CC BY
29
DOI: 10.23868/202112008
РЕПАРАТИВНАЯ РЕГЕНЕРАЦИЯ ГИСТОГЕНЕТИЧЕСКИ РАЗЛИЧНЫХ КОСТЕЙ
П.С. Подлужный, Е.В. Пресняков, Н.И. Жемков, И. Сорочану, Поступила:0l.KJ2œi
РВ Пеев Принята к печати: 13.12.2021
р . Деев Опубликована on-line: 21.12.2021
Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
REPARATIVE REGENERATION OF HISTOGENETICALLY DIFFERENT BONES
P.S. Podluzhnyi, E.V. Presnyakov, N.I. Jemkov, Sorochanu I, R.V. Deev
I.I. MechnikovNorth-Western State Medical University, Saint Petersburg, Russia
e-mail: paul_podluzhnY@mail.ru
Костные пластины, формирующие панцирь черепах, различаются по гистогенезу. Так, костальные и невральные пластины карапакса (спинного щита) имеют мезенхимное происхождение и развиваются путём непрямого перихондрального остеогенеза из позвонков и рёбер. Костные пластины пластрона — брюшного щита, как считается, образованы из нейроэктодермальных клеток нервного гребня и развиваются путём интрамембранного остеогенеза в дерме кожи.
Цель исследования: сравнение репаративной регенерации гистогенетически различной костной ткани карапакса и пластрона пресноводных красноухих черепах Trachemys scripta.
Эксперимент выполнен на пресноводных красноухих черепахах Trachemys scripta возрастом 3 месяца. Сформировано по 2 дефекта костных пластин карапакса и пластрона диаметром 5 мм, глубиной до «мягких тканей» с дальнейшим гистологическим исследованием. Установлено, что регенерация костных пластин пластрона отличается образованием костной ткани в большем объёме и на более раннем сроке. Через 30 сут. образуется слой непрерывной новообразованной костной ткани. К 90 сут. доля костной ткани в регенерате карапакса составила 40,5% от площади дефекта, в то время как в пластроне регенерат занимал 47,4%.
Таким образом, внутримембранно образованная костная ткань нейроэктодермального гистогенеза обладает более выраженным регенераторным потенциалом по сравнению с пери-хондрально сформированной костью, имеющей мезенхимное происхождение.
Ключевые слова: регенерация, костная ткань, пластрон, карапакс, черепахи, остеогенез, нервный гребень, мезенхима.
The bone plates that forming the turtle shell differ in histogenesis. Thus, the costal and neural plates of the carapace (dorsal shield) have mesenchymal origin and develop by indirect perichondral osteogenesis from vertebrae and ribs. The bone plates of the plastron — abdominal shield, are known to be formed from neuroectodermal cells of the neural crest and develop by intramembrane osteogenesis in the dermis of the skin.
The aim of the study was to compare the reparative regeneration of histogenetically different bone tissue of the carapace and plastron of freshwater red-eared turtles Trachemys scripta.
The experiment was performed on freshwater red-eared turtles Trachemys scripta aged 3 months. 2 defects of carapace and plastron bone plates with a diameter of 5 mm and a depth of up to "soft tissues" were formed with further histological examination. It was found that the regeneration of the bone plates of the plastron is characterized by the formation of bone tissue in a larger volume and at an earlier date. After 30 days a layer of continuous newly formed bone tissue is formed. By 90 days the proportion of bone tissue in the carapace regenerate was 40,5% of the defect area, while in the plastron the regenerate occupied 47,4%.
Thus, intramembranous formed bone tissue of neuroectoder-mal histogenesis has a more pronounced regenerative potential compared to perichondral formed bone of mesenchymal origin.
Keywords: regeneration, bone tissue, plastron, carapace, turtles, osteogenesis, neural crest, mesenchyme.
Введение
Панцирь черепах включает в себя дорсально расположенный карапакс (спинной щит) и пластрон (брюшной щит), расположенный вентрально. Оба щита покрыты роговым слоем (многослойный плоский ороговевающий эпителий), представленным роговыми щитками и чешуйками, глубже располагается костный слой в виде отдельных костных пластин [1]. Карапакс состоит из невральных и костальных пластин, по бокам к которым примыкают периферальные пластины (рис. 1). Пластрон включает четыре парные (эпи-, гио-, гипо- и ксифипластрон) и одну непарную костную пластину (энтопластрон).
