CC BY
13MEDICAL SCIENCES
REVASCULARIZATION OF THE DEFECT IN THE AREA OF THE ATTACHED GUM ON THE MUCOSA OF THE ALVEOLAR PROCESS OF THE LOWER JAW IN RATS AFTER CLOSURE WITH A MATRIX WITH BIOLOGICALLY ACTIVE MATERIALS
Vyshnevska H.
candidate of medical Sciences State Establishment «The Institute of Stomatology andMaxillo-Facial Surgery
National Academy of Medical Science of Ukraine»
Kakabadze Z. doctor of medicine Tbilisi State Medical University Schneider S. doctor of medicine
State Establishment «The Institute of Stomatology and Maxillo-Facial Surgery
National Academy of Medical Science of Ukraine»
РЕВАСКУЛЯРИЗАЦИЯ ДЕФЕКТА В ОБЛАСТИ ПРИКРЕПЛЕННОЙ ДЕСНЫ НА СЛИЗИСТОЙ АЛЬВЕОЛЯРНОГО ОТРОСТКА НИЖНЕЙ ЧЕЛЮСТИ У КРЫС ПОСЛЕ ЗАКРЫТИЯ МАТРИКСОМ С БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМИ МАТЕРИАЛАМИ
Вишневская А.А.
кандидат медицинских наук
Государственное учреждение «Институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии
Национальной академии медицинских наук Украины»
Какабадзе З.Ш. доктор медицинских наук Тбилисский Государственный Медицинский Университет
Шнайдер С.А. доктор медицинских наук
Государственное учреждение «Институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии
Национальной академии медицинских наук Украины»
Abstract
A comparative analysis of the revascularization of a defect in the area of the attached gum, on the mucosa of the alveolar ridge of the lower jaw, using various types of biological matrices from the decellularized amniotic membrane (DAM), the decellularized amniotic membrane in combination with the growth factors PRP (DAM + PRP) and the amniotic in combination with PRP growth factors and hyaluronic acid (DAM + PRP + HA). The group in which the matrix was covered by PRP growth factors at the initial stages of the study had a larger number of small-caliber vessels, which suggests the stimulation of revascularization precisely due to the action of vascular growth factors. When a biologically active matrix with growth factors PRP and hyaluronic acid were combined in group 4, the vasculature after healing of the defect was uniform, indicating a complete restoration of revascularization and the absence of cicatricial changes in the area of the restored defect.
Аннотация
В работе проводится сравнительный анализ реваскуляризации дефекта в области прикрепленной десны, на слизистой альвеолярного отростка нижней челюсти с использованием различных видов биологических матриксов из децелюлляризованной амниотической мембраны (ДАМ), децелюляризованной амниотической мембраны в сочетании с факторами роста PRP (ДАМ + PRP) и децелюляризованной ам-ниотической мембраны в сочетании с факторами роста PRP и гиалуроновой кислотой (ДАМ + PRP + ГК). Группа, в которой матрикс покрывался факторами роста PRP, на начальных периодах исследования имела большее количество сосудов мелкого калибра, что дает возможность предположить стимуляцию реваскуляризации именно за счет действия сосудистых факторов роста. При комбинации биологически активного матрикс с факторами роста PRP и гиалуроновой кислотой, в 4 группе, сосудистая сеть после заживления дефекта имела равномерный характер, что говорит о полном восстановлении реваскуляриза-ции и отсутствии рубцовых изменений в области восстановленного дефекта.
Keywords: revascularization, regeneration, PRP growth factors, hyaluronic acid.
Ключевые слова: реваскуляризация, регенерация, факторы роста PRP, гиалуроновая кислота.
