CC BY
23
34
Украгнський нейрохгрурггчний журнал, №4, 2007
УДК 616.833.15-091.934-003.93-085:615.357].001.4
Рем1ел1шзащя зони входу тршчастого нерва пщ впливом аплжацп прогестерону в експеримент
Чомоляк Ю.Ю.
Ужгородський нащональний ушверситет Представлен! результата експериментального досл!дження рем!ел!н!зац!! кор!нця тршчастого нерва (ТН) з використанням ориг!нально! модел! локально! токсично! дем!ел!н!зац!!. В!дновлення м!ел!ново! оболонки оц!нювали за допомогою св!тлово!, електронно! м!кроскоп!!, а також !муног!стох!м!чних метод!в. При апл!кац!! 2,5% розчину прогестерону на дем!ел!н!зовану д!лянку ТН в!дзначене достов!рне прискорення в!дновлення м!ел!ново! оболонки.
Ключов1 слова: невралг1я тршчастого нерва, патогенез, стискання нерва судиною, нейроваскулярний конфлшт, рем1ел1тзащя, експеримент.
Вступ. Мшроваскулярна декомпреая ТН е методом вибору xipyprÍ4Horo л!кування за його невралг!!. Розроблений у 60-Ti роки минулого столгття P. Jannettа метод передбачае встановлення шертного матер!алу м!ж кор!нцем ТН, частше м!ж зоною його входу та судиною, яка стискае цю зону Незважаючи на абсолютну в!дсут-н!сть больового синдрому через 2 тиж шсля виконання операц!! бшьш н!ж у 82% пац!ент!в, через 10 роюв цей ефект спостер!гають т!льки у 63,5% [5].
За даними численних морфолопчних та елект-роф!з!олог!чних досл!джень ТН ключовою ланкою у патогенез! есенц!ально! невралг!! ТН е локальна дем!ел!н!зац!я д!лянки його кор!нця, яка контактуе з близько розташованою судиною [1]. Зрозум!ло, що наведен! ранн! шсляоперацшш результати не пов'язан! з рем!елш!зац!ею декомпремованих д!лянок ТН. Проте, щ результати, на нашу думку, були б б!льш ст!йкими за умови повноц!нно! рем!ел!н!зац!!. Адже, результати мшроваскулярно! декомпресп ТН у хворих з розс!яним склерозом за недостатньо! рем!ел!н!зац!! набагато г!рш! в пор!внянн! з такими у пац!ент!в без первинно-дем!ел!н!зуючих захворю-вань [6]. Недостатня (аберантна) рем!елш!зац!я, яку !нколи спостер!гають у препаратах ТН, отриманих п!сля ризотом!!, не забезпечуе !золяц!ю аксон!в його кор!нця п!сля декомпрес!! ! може спричиняти реци-диви захворювання [4].
На нашу думку, ефектившсть м!кроваскулярно! декомпрес!! при невралг!! ТН можна п!двищити шляхом покращання рем!ел!н!зац!! д!лянки нейро-васкулярного конфлшту.
Одним з ефект!в прогестерону за його впливу на перифер!йну нервову систему е стимуляц!я утворення м!ел!ново! оболонки [2, 3], що доведено як in vitro, так in vivo. Кр!м того, прогестерон е ефективним стимулятором в!дновлення м!ел!ново! оболонки пошкодженого нерва. За даними елект-ронно! м!кроскоп!! прогестерон-!ндукована м!ел!нова оболонка не в!др!знялась в!д тако! в !нших д!лянках нерва. На думку деяких автор!в [3], прогестерон, швидше за все, не !н!ц!юе процес рем!ел!н!зац!!, а стимулюе його. Незважаючи на очевидний стимулю-вальний вплив прогестерону на процес рем!ел!н!зац!!, кл!н!чне використання гормону для покращання регенерац!! м!ел!ново! оболонки не вивчене.
Метою досл!дження е визначення стимулюваль-ного впливу аплшацп 0,1мл 2,5% розчину прогестерону на рем!ел!н!зац!ю зони входу ТН в експеримент! на гв!нейських свинках.