Гистогенез костных пластин, составляющих карапакс и пластрон, различен. Так, невральные и костальные пластины карапакса имеют мезенхимный гистогенез и развиваются по механизму непрямого перихондраль-ного остеогенеза позвонков и рёбер [1, 2]. Для костных пластин пластрона описан нейроэктодермальный генез — из мигрирующих клеток нервного гребня; они развиваются путём интрамембранного остеогенеза в дерме кожи, образуя так называемую «кожную кость» [3-6]. Выбор черепах в качестве модели для исследования связан с удобной локализацией костной ткани различного гистогенеза у одногоорганизма и дефицитом информации о регенерации панциря.
Е.С. Данини в 1946 году провёл первый эксперимент по оценке регенераторного потенциала костных пластин карапакса взрослой болотной черепахи Emys orbicularis [7]. Он установил, что «размах регенерации кости у черепахи очень небольшой», полноценная кость не формируется даже к 225 сут., процесс реституции прекращается с образованием рубцовой ткани.
Б
/ /Ч1 х / ( 2 '— \ 1 3 \
4
5
Рис. 1. Схема строения костных пластин панциря Trachemys scripta: А — карапакс, 1 — невральные пластины, 2 — костальные пластины, 3- периферальные пластины; Б — пластрон, 1 — эпипластрон, 2 — энтопластрон, 3 — гиопластрон, 4 — гипопластрон, 5 — ксифипластрон
Раннее выполнен эксперимент с моделированием дефекта костных пластин карапакса красноухой черепахи Trachemys scripta возрастом 3 месяца [8]. Было установлено, что уже на 90 сутки весь объём дефекта был представлен грубоволокнистой костной тканью трабекулярного строения.
Целью настоящего исследования является сравнение репаративной регенерации гистогенетически различной костной ткани карапакса и пластрона взрослых пресноводных красноухих черепах Trachemys scripta.
Материал и методы
Исследование выполнено на 9 пресноводных крас-ноухих черепахах Trachemys scripta искусственного разведения, возрастом 3 месяца. После общей анестезии (Золетил 100, 8 мг на 1 кг массы тела животного внутримышечно) формировали по 2 дефекта карапакса и пластрона диаметром 0,5 см, глубиной до мягких тканей. Дефект спинного щита приходился на костальные пластины в месте пересечения роговых борозд, дефект брюшного щита проецировался на костные пластины гиопластрона. Материал для гистологического исследования забирали через 30, 60 и 90 сут.
Зону дефекта костных пластин выпиливали и подвергали декальцинации, после стандартной гистологической пробоподготовки окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Маллори. Гистоморфометрию проводили путём подсчёта долей новообразованной костной и соединительной тканей в площади дефекта, линейные размеры регенерата при помощи программы Aperio Imagescope (Leica Biosystems, Германия).
Результаты и обсуждение
В карапаксе через 30 сут. после повреждения костальных пластин чётко визуализировалась истонченная непрерывная область дефекта в виде утолщенного эпидермиса с подлежащими рыхлой и плотной волокнистыми соединительными тканями, их доля составила 51% (рис. 2, 30 сут.). При этом по периферии дефекта обнаруживали небольшой участок новообразованной костной ткани, который занимал 1,7% от всей площади дефекта (рис. 3, 30 сут.). Средняя толщина регенерата составила 216 ± 103 мкм.
Рис. 2. Гистотопограммы карапакса через фронтальную плоскость зоны дефекта через 30, 60 и 90 сут.: 1 — зона дефекта, 2 — плотная волокнистая неоформленная соединительная ткань, 3 — новообразованная костная ткань, 4 — рёберный хрящ. Окраска гематоксилином и эозином (сверху), по Маллори (внизу). Ув. х8
М
Рис. 3. Структура регенерата в дефекте карапакса через 30, 60 и 90 сут.: 1 — эпидермис, 2 — плотная волокнистая соединительная ткань, 3 — новообразованная костная ткань. ГЭ — окраска гематоксилином и эозином; М — окраска по Маллори. Ув. х100
30 сут.
60 сут.
___-_____ __ТУТ ^ дт^Ч '«*»» «ЕГ°Ж*8« i
Через 60 сут. от начала эксперимента дефект карапакса характеризовался нечёткими очертаниями и был заполнен в основном рыхлой и плотной волокнистыми неоформленными соединительными тканями, их содержание увеличилось до 61% (см. рис. 2, 60 сут.). При этом доля костного регенерата увеличилась до 13,5% от площади дефекта (см. рис. 3, 60 сут.). Межбалочные ячейки регенерата содержали элементы рыхлой волокнистой соединительной ткани. Средняя толщина регенерата 850± 73 мкм.
