was submitted 18.02.2022; approved after reviewing 11.03.2022; accepted for publication 30.03.2022.
© Туктаров В.Р., Мишуковская Г.С., Андреева А. В., Исмагилова Э. Р., Ильясова З. З. 2022
