CC BY
235
удк 619 616 615 зз Сохранение тетрациклина и
окситетрациклина в меде после неправильного применения этих антибиотиков в пчелиных семьях
Д. Динков, И. Канелов, И. Желязкова, И. Вашин, Тракийский университет, г. Стара Загора (Болгария)
Ключевые слова: антибиотики, пчелиный мед
Сокращения: МК - минимальная выявляемая концентрация; ОКАМ -остаточные количества антимикробных препаратов в меде; пзс - после завершающей дачи сиропа; РИД - реакция иммунодиффузии в агаровом геле; чм - частей на миллион
Введение
Обнаружение ОКАМ занимает центральное место в контроле качества и безопасности этого продукта. Аккумуляция в меде лекарственных препаратов, использованных для обработки пчелиных семей, может стать причиной аллергии и дисбактериоза у людей, которые использовали такой мед в пищу, а также выработки у микроорганизмов ан-тибиотикорезистентности [17|. В странах ЕЭС запрещено применять антибиотики против возбудителя американского гнильца [2, 7]. Такой запрет обусловлен отсутствием данных о предельно допустимых уровнях ОКАМ 11]. Несмотря на это, около 1/3 меда на европейском рынке содержит антибиотики [8]. В разных странах мира наиболее часто для борьбы с возбудителями европейского (Melissococcus pluton) и американского (Paenibacillus larvae subsp. larvae) гнильцов применяют окситетрациклин, реже тетрациклин, хлортетрациклин и доксициклин [10]. В Японии на основании микробиологических исследований допустимым уровнем остаточных количеств тетрациклина в меде стали считать 0,1 чм [11].
Разработан ряд методов определения в меде остаточных количеств антибиотиков группы тетрациклина, например, РИД [11...14, 16, 17]. Вследствие того, что в состав меда входит большое количество компонентов, в т.ч. вещества с выраженными антимикробными свойствами, ряд авторов [6, 7. 161 оценивают показания упомянутых тестов как ориентировочные.
Цель проведенного нами эксперимента состояла в определении с помощью РИД продолжительности сохранения тетрациклина и окситетрациклина в меде после обработки ими в чрезмерно высоких дозах пчелиных семей. При постановке опыта применяли желатиновые капсулы, содержавшие ио 250 мг этих антибиотиков.
Материалы и методы
В опыте использовали 9 пчелиных семей. Для каждой из них установили по паре светлоокрашенных пустых сот — из них периодически (3 раза в течение медосбора) брали мед для анализов. Методом аналогов пчелиные семьи разделили на 3 равные группы. Перед началом медосбора им 4 раза (с интервалом в 7 дней) скармливали 50%-й раствор сахара: контрольной группе без лекарственных препаратов, а двум опытным группам с тетрациклином (500 чм) или окситетрациклином (500 чм) соответственно. Предварительно извлеченные из капсул антибиотики растворяли в небольшом объеме холодной воды, а Затем полученные растворы смешивали с охлажденным до 30...40°С сиропом при постоянном перемешивании. Последний готовили из
равных частей сахара и воды. К 1 л сиропа добавляли по 2 капсулы каждого из антибиотиков. Объем сиропа, даваемого пчелиным семьям, определяли из расчета 120 мл/ рамку.
На 7, 99 и 126-й дни пзс в каждой группе семей пчел взяли по 10 проб меда из предварительно распечатанной части сотов.
Содержание антибиотиков в меде определяли в РИД, которую проводили с использованием в качестве тест-культуры Bacillus subtilis (вариант L2 штамм № 1049, Национальный банк промышленных микроорганизмов и культур клеток, София) [4, 5]. Перед исследованием пробы меда растворяли в воде в соотношении 1:1.
Все пчелиные семьи в течение эксперимента находились в одном месте для того, чтобы им досталось равное количество нектара из общего источника. Периодичность и метод взятия проб меда для анализов во всех группах были одинаковыми. Таким образом условия проведения опыта позволяли максимально снизить колебания концентрации природных антимикробных компонентов в меде пчел контрольной и опытных групп. Содержание природных антимикробных субстанций в пробах меда контрольной группы пчел определяли так же, как концентрацию тетрациклина и окситетрациклина.
Уровень статистической значимости различий показателей оценивали с помощью ANOVA. Результаты анализов проб меда, взятых на 74, 99 и 126-й дни пзс, обрабатывали статистическим методом Тьюки. Период полувыведения антибиотиков (время снижения их содержания в меде на 50%) определяли посредством регрессионного анализа.