Матер1али i методи дослщження. План та зм!ст експериментального досл!дження розроблен! в!д-
пов!дно до укра!нських (наказ МОЗ Укра'!ни №»281 в!д 01.11.2000 р. «Про заходи з подальшого вдосконалення орган!зац!йних норм роботи з використанням екс-периментальних тварин») та м!жнародних (Правила проведення роб!т з використанням лабораторних тварин, 1977; GLP, 1981; Конвенц!я Ради ввропи про охорону хребетних тварин, яких використовують в експериментах та !нших наукових ц!лях, 1986; Principles and Practice in Ethical Review of Animal Experiments Across Europe, FELASA Report, 2005) стандарт!в, схвален! етичною ком!с!ею Ужгородського нац!онального ун!верситету.
Для досл!дження використовували статевозр!-лих гв!нейських свинок (Cavia porcellus) обох статей масою т!ла 200-350 г. Тварини виведен! у в!вар!ю Ужгородського нац!онального ун!верситету. Загальна к!льк!сть тварин — 20 за однаково! к!лькост! самиць та самц!в. До групи пор!вняння включен! 10 тварин обох статей.
Для знеболювання використовували 5% розчин кетам!ну (Кетам!н, Фармак) об'емом 0,2 мл, який готували п!д час експерименту ! вводили внутр!шньом'язово у стегнову д!лянку. При необ-х!дност! введення повторювали з розрахунку 10 мг кетам!ну на 1 год наркозу. Перед розр!зом шк!ри зд!й-снювали пошарову !нф!льтрац!ю д!лянки розр!зу 2% розчином л!дока!ну (Л!дока'!н-Дарниця, Укра'!на).
Застосований ориг!нальний х!рург!чний доступ до кор!нця ТН через середню черепну ямку (патент №25050 в!д 25 липня 2007 р.). Д!лянку попереду вушно! раковини праворуч п!сля гол!ння оброб-ляли 70% етиловим спиртом (Спирт етиловий 70%, Дн!пропетровська ФФ). П!д час експерименту вико-ристовували стерильн! матер!али та !нструменти. П!сля !нф!льтрац!! операц!йного поля виконували дугопод!бний розр!з м'яких тканин у прав!й скро-нево-т!м'ян!й д!лянц! навколо вушно! раковини. Пошарово розр!зали шк!ру, п!дшк!рний прошарок, скроневий м'яз. Гемостаз зд!йснювали шляхом там-понування д!лянки кровотеч! ватними турундами. За допомогою распатор!в в!дд!ляли м'язи в!д т!м'яно! к!стки до скронево! л!н!!.
Для подальших ман!пуляц!й використовували операц!йний м!кроскоп Carl Zeiss OPMI з зб!льшен-ням в 14 раз!в (Carl Zeiss, Н!меччина) та м!кро!нс-трументи (Aesculap, Н!меччина). Трепанац!ю черепа виконували за допомогою м!н!дрел! та стоматоло-г!чних бор!в (Татарстанський ЦНТ1, Рос!я). Тверду оболонку головного мозку розр!зали по краю трепа-нац!йного в!кна паралельно скронев!й л!н!!. Поверхню мозку зволожували !зотон!чним розчином натр!ю
Ремгелгнгзацгя зони входу тргйчастого нерва nid впливом аплгкацгг прогестерону в експериментг
35
хлориду та вкривали ватними смужками. Шсля змщення за допомогою мшрошпателя скронево-потилично! частки медГально проводили асшрацш спинномозково! рГдини для полегшення ретракцп мозку. Шд максимальним збшьшенням мшроскопа вГзуалГзували намет мозочка, його вирГзку та екс-традурально розташований тршчастий вузол. Для доступу до коршця ТН розрГзали намет мозочка мшроскальпелем. В окремих спостереженнях для вГзуалГзацп коршця ТН та дшянки його входу у стов-бур мозку було достатньо вирГзки намету мозочка.