Через 90 сут. во всём объёме повреждения костальных пластин карапакса образована непрерывная сеть балок, построенных из грубоволокнистой костной ткани (см. рис. 2, 90 сут.), её доля составила 40,5% от всего дефекта (см. рис. 3, 90 сут.). Доля соединительной ткани снизилась до 20%. Средняя толщина регенерата увеличилась до 1126 ± 106 мкм.
В пластроне через 30 сут. после повреждения костных пластин к чётко очерченной зоне дефекта прилегал тканевый детрит с фрагментами костной ткани (см. рис. 4, 30 сут.). С поверхности области повреждения выявлялся истончённый эпидермис с подлежащими плотной неоформленной и рыхлой волокнистыми соединительными тканями, они занимали 35,8% от площади дефекта (см. рис. 5, 30 сут.). При этом костный регенерат уже образовывал непрерывную пластинку грубоволокнистой костной ткани, её доля составила 24,6% от площади дефекта. Средняя толщина регенерата составила 534± 90 мкм.
На 60 сут. от начала эксперимента структура зоны повреждения оставалась прежней, при этом содержание новообразованной костной ткани заметно увеличилось до 49,4% (см. рис. 4, 60 сут.). Доля соединительной ткани снизилась до 23,3%. На большем увеличении по сравнению с предыдущим временным промежутком заметно более плотное строение трабекул новообразованной костной ткани (см. рис. 5, 60 сут.). При этом средняя толщина регенерата составила 898 ± 180 мкм.
Через 90 сут. характеристика изменилась несущественно (см. рис. 4, 90 сут.) — относительно предыдущего срока снизилось количество подлежащей соединительной ткани до 1 3,8%, доля костного регенерата вследствие ремоделирования снизилась до 47,4% от общей площади дефекта. При большем увеличении зоны неоо-стеогенеза имели типичное трабекулярное строение, при этом лакуны содержали относительно меньшее количество соединительной ткани (см. рис. 5, 90 сут.). Средняя толщина регенерата равна 1211 ± 182 мкм.
Необходимо отметить, что ни на одном из сроков наблюдения не выявлялось выраженной воспалительной реакции, визуализировались лишь единичные лейкоциты. При этом в процессе образования костной ткани встречались типичные остеобласты призматической формы с базофилией цитоплазмы. Также выявлялись единичные остеокласты в виде многоядерных гигантских клеток овальной формы.
Динамика изменений в тканевом составе дефектов карапакса и пластрона представлена на рисунке 6 и 7 соответственно.
Рис. 4. Гистотопограммы пластрона через фронтальную плоскость зоны дефекта на 30, 60 и 90 сут.: 1 — зона дефекта, 2 — тканевый детрит, 3 — плотная волокнистая неоформленная соединительная ткань, 4 — новообразованная костная ткань, 5 — костный регенерат в составе тканевого детрита. Окраска гематоксилином и эозином (сверху), по Маллори (снизу). Ув. х8
Заключение
В обоих отделах панциря репаративный остеогистоге-нез реализуется как прямой, без стадии формирования провизорной хрящевой или костно-хрящевой «мозоли». Причем восстановление пластрона (нейроэктодермаль-ный гистогенез) очевидно начинается с самых ранних сроков и к 90 сут. приводит к развитию регенерата с большей долей ретикуло-фиброзной костной ткани.
30 сут.
ГЭ
60 сут.
90 сут.
М
Рис. 5. Структура регенерата в дефекте пластрона через 30, 60 и 90 сут.: 1 — эпидермис, 2 — плотная волокнистая соединительная ткань, 3 — новообразованная костная ткань. ГЭ — окраска гематоксилином и эозином, М — окраска по Маллори. Ув. х100
со CP CD I CD l_ CD CP о; m о О.
70 60 50 40 30 20 10 0
51
1,7
30
61,1
13,5
I
60 Сут.
40,5
20
II
90
Рис. 6. Доля костной (синий цвет) и соединительной ткани (красный цвет) в дефекте карапакса на 30, 60 и 90 сут.
со CP CD I
CD
60
50
40
30
CD CP о;
a 20
10
49,4
35,8
23,3
30
60
Сут.
47,4
13,8
II
90
Рис. 7. Доля костной (синий цвет) и соединительной ткани (красный цвет) в дефекте пластрона на 30, 60 и 90 сут.: синие столбцы — костная ткань, красные столбцы — соединительная ткань
0
Пластины карапакса (мезенхимный гистогенез) демонстрируют начало органотипического восстановления только с 60 сут.