Введение
Регенеративная медицина является перспективным решением для восстановления дефектов тканей. Однако, ключевая проблема заключается в том, как сохранить живую ткань после имплантации. Идеальный матрикс должен быть биосовместимым и биоразлагаемым и, что более важно, демонстрировать хорошее взаимодействие с эндо-телиальными клетками для стимулирования ан-гиогенеза.[1]
Ангиогенез - это физиологический процесс, который позволяет формировать новые кровеносные сосуды либо из локальных сосудистых структур, либо из циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников, мобилизованных из костного мозга и привлеченных к месту неоваскуляризации. Очень важно снабжать ткани кислородом и питательными веществами во время роста, эмбрионального развития или регенерации тканей в ответ на травмы. Таким образом, слизистая альвеолярного отростка сильно васкуляризи-руется плотной сетью мелких и средних артерий, а также капилляров и венул. В случае травмы быстрое восстановление ткани возможно через эту сосудистую сеть. Однако после восстановления вас-куляризации при восстановлении тканей процесс ангиогенеза отрицательно регулируется антиан-гиогенными молекулами. Контроль баланса между про- и антиангиогенными агентами имеет решающее значение, для регуляции приживления имплантированного матрикса.
На сегодняшний день для работы с мягкими тканями полости рта используют различного рода трансплантаты для увеличения объема тканей при пластической пародонтальной хирургии и имплантации. Аутогенные субэпителиальные трансплантаты соединительной ткани все чаще применяются при эстетических показаниях, таких как утолщение мягких тканей, лечение рецессии, сохранение гребня, увеличение гребня мягких тканей и восстановление папиллы. Для клинической эффективности сбора и трансплантации соединительной ткани требуется фундаментальное понимание анатомии на донорских участках и глубокие знания процессов интеграции и реваскуляризации тканей. Возможными донорскими участками являются переднее и заднее нёбо, включая бугристость верхней челюсти, обеспечивающую трансплантаты различной геометрической формы и гистологического состава [2-3]. Некоторые авторы предполагают, что подслизистая ткань не включается в трансплантат, потому что это может помешать реваскуляризации трансплантата. В этих случаях деэпителизированный трансплантат десны получают с помощью поверхностного метода сбора, при котором глубокая часть подслизистой оболочки и надкостница исключаются из трансплантата
[4] .
Еще одним вариантом, применяемым в стоматологии является клеточный дермальный матрикс, который представляет собой биосовместимый материал, полученный из соединительной ткани человека и животных. Этот материал создается хи-
мическим процессом, при котором удаляются все эпидермальные и дермальные клетки, но биологически активный дермальный матрикс остается нетронутым. Биоактивный кожный матрикс обладает способностью стимулировать естественную ревас-куляризацию, репопуляцию клеток и подвергаться ремоделированию тканей, поскольку он содержит эластин, коллаген, биоактивные белки и каналы кровеносных сосудов. В последнее время эти материалы успешно использовались в качестве трансплантатов в многочисленных хирургических процедурах для увеличения размера прикрепленной десны, окружающей зубы и имплантаты, для устранения рецессии десны [4].
Богатая тромбоцитами плазма (РКР) и ее производные были исследованы и применены в регенеративной медицине, в качестве дополнения к средам для культивирования клеток, что последовательно усиливает пролиферацию, миграцию и дифференцировку стволовых клеток. Кроме того, клиническая полезность РЯР подтверждается данными о том, что РЯР содержит высокие концентрации факторов роста и белков, которые способствуют процессу регенерации. Терапия, основанная на РЯР, является экономически эффективной, а также обеспечивает доступность и безопасность использования собственных пациента [5]. Роль тромбоцитов широко известна в первичном гемостазе и тромбозе, но все больше экспериментальных и клинических данных идентифицируют эти энуклеированные клетки как соответствующие модуляторы других физиопатологических процессов, включая воспаление и регенерацию тканей. Кроме того, из-за их первичного аутологичного происхождения проблемы передачи заболевания или иммуногенных реакций могут не приниматься во внимание. Таким образом, обогащенные тромбоцитами материалы стали очень актуальными в последнее десятилетие и представляют собой растущий фокус экспериментальных и клинических исследований в контексте заживления ран и регенерации тканей. Однако, несмотря на различные применения, эффективность регенеративного лечения с использованием PRP ставится под сомнение из-за отсутствия крупных контролируемых клинических испытаний и отсутствия четких протоколов в отношении методов подготовки PRP [6].