Вплив розчину прогестерону на ремГелшГзацш коршця ТН вивчали шляхом хрошчного експери-менту з використанням власно! моделГ локально! токсично! демГелшГзацп 0,1% розчином етидш бромГду (висновок про видачу декларацшного патенту, реест-рацшний номер заявки: u 2007 10235, дата подання заявки: 14.09.2007). На 14-ту добу шсля встановлення прокладки з 0,1% розчином етидш бромГду тварин оперували повторно. Шд час операцп виявляли прокладку з волокнистого тефлону та вводили в ïï товщу 2,5% розчин прогестерону об'емом 0,1 мл (дослана група) або нейтральну сезамову олш об'емом 0,1 мл (контрольна група). Операцшну рану зашивали пошарово наглухо. Через 29 дГб з моменту шдукцп демiGлiнiзацiï (тобто, на 15-ту добу шсля аплжацп прогестерону) тварини дослiдноï групи i групи порГв-няння виведенi з експерименту. Препарати коршщв ТН разом з прилеглими дшянками стовбура мозку та тршчастого вузла дослiджували з використанням морфолопчних та iмуногiстохiмiчних методик.
Шсля втручання тварин утримували у дерев'яних клггках по 3 особини одше! статi. У клiтки потрап-ляло сонячне свiтло, пiдлога вистелена тирсою. Температура повiтря становила 19-21°С, вiдносна вологiсть — 70-80%. У примщенш забезпечувалась вентиляцiя з 10-разовою змiною повiтря кожно! години. Кожна тварина мала номер та мГтку Доступ до води та корму був вшьним. Воду подавали у засоби для смоктання. Рацюн вiварiю включав гранульо-ваний комбiкорм, кашу з м'ясом, сир, хлiб та овочГ, зокрема, моркву, капусту. Рацюн не змшювали про-тягом всього перюду експерименту. Використовували посуд з нержавшчо! сталi.
Результати та ïx обговорення. Морфологiчнi дослiдження включали свГтлову та електронну мiкроскопiю, проведенi також iмуногiстохiмiчнi дослiдження. В дiлянцi впливу на 29-ту добу вiд початку експерименту без додаткового впливу спостерГгали поновлення типово! пстоархиек-тонiки коршця ТН. Проте, вГдзначали дистрофiчнi змши аксонiв з вогнищевим порушенням цШсносл мГелшово! оболонки (рис. 1 кольоровог вкладки), а також щшьш мiелiновi утворення, якi у виглядi краплеподiбних включень безладно розташованi в товщГ нервового волокна. Визначали великi осмю-фiльнi аксони з напливами нейроплазми, значно виражений iнтерстицiальний та периваскулярний набряк (рис. 2 кольоровог вкладки), в деяких судинах виявляли пристiнковi тромби. ВГдзначене збшьшення дiаметра осьових цилiндрiв, поряд з зменшенням дiаметра мiGлiновоï оболонки, вiдносно такого у контроле Нейролемоцити в основному, були з ознаками морфофункцюнально! активностi, про це свГдчила поява в ядрГ, заповненому еухромати-ном, одного великого щшьного ядерця. Крiм того, за даними специфiчноï iмуногiстохiмiчноï реакцiï для визначення пролiферативноï активностi (виявлення
клггин в усiх фазах мiтотичного подшу) виявлене нерiвномiрне й незначне збшьшення кiлькостi таких клiтин. 1ндекс мiчення специфiчним антитiлом (1М Ki-67) нейролемоципв становив (0,8-1,4)±0,7%. Пiд час електрономшроскошчного дослiдження в цитоп-лазмi спостерГгали збiльшення кiлькостi фiксованих та вшьних рибосом, полiсомних розеток, а також появу молодих форм миохондрш (рис. 3 кольоровог вкладки). Проте, в нервових волокнах утримувалися ознаки фокальних деструктивних змш мiелiну й вираженi ознаки набряку пери- та ендоневрш. У тварин без додатково! корекцiï спостерГгали нерГв-номiрнiсть набряку та збереження дистрофiчних змiн в тканинi коршця. Поряд з дшянками, яю мГс-тять численнi клiтини i судини, виявляли дшянки з невеликою кшьюстю клггин i капiлярiв, пучками колагенових волокон. При Гмунофенотипуванш (1М Ki-67) виявлено значну пролiферативну активнiсть клгтин стшки судин (з боку периневрального простору), проте, судинний малюнок дуже нерГвномГр-ний, — визначали безсудинш зони.