Результаты исследований
При сопоставлении фонового уровня антимикробной активности меда с активностью тетрациклина установили, что данный показатель в среднем равен 0,2356 чм при стандартном отклонении ± 0378 и коэффициенте вариабельности 16,04 %, а при сравнении с окситетрациклином — 0,9808 чм, ± 0,1743 и 17,78% соответственно (табл. 1). Отметили отно-
1. Фоновая антимикробная активность проб меда контрольной группы пчел, выраженная эквивалентно активности антибиотиков, чм
Показатели Сроки тестирования меда, дни пзс
74-й день 99-й день 126-й день В среднем
Активность, эквивалентная тетрациклину
В среднем 0,2140 0,2760 0,2086 0,2356
Стандартное
отклонение* 0,0267 0,008 0,0254 0,0378
Коэффициент
вариабельности, % 12,48 2,89 12,17 16,04
Активность, эквивалентная окситетрациклину
В среднем 1,059 0,999 0,82 0,9808
Стандартное
отклонение* 0,1531 0,1414 0,1725 0,1743
Коэффициент
вариабельности, % 14,45 14,15 21,03 17,78
сительно низкие колебания данного показателя, что значительно снижало ошибку вычислений и позволяло считать фоновую антимикробную активность меда пчел контрольной и опытных групп одинаковой. Этот показатель вычитали из данных, полученных при определении содержания антибиотиков в меде. Необходимую точность результатов обеспечил регрессионный анализ.
Содержание тетрациклина и окситетрациклина в меде опытных групп пчел, получавших эти антибиотики с сиропом, колебалось в пределах 250...2400 чм и 300...4800 соответственно (табл. 2). МК тетрациклина и окситетрациклина, выявляемая в меде использованным тестом, составляла 300 и 600 чм соответственно, а коэффициенты корреляции г2 = 0 9797 иг2 = 0 9834
1 тетрациклина ^, и I и I окситетрациклина
В таблице 2 представлены результаты опыта, выраженные средним значением и стандартным отклонением.
2. Концентрация (чм) тетрациклина и окситетрациклина в пробах меда пчел опытных групп, получивших эти антибиотики до начала медосбора
Показатели
Срок сбора пчелами сиропа с антибиотиками, дни пзс
74-й
99-й
126-й
Тетрациклин (n = 10)
В среднем 3310 330' 30*1'2 (п = 6)
Стандартное отклонение ± 450 260 10
Окситетрациклин (п = 10)
В среднем 2503 21 О*3(п = 7) 240*(п = 5)
Стандартное отклонение ± 240 190 190
Обозначения. * <МК; ' статистически значимые различия (р < 0,01) с результатами анализа проб, взятых на 74-й день пзс;2 статистически значимые различия (р < 0,01) с результатами анализа проб, взятых на 99-й день пзс;3 статистически значимые различия (р < 0,01) с результатами анализа, проведенного в разные сроки, проб меда пчел, которым скармливали тетрациклин.
Концентрация тетрациклина в пробах меда на 74, 99 и 126-й дни пзс составила 3310 ± 450, 330 ± 260 и 30 ± 10 чм соответственно. При сравнении результатов анализа проб меда, взятых в семьях обработанных тетрациклином пчел на 74 и 99-й, а также на 74-й и 126-й дни пзс, установили статистически значимое (р < 0,01) прогрессирующее снижение антимикробной активности. Средняя продолжительность периода полувыведения тетрациклина составила 8,29 ± 1 день. Полученные нами результаты не подтверждают мнения относительно того, что тетрациклин сохраняется в пчелиных семьях до 45 дней [17].
Концентрация окситетрациклина в пробах меда на 74, 99 и 126-й дни пзс составила 250 ± 240,210 ± 190 и 240 ± 190 чм соответственно. Статистически значимые различия между этими уровнями отсутствовали. Период полувыведения окситетрациклина удалось определить только в одной из проб меда — он был равен 38,37 дням. Максимальное снижение содержания в меде этого антибиотика на 99-й день пзс (210 ± 190 чм) и повышение данного показателя па 126-й день пзс (240 ± 190 чм) можно объяснить неодинаковой интенсивностью сбора пчелами нектара, что, по всей видимости, привело к изменению концентрации меда в сотах в указанные сроки [9, 15].
Сравнение продолжительности периода полувыведения тетрациклина и окситетрациклина показало, что первый из упомянутых антибиотиков исчезает из меда в 4 раза быстрее второго. Динамика снижения содержания окситетрациклина в меде в нашем эксперименте отличалась от описанной С. Вангеловым и П. Парвановым [18], определявшими ее in vitro при 35...37 °С. В проведенном этими авторами опыте порошкообразный антибиотик смешивали с
цветочным медом в концентрации 500000 чм. Через 30, 120, 210 и 760 дней пзс концентрация окситетрациклина в меде снизилась до 365490, 2660 и 1900 чм соответственно. Таким образом, условия проведения обоих экспериментов обусловили различия их результатов.