Внеклеточный матрикс играет важную роль в контроле ангиогенеза, обеспечивая, по крайней мере, распределение факторов роста и регуляцию миграции эндотелиальных клеток. Среди этих матричных компонентов гиалуроновая кислота играет главную роль в механических свойствах соединительных тканей в обеспечении их гидратации. Этот гликозаминогликан представляет собой полимер большого размера, продукты распада которого сильно влияют на ангиогенез, особенно в патологических ситуациях. Что касается его биологических и механических свойств, гиалуроновая кислота используется в качестве матрицы в тканевой инженерии для улучшения реваскуляризации тканей, таких как кожа [7].
Целью данного исследования является оценка реваскуляризации дефекта слизистой альвеолярного отростка при закрытии его децелюлляризиро-ванной амниотической мембраной (ДАМ) в сочетании с факторами роста РЯР и гиалуроновой кислотой (ГК).
Материалы и методы исследования. Для
экспериментальных исследований были выбраны 96 белых лабораторных крыс линии Вистар, обоих полов, массой 200-250 г и 1 крыса была донором для получения крови для изготовления РЯР. После эвтаназии путем внутрибрюшинного введения летальной дозы 0,5 % раствора тиопентала натрия у крысы собирали кровь в пробирку, которую затем помещали в центрифугу Кокшал H-9R (Япония). Производили центрифугирования в режиме 1600 оборотов в течение 20 минут при температуре 29 °С. После центрифугирования из пробирки отбирали верхний и средний слои и переносили их в чистую пробирку, которую помещали в центрифу-
гу, и выполняли второй этап центрифугирования в режиме 400 оборотов в течение 15 минут. Таким образом была получена плазма, разделена на 2 фракции: верхний слой - плазма, обеднена тромбоцитами; нижний слой - плазма, обогащенная тромбоцитами. Для получения биологически активной мембраны в сочетании с факторами роста РЯР и гиалуроновой кислотой 1 мл РЯР смешивали с 0,5 мл гиалуроновой кислоты в стерильной чашке.
Лиофилизированную амниотическую мембрану помещали в чашку Петри и проводили ре-гидратацию 0,9 % раствором №С1 в течение 40 минут (рис. 1). Далее, регидрованну амниотиче-скую мембрану помещали на стерильный столик и покрывали ее переднюю поверхность РКР с гиалу-роновой кислотой. После этого мембрану переворачивали и покрывали обратную сторону мембраны также используя РЯР и гиалуроновую кислоту.
Рис. 1. Предметное стекло. Пористая структура матрицы бесклеточной ткани, увеличение х 400.
Животные были разделены на 4 группы по 24 в каждой. Всем животным предварительно создавали модели дефекта слизистой оболочки альвеолярного отростка нижней челюсти. С помощью хирургических ножниц высекали участок слизистой оболочки альвеолярного отростка до муко-
гингивальной линии, то есть на участке прикрепленной десны, не повреждая надкостницы и кости, что приводило к образованию дефекта слизистой оболочки овальной формы, диаметром 3 мм (рис. 2).
Рис. 2. Дефект слизистой оболочки альвеолярного отростка.
Рис. 3. Дефект слизистой закрыт ДАМ.
Первую группу составили крысы (п = 24, 12 самцов и 12 самок) с дефектом слизистой оболочки альвеолярного отростка нижней челюсти, которым проводилось лечение доведя контроль.
Животным второй группы (п = 24, 12 самцов и 12 самок) дефект слизистой оболочки восстанавливали децелюляризированной регидрированой амниотической мембраной, которая фиксировалась к краям дефекта узловыми швами с использованием атравматической иглы 7/0 (ЕШкоп). Размер и форма амниотической мембраны была адаптирована к размеру дефекта (рис. 3.).
Животным третьей группы (п = 24, 12 самцов и 12 самок) дефект слизистой закрывали децелю-ляризированной регидрированой амниотической мембраной с нанесенным на ее поверхности PRP. Амниотическая мембрана фиксировалась к краям дефекта также как у животных первой группы.
Животным четвертой группы (п = 24, 12 самцов и 12 самок) дефект слизистой восстанавливали децелюляризированной регидрированой амниоти-ческой мембраной с нанесенным на ее поверхности PRP и гиалуроновой кислоты.