Шд час дослщження зразкiв нервово! тканини шсля додаткового фармаколопчного впливу на корь нець ТН встановлено, що пстоархиектошка нервових волокон набула фГзюлопчних сшввщношень i на момент дослщження практично вГдновлена. Спостерь гали значну гшерплазш нейролемоципв, яю оточу-вали осьовГ цилшдри, значне дифузне збшьшення кшькосл з вГропдним зростанням пролГфератив-ного потенцГалу та утворенням «кластерГв» (рис. 4—6 кольоровог вкладки). 1М Ki-67 нейролемоципв становив (4,2-5,1)±0,05%. В осьових цилшдрах збшьшена кшьюсть мГтохондрш, переважно молодих форм. В периневральному просторГ спостерГгали регенероваш безмГелшовГ волокна, включеш по декшька в цитоплазму нейролемоцилв.
У сполучнш тканиш вГдзначено невелику кшь-юсть фГбробласпв та лаброципв. У порГвнянш з групою без додаткового впливу суттево збшьшена юльюсть макрофапв, фГбробласив, бшьшшть з яких характеризуються високою функцюнальною актившстю.
Таким чином, в динамщ ремГелшГзуючого про-цесу на тлГ корекцп з використанням прогестерону тканина коршця ТН i стовбура мозку характеризуемся зменшенням ступеня демГелшГзацп, кшь-кост олГгодендроглюцилв, що гинуть, у вогнищах ураження, покращанням морфофункцюнального стану елеменпв коршця та мозку, зокрема, внасль док зменшення набряку, нормалГзацп проникносл гематоенцефалГчного та гематоневрального бар'ерГв, пристосовно-компенсаторних мехашзмГв у клГтинних елементах (активГзацГя бшоксинтезуючих функцш) i, як наслГдок, активно! пролГферацп нейролемоципв та клгтин стшки судин. За даними морфометрич-ного дослщження встановлено активацш синте-зуючо! функцп олГгодендроглюципв, стимуляцш пролГферацГ! нейролемоцитГв, припинення процеыв деструкцГ! та залучення репаративно-регенератор-них процесГв в ресинтезГ мГелшових оболонок корГнця (див. таблицю).
Висновки. 1. МГсцеве використання 0,1 мл 2,5% розчину прогестерону не впливае на життедГяльшсть статевозрших гвГнейських свинок протягом 15 дГб пГсля експерименту.
2. За даними морфолопчних дослщжень (сви-лова та електронна мГкроскопГя, ГмуногГстохГмГя) не вста-
36
Чомоляк Ю.Ю.
Таблиця. Змши сшввщношення площ! осьових цил1ндр1в та м!елшового нервового волокна
npuMimKa. Pi3HHöH noKa3HHKiB äocTOBipHa y nopiBHHHHi 3 TaKH-mh: * — y KOHTpom; A — npH peMie^iHi3aöii 6e3 nporecTepoHy.
HOB^eHO cHCTeMHe nomKoflweHHa TKaHHHH ro^oBHoro Mo3Ky TBapHH Ha T,ni an^iKaöi'i nporecTepoHy.
3. 3a MicöeBoro 3acTocyBaHHA nporecTepoHy AocToBipHo 3MeHmyeTbca cniBBiflHomeHHH n,nom;i ocboBoro öH^iHflpa i Mie^iHoBoro HepBoBoro Bo^oKHa y TBapHH floc^iflHo'i rpynH TKaHHH y nopiBHHHHi 3 TaKHMH y KoHTpo^i.