Дефект костальных пластин карапакса на 30 сутки не формирует непрерывную костную ткань, тем не менее к 90 суткам зона дефекта во всём объеме имеет типичное строение грубоволокнистой костной ткани. В отличии от карапакса, костные пластины пластрона уже на 30 сутки образуют непрерывный слой тонкой грубоволокнистой костной ткани, её доля занимает 24,6% дефекта. К 90 суткам объём новообразованной костной ткани увеличивается до 47,4% от площади дефекта. Средняя толщина регенерата в карапаксе увеличилась с 216 ± 103 мкм на 30 сут. до 1126 ± 106 мкм на 90 сут. В то же время в пластроне средняя
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Черепанов Г.О. Панцирь черепах: происхождение и развитие в онто- и филогенезе [диссертация]. Санкт-Петербург. 2004. [Cherepanov G.O. Turtle shell: origin and development In onto- and phylogenesis [dissertation]. St. Petersburg. 2004].
2. Hirasawa T., Nagashima H., Kuratani S. The endoskeletal origin of the turtle carapace. Nat. Commun. 2013; 4: 2107.
3. Gilbert S.F., Loredo G.A., Brukman A. et al. Morphogenesis of the turtle shell: the development of a novel structure in tetrapod evolution. Evol. Dev. 2001; 3(2): 47-58.
толщина дефекта увеличилась с 534 ± 90 мкм на 30 сут. до 1211 ± 182 мкм на 90 сут. Необходимо отметить, что при оценке значимости различий морфометрических показателей ^-критерий Стьюдента) только на 30 сут. средняя толщина регенерата различается значимо в различных отделах панциря (р=0,032).
Полученные данные не соотносятся с общепринятыми представлениями о репаративной регенерации костной ткани различного гистогенеза. Так, в частности, общепринятыми являются сведения о критической недостаточности костеообразования в плоских костях черепа у млекопитающих (эктомезенхимный, нейроэктодермаль-ный источник развития) [9-11]. Установленный факт побуждает провести дополнительный поиск причин влияющих на остеогистогенез в различных отделах скелета.
4. Cebra-Thomas J.A., Betters E., Yin M. et al. Evidence that a lateemerging population of trunk neural crest cells forms the plastron bones in the turtle Trachemys scripta. Evol. Dev. 2007; 9(3): 267-77.
5. Cebra-Thomas J.A., Terrell A., Branyan K. et al. Late-emigrating trunk neural crest cells in turtle embryos generate an osteogenic ectomes-enchyme in the plastron. Dev. Dyn. 2013; 242(11): 1223-35.
6. Goldberg S., Venkatesh A., Martinez J. et al. The development of the trunk neural crest in the turtle Trachemys scripta. Dev. Dyn. 2020; 249(1): 125-40.
7. Данини Е.С. Гистологические наблюдения над регенерацией кости щита черепахи Emys Orbicularis L. Изв. АН СССР. Биол. науки 1946; 5: 58194. [Danini E.S. Histological observations on the regeneration of the shield bone of the turtle Emys Orbicularis L. Bull. USSR Acad. Sci. Biol. Sci. 1946; 5: 581-94].
8. Деев Р.В., Подлужный П.С., Гальков С.С. и др. Пилотное исследование репаративной регенерации костной ткани панциря молодых особей Trachemys scripta. Гены и Клетки 2020; XV(4): 66 -69. [Deev R.V., Podluzhnyi P.S., Galkov A.V. et al. Pilot study of bone tissue reparative regeneration of the young Trachemys scripta shell. Genes & Cells 2020; 15(4): 66 -69].
9. Канторова В.И. Возможные источники остеогенеза при регенерации костей свода черепа у взрослых млекопитающих. Цитологические
механизмы гистогенезов. М., 1979: 227-9. [Kantorova V.I. Possible sources of osteogenesis in the regeneration of the bones of the cranial vault in adult mammals. Cytological mechanisms of histogenesis. M., 1979: 227-9].
10. Полежаев Л.В. Замещение дефектов черепа регенерирующей костью. Вопр. нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко 1982; 2: 53-7. [Polezhaev L.V. Replacement of skull defects with regenerating bone. Burdenko's Journal of Neurosurgery1982; 2: 53-7].
11. Деев Р.В. Анализ репаративной регенерации костей крыши черепа. Морфология 2007; 132(6): 64-9. [Deev R.V. Analysis of reparative regeneration of skull roof bones. Morphology 2007; 132(6): 64-9].