После операции животные содержались в стандартных условиях вивария и выводились из эксперимента на 3, 7, 14 и 30 сутки после операции внутрибрюшной инъекцией летальной дозы 0,5 % раствора тиопентала натрия.
Оценку реваскуляризации проводили методом количественной оценки вновьобразованных сосудов. Для этого на 3, 7, 14 и 30 день после моделирования и проведения лечения были выбраны по 10 животных для рентгенконтрастного метода исследования и метода трансиллюминации. Для проведения рентгенконтрастного метода исследования у животных (п = 5) в условиях общей анестезии выделяли общую сонную артерию, которую промывали 0,9 % физиологическим раствором с гепарином, после чего вводили рентгенконтраст-ное вещество (Кардиотраст) одновременно подвергая животных рентгенологическому исследованию. Для проведения метода трансиллюминации у животных (п = 5) в условиях общей анестезии выделял общую сонную артерию и яремную вену. После промывания общей сонной артерии 0,9 % физиологическим раствором с гепарином вводили латекс (ЫАЖГТ-ЬЗ, Армения), окрашенный в красный цвет, а в яремную вену латекс окрашенный в синий цвет. После этого слизистая альвеолярного отростка иссекалась вместе с окружающими тканями и помещалась между двумя предметным стеклами, которые фиксировались пластырем. Для количественной оценки вновь образованных сосудов в области дефекта использо-
вали метод трансиллюминации, просвечивая объекты в проходящем свете с внедрением микроскопа MBS-9 (Россия).
Результаты и их обсуждение. Как показало проведенное исследование, сразу же после формирования дефекта слизистой оболочки десны возникшее кровотечение быстро останавливалось в результате формирования плотного фибринозного сгустка. Первые сутки характеризовались отеком мягких тканей раны, фиброзным воспалением с незначительным количеством серозного экссудата.
При оценке реваскуляризации методом трансиллюминации уже на 7 сутки в группе с биологически активным матриксом, состоящим из деце-люлляризированной амниотической мембраны в комбинации с факторами роста РЯР и гиалуроно-вой кислотой отмечалась хорошо развитая сосудистая сеть с наличием вновь образованных сосудов различного диаметра (рис. 4).
При оценке сосудистой сети с помощью рент-генконтрастного метода на начальных сроках исследования картина реваскуляризации в 1 и 2 группах практически не отличалась. В 3 группе, с факторами роста РИР преобладало количество мелких сосудов и был очень незначительный процент сосудов среднего калибра и сосуды имели более разветвленную сеть. В 4 группе процентное соотношение сосудов составляло: 65 % - мелких сосудов, скорее всего за счет факторов роста РИР, 20% -среднего и 15 % - крупного калибра за счет добавления в состав биологически активного мат-рикса гиалуроновой кислоты и ее свойств гидратации. Более серьезные отличия видны при рентген-контрастном исследовании на 30 сутки (диаграмма 1). На рентгенограммах макропрепаратов нижней челюсти лабораторных животных четко видно, что в первой группе совсем незначительное количество сосудов и они в основном крупного калибра, что говорит о восстановлении кровоснабжения в области дефекта слизистой оболочки, но при этом не произошло восстановление мелких сосудов, которые в основном и питают десну (рис. 5). В препаратах 2,3 и 4 группы выяснены сосуды различного калибра, что говорит о способности стимулировать ангиогенез децелюлляризированной амниотической мембраной (рис.6). В 3 и 4 группах тоже есть отличия, хотя они и незначительны, в четвертой группе по сравнению с третьей сосудистая сеть имеет более равномерное распределение в слизистой оболочке, что делает незаметным область, на которой ранее был дефект слизистой (рис. 7). В третьей же группе сосуды больше сконцентрированы в области восстановленного дефекта слизистой (рис. 8).
Рис. 4. Трансиллюминация сосудов у животных с ДАМ+РКР+ГК. Срок наблюдения 7 сутки.
Видны фиксирующие мембрану швы.