4. 3acTocyBaHHH 2,5% po3HMHy nporecTepoHy cnpwae AocToBipHoMy npwcKopeHHM peMie,niHi3au;ii KopiHöH TH b eKcnepwMeHTa^bHMX TBapHH.
CnMCOK ^iTepaTypM
1. Hilton et al. Pathological findings associated with trigeminal neuralgia caused by vascular compression // Neurosurgery. — 1994. — V.35, N2. — P.299-303.
2. Koenig H.L., Gong W.H., Pelissier P. Role of progesterone in peripheral nerve repair // Reviews of Reproduction. — 2000. — V.5. — P.189-199.
3. Koenig H.L., Schumacher M., Ferzaz B. et al. Progesterone
synthesis and myelin formation by Schwann cells // Science. — 1995. — V.268. — P.1500-1502.
4. Love S., Coakham H.B. Trigeminal neuralgia: pathology and pathogenesis // Brain. — 2001. — V.124, N12. — P.2347-2360.
5. Lovely T., Jannetta P. Microvascular decompression for trigeminal neuralgia. Surgical technique long-term results // Neurosurg. Clin. N. Am. — 1997. — V.8, N1. — P.11-29.
6. Resnick D., Jannetta P., Lunsford D. Microvascular decompression for trigeminal neuralgia in patients with multiple sclerosis // Surg. Neurol. — 1996. — V.46. — P.358-362.
PeHne^MHM3aQHa 30hm exo,a TpoMHMHHoro Hepea 110,4 u.iiiiiiiiiieivi aiiii.iiiiKau,iui
nporecTepoHa e экcпepмнeнтe HOMOAHK
npe^cTaB^eHM pe3y,bTaTbi экcпepммeнтa,пbнoгo Mcc,e-AOBaHKH peMMe,MHM3M;MM KopemKa TpoMHMHHoro HepBa c Mcno,b3oBaHMeM opMrMHa,bHoM Mofle,M ,oKa,bHoM tok-cMHecKoM AeMMeiMHM3a;MM. BoccTaHoB,eHMe MMe,MHoBoM o6o,ohkm o;eHMBa,M c noMo^bm cBeToBoM m э,eктpoннoм MMKpocKonMM, a TaK^e MMMyHoracTOXMMMHecKMX MeTofloB. npM ann,MKa;MM 2,5% pacTBopa nporecTepoHa Ha fleMM-e,MHM3MpoBaHHMM ynacToK HepBa oTMeneHo flocToBepHoe ycKopeHMe BoccTaHoB,eHMH mm6,mhoboh o6o,ohkm.
Influence of progesterone application on trigeminal nerve root-entry zone remyelination in experiment Chomolyak Yu.Yu.
The results of trigeminal nerve root-entry zone remyelination experimental study are presented. Original experimental model of trigeminal nerve root focal toxic demyelination was used. The assessment of trigeminal nerve root remyelination was done using electron microscopy and immunohystochemistry. It is identified, that local progesterone application at demyelination part of trigeminal nerve increased remyelination.
Умови дослщу Структура Сшввщношення площ1 осьового цилшдра i м1елшово! оболонки (M±m)
Контроль Стовбур 0,37±0,006
Коршець 0,38±0,007*
Дем1елш1защя Стовбур 0,62±0,01*
Коршець 1,39±0,07
Рем1елш1защя без прогестерону Стовбур 0,43±0,007*
Коршець 0,54±0,01*
Рем1елш1защя з розчином прогестерону Стовбур 0,37±0,009А
Коршець 0,37±0,01А
Комментарий
к статье Ю.Ю. Чомоляка «Ремкл'шзащя зони входу тр/'йчастого нерва тд впливом апл/'кацп прогестерону в експеримент/'»
На основании многолетних дискуссий по проблемам патогенеза эссенциальной невралгии тройничного нерва (ТН) создана доминирующая теория, согласно которой одним из основных факторов возникновения этого заболевания является демиелинизация участка, контактирующего с кровеносным сосудом. Поэтому, несмотря на высокую эффективность микроваскулярной декомпрессии ТН, возможности патогенетически обоснованного лечения этой патологи не исчерпаны, а исследования, посвященные ее изучению, актуальны. В исследованиях последних лет установлено, что регенерация периферических нервных волокон активизируется под влиянием прогестерона. Аналог прогестерона синтезируется в нервной системе и, будучи, нейростероидом, влияет на ремиелинизацию. Изучение местного применения прогестерона во время микроваскулярной декомпрессии ТН, без сомнения, является перспективным направлением научной работы.