Сравнив концентрацию тетрациклина и окситетрациклина в меде пчел, обработанных этими антибиотиками (табл. 2), можно заметить наличие статистически значимых различий (р <0,01) на 74-й и 99-й дни пзс и их отсутствие на 126-й день пзс.
Обратнофазная жидкостная хроматография под высоким давлением [3] показала, что окситетрациклин разрушается в меде в течение 5...9 нед на ряд дериватов. Использованный нами тест (РИД) не выявляет эти вещества. Несмотря на такой недостаток, данный микробиологический метод широко применяют, поскольку он довольно чувствителен, прост и позволяет проводить массовые анализы. Наши эксперименты полностью это подтвердили. Поэтому считаем, что РИД можно применять для предварительных исследований меда на наличие антибиотиков. После установления в этой реакции повышенной общей антимикробной активности меда последний следует дополнительно исследовать другими тестами на наличие антибиотиков.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Anonymous. Council Regulation (EEC) № 2377/90 of 26.06.1990 laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products of animal origin. Official J Europ Comm, 18.08.1990, № L 224, pp. 0001-0008.
2. Anonymous. EC Commission Regulation (EC) No 49/2000. Official J Europ Comm, 11, 1,2000, L6, 0013-0014.
3. ArgauerRJ., Moats W.A. Degradation of oxytetracycline in honey as measured by fluorescence and liquid chromatographic assays. Apidologie, 1991, 22, 109-115.
4. Arret В., Johnson D.P., KirshbaumA. Outline details for microbiological assays of antibiotics: Second revision. J Pharm Sci, 1971, 60, 1689-694.
5. Bennett J.V., BrodieJ.L, BennerE.J, KirbyM.M. Simplified, accurate method for antibiotic assay of clinical specimens. Appl Microbiol, 1966, 14, 170-177.
6. Bogdanov S., Ruri P. Honigqualitflt und Antibiotikarbckstflnde. Schweizerische Bienen-Zeitung, 2000, 123, 7, 407-410.
7. Bogdanov S. Nature and origin of the antibacterial substances in honey. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, 1997, 30, 748-753.
8. Bogdanov S., Imdorf A., Kilchenmann V. et al. The contaminants of the bee colony. Bulg J Vet Med, 2003, 6, 2, 59-70.
9. LazarovA., Mitev В., RadoevL. et al. Beekeeper's Encyclopedia. Union of the Beekeepers in Bulgaria (Shumen), Apimondia Publishing House, Bucharest, 1991, pp. 277-357.
10. Lehnert T. & Shimanuki H.. European foulbrood disease control in honeybee colonies used for blueberry and cranberry pollination. Amer Bee J, 1980, 120, 429-430.
11. Nakazawa H., FujitaM., Horie M. & TakebaK. Problems on residual antibacterial agents in livestock products (2). Chikusan no Kenkyu, 1992, 46, 135-139.
12. PetkovR. & Gechevl. Methods for detection of residual antibiotics and sulphonamides in bee honey. Vet Med (Sofia), 1998, 4, 3-4, 193-196. .
13. Petkov R. A method for identification of nonspecific inhibiting zones in testing bee honey for antibiotic residues. Vet Med. (Sofia), 1999, 5, 1, 34-36.
14. Petkov R. A comparison of the methods for detection of tetracycline residuals in bee honey. Vet Med (Sofia), 2000, 6,1, 28-31.
15. Ryahovskii V.I. Honey, Beeswax, Propolis. Uradzhai, Minsk, 1983, 32-48.
16. Simonenkova G. Antibiotics in honey. Beekeeping (Moskow), 1990, 5, 44-45.
17. SmirnovA.M. About the contents of antibiotics in honey. Beekeeping (Moskow), 1969, 5, 28-29.
18. Vangelov St. & Parvanov P. Preservation of the activity of antimicrobial substances in the bee honey. Vet Sci (Sofia), 1992, 26, 3, 62-66.
SUMMARY
D. Dinkov, I. Kanelov, I. Zhelyazkova, I. Vashin. Persistence of tetracycline and oxytetracycline in bee honey after improper application on bee families. Bulg J Vet Med, 2005, 8, 3, 205-209.
Authors studied the changes of tetracycline & oxytetracycline concentration in the honey after feeding these antibiotics to bees with sugar solution. The antibiotic content in the honey was determined through the agar-gel diffusion method, using Bacillus subtilis, variant 12.
Ш •
-
WM * **