Рис. 5. Рентгенограмма с контрастным веществом сосудов слизистой оболочки альвеолярного отростка на нижней челюсти крысы, в контрольной группе. Срок наблюдения 30 суток.
Рис. 6. Рентгенограмма с контрастным веществом сосудов слизистой оболочки альвеолярного отростка на нижней челюсти крысы, в группе с ДАМ. Срок наблюдения 30 суток.
Рис. 7. Рентгенограмма с контрастным веществом сосудов слизистой оболочки альвеолярного отростка на нижней челюсти крысы, в группе с ДАМ+ РКР. Срок наблюдения 30 суток.
Рис. 8. Рентгенограмма с контрастным веществом сосудов слизистой оболочки альвеолярного отростка на нижней челюсти крысы, в группе с ДАМ+ PRP+ ГК. Срок наблюдения 30 суток.
Диаграмма 1. Процентное распределение кровеносных сосудов разных диаметров, 7 сутки.
Выводы. Образование сосудистой сети в области дефекта прикрепленной десны на альвеолярном отростке нижней челюсти произошло во всех группах лабораторных животных. Исследуемая группа, в которой матрикс покрывался факторами роста PRP, на начальных периодах исследования имела большее количество сосудов мелкого калибра, что дает возможность предположить стимуляцию реваскуляризации именно за счет действия сосудистых факторов роста. В группе где комбинировали биологически активный матрикс с факторами роста PRP и гиалуроновой кислотой сосудистая сеть после заживления дефекта имела равномерный характер, что говорит о самом лучшем варианте как заживления так и реваскуляри-зации, полном отсутствии рубцовых изменений в области восстановленного дефекта.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Cherng-Kang Perng. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides / Cherng-Kang Perng, Yng-Jiin Wang, Chi-Han Tsi, Hsu Ma. // J. Surgical Research. 2011; Jun 1; 168(1): 9-15. DOI: 10.1016/j.jss.2009.09.052
2. Otto Zuhr. The Addition of Soft Tissue Replacement Grafts in Plastic Periodontal and Implant Surgery: Critical Elements in Design and Execution / Otto Zuhr, Daniel Bäumer, Markus Hürzeler // J Clin Periodontal. 2014 Apr;41 Suppl 15:123-42. doi: 10.1111/jcpe.12185.
3. Lu W. Clinical efficacy of acellular dermal matrix for plastic periodontal and implant surgery: a systematic review / W Lu, G Qi, Z Ding, X Li, W Qi, F He // International Journal of Oral & Maxillofacial Surgery - 2019. Dec 27; - 0901-5027(19)31438-9. doi: 10.1016/j.ijom.2019.12.005. Online ahead of print.
4. Emilio L Azar Histologic and Histomorpho-metric Analyses of De-epithelialized Free Gingival Graft in Humans / Emilio L Azar, Mariana A Rojas, Mandalunis Patricia, Nelson Carranza // Int J Perio-dontics Restorative Dent. - Mar/Apr 2019. - № 39(2). - P. 221-226. doi: 10.11607/prd.3544.
5. Julia Etulain. Platelets in Wound Healing and Regenerative Medicine / Julia Etulain // Platelets. -2018 Sep; - №29(6). - P. 556-568. doi: 10.1080/09537104.2018.1430357. Epub 2018 Feb 14.
6. Sara Catarina Nunes da Silva Santos. Blood Plasma Derivatives for Tissue Engineering and Regenerative Medicine Therapies / Sara Catarina Nunes da Silva Santos, Olafur Eysteinn Sigurjonsson, Catarina de Almeida Custodio, Joao Filipe Colardelle da Luz Mano // Tissue Eng Part B Rev. - 2018 Dec; -№24(6). - P. 454-462. doi: 10.1089/ten.TEB.2018.0008.
7. Lataillade J-J.Implication of Hyaluronic Acid in Normal and Pathological Angiogenesis. Application for Cellular Engineering / Lataillade J-J., Albanese P., Uzan G. // Ann Dermatol Venereol. - 2010 Apr; - 137 Suppl 1. - P.15-22. doi: 10.1016/S0151-9638(10)70004-1.