Автором уделено значительное внимание экспериментальному моделированию процессов де- и ремиелинизации. Результаты местного использования прогестерона во время микрохирургического вмешательства в эксперименте дали возможность обосновать целесообразность проведения и направление будущих исследований. С использованием разработанной автором экспериментальной модели сегментарной демиелинизации корешка ТН гвинейской свинки изучено влияние различных факторов на ремиелинизацию. На основании морфологических (в т.ч. иммуногистохи-мических) методов исследования автору удалось установить влияние прогестерона на ремиелинизацию корешка ТН. Аппликация 2,5% раствора прогестерона на демиелинизированный участок активно влияет на восстановление миелиновой оболочки. Подтверждение стимулирующего влияния 2,5% раствора прогестерона на ремиелинизацию ТН в эксперименте даст возможность начать фундаментальное исследование по обоснованию использования этого гормона у больных с невралгией ТН во время выполнения хирургического вмешательства.
А.Т. Носов, профессор руководитель лаборатории электронной микроскопии Института нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова АМН Украины
До статтi Чомоляка Ю.Ю. «Ремieлiшзащя зони входу трШчастого нерва тд впливом апл^ацИ прогестерону в експериментi»
Рис. 1. Мшрофото. 29-та доба. Ремieлшiзацiя без додаткового впливу. Зона коршця ТН. Виражений набряк ендоневрм з розширенням ендоневральних просторiв, мieлшових оболонок, набряк аксотв. Фокальна демieлшi-защя (колосоподiбнi структури). Забарвлення Суданом III. Зб.х400.
Рис. 2. Мшрофото. 29-та доба. Ремieлiнiзацiя без додаткового впливу. Коршець ТН. 1мунонегативна реакцiя при iмунофенотипуваннi з антитшами Кi-67. Збережений набряк. 1мунофенотипування з антитшами Ю-67. Зб.х400.
Рис. 3. Електронограма. 29-та доба. Ремieлiнiзацiя без додаткового впливу. Стовбур мозку. Набряк тканини, розширення мiжаксональних просторiв. Тонк (вiдносно контролю) осмiофiльнi мieлiновi оболонки навколо окре-мих аксонiв. Поява дрiбних осмiофiльних мiтохондрiй за своерщно! просторово! орieнтацu структур аксоплазми. Зб.х8000.
Рис. 4. Мiкрофото. 29-та доба. Ремieлiнiзацiя з додатко-вим впливом. Коршець ТН. Значне збшьшення кшькост нейролемоцитав, розташування !х ланцюжками — утво-рення кластерiв (5—7 клiтин). В ядрах нейролемоцитiв чiтко контуруються численнi ядерця. Забарвлення суданом III. Зб.х800.
- Я
' „ " : *
9Ш
7 л
< ; < >
Р 7
м ш
¿Шш
9 V ,
И
V / , > у I '?/ г*
" ¿г * г >
ШШШ^ЯГ
Рис. 5. Мiкрофото. 29-та доба. Ремieлiнiзацiя з додатко-вим впливом. Коршець ТН. Збшьшення кшькоси нейро-лемоцитiв. Iмунопозитивнi пролiферуючi нейролемоцити. Ьмунофенотипування з Кi-67. Зб.х400.
Рис. 6. Електронограма. 29-та доба. Ремieлiнiзацiя з додатковим впливом. Коршець ТН. Впорядковашсть мieлiнових оболонок, поява дрiбних осмюфшьних мiтохондрiй, своeрiдна просторова орieнтацiя структур аксоплазми. Зб.х8000.
