Научная статья на тему 'Рекомбинантный нейротрофический фактор головного мозга (brain derived nerve factor; bdnf): панацея для мозга?'

Рекомбинантный нейротрофический фактор головного мозга (brain derived nerve factor; bdnf): панацея для мозга? Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
2233
265
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
НЕЙРОТРОФИНЫ / NEUROTROPHINS / РЕКОМБИНАНТНЫЙ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИЙ ФАКТОР ГОЛОВНОГО МОЗГА / BRAIN DERIVED NERVE FACTOR / BDNF / ГЭБ / BBB / СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ / STEM CELLS / НАНОЧАСТИЦЫ / NANOPARTICLES / DRUG TARGETING / ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКИЙ БАРЬЕР / ЛИПОСОМЫ / НАПРАВЛЕННЫЙ ТРАНСПОРТ

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Аляутдин Ренад Николаевич, Романов Борис Константинович, Лепахин Владимир Константинович, Халин Игорь Владимирович, Бунятян Наталья Дмитриевна

Рекомбинантный нейротрофический фактор головного мозга (brain derived nerve factor, BDNF) имеет важное значение для развития и функционирования центральной нервной системы (ЦНС). Многочисленными исследованиями показано, что при многих заболеваниях центральной нервной системы, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и другие нейродегенеративные заболевания, уровень BDNF снижен. Наряду с этим, повышение концентрации этого нейротрофина в головном мозге способствует восстановлению утерянных функций. BDNF является белком и плохо проникает через гемато-энцефалический барьер (ГЭБ). В обзоре рассмотрены принципиальные возможности повышения уровня BDNF в головном мозге. Представлены сведения о стимуляции продукции этого нейротрофина за счет рефлекторных воздействий посредством акупунктуры. Введение в головной мозг стволовых клеток позволяет компенсировать дефицит BDNF. Наконец, направленный транспорт с помощью наноразмерных носителей (наночастицы, липосомы) может обеспечить его доставку в мозг через ГЭБ.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Аляутдин Ренад Николаевич, Романов Борис Константинович, Лепахин Владимир Константинович, Халин Игорь Владимирович, Бунятян Наталья Дмитриевна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Recombinant brain derived nerve factor (BDNF): a panacea for the brain?

Neurotrophin BDNF is essential for the development and functioning of the CNS. Numerous studies have shown that many diseases of the central nervous system, including Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases are accompanied by decline in level of the brain BDNF. At the same time, increasing the concentration of this neurotrophin in the brain helps to restore lost neuronal functions. BDNF is a protein and normally does not penetrate through the blood-brain barrier. This review covers the basic opportunities to improve BDNF level in the brain, in particularly due to cell technologies and drug targeting. The article contains information on the stimulation of this neurotrophin production with reflex impacts such as acupuncture. Injection of stem cells into the brain able to compensate the deficit of BDNF. Finally, targeted transport with nanoscale carriers (nanoparticles, liposomes) can provide its delivery to the brain through the BBB.

Текст научной работы на тему «Рекомбинантный нейротрофический фактор головного мозга (brain derived nerve factor; bdnf): панацея для мозга?»

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.21+615.033

Рекомбинантный нейротрофический фактор головного мозга: панацея для мозга?

Р.Н. Аляутдин1, Б.К. Романов1, В.К. Лепахин1, И.В. Халин2, Н.Д. Бунятян1, В.А. Меркулов1, А.Н. Миронов1

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва 2Медицинский факультет Национального Университета обороны UPNM (Малайзия)

Recombinant brain derived nerve factor:

a panacea for the brain?

R.N. Alyautdin1, B.K. Romanov1, V.K. Lepakhin1, I.V. Khalin2N.D. Bunyatyan1, V.A. Merkulov1, A.N. Mironov1

1Federal State Budgetary Institution «Scientific Center on Expertise of Medical Application Products»

of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia 2Medical Faculty of the National Defense University of Malaysia (UPNM)

Рекомбинантный нейротрофический фактор головного мозга (brain derived nerve factor, BDNF) имеет важное значение для развития и функционирования центральной нервной системы (ЦНС). Многочисленными исследованиями показано, что при многих заболеваниях центральной нервной системы, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и другие нейродегенеративные заболевания, уровень BDNF снижен. Наряду с этим, повышение концентрации этого нейротрофина в головном мозге способствует восстановлению утерянных функций. BDNF является белком и плохо проникает через гемато-энцефалический барьер (ГЭБ). В обзоре рассмотрены принципиальные возможности повышения уровня BDNF в головном мозге. Представлены сведения о стимуляции продукции этого нейротрофина за счет рефлекторных воздействий посредством акупунктуры. Введение в головной мозг стволовых клеток позволяет компенсировать дефицит BDNF. Наконец, направленный транспорт с помощью наноразмерных носителей (наночастицы, липосомы) может обеспечить его доставку в мозг через ГЭБ. Ключевые слова: нейротрофины; рекомбинантный нейротрофический фактор головного мозга; гематоэнцефалический барьер; ГЭБ; стволовые клетки; наночастицы; липосомы; направленный транспорт.

Библиографическое описание: Аляутдин РН, Романов БК, Лепахин ВК, Халин ИВ, Бунятян НД, Меркулов ВА, Миронов АН. Рекомбинантный нейротрофический фактор головного мозга: панацея для мозга? Биопрепараты 2014; 2: 22-30.

Neurotrophin BDNF is essential for the development and functioning of the CNS. Numerous studies have shown that many diseases of the central nervous system, including Parkinson's disease, Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases are accompanied by decline in level of the brain BDNF. At the same time, increasing the concentration of this neurotrophin in the brain helps to restore lost neuronal functions. BDNF is a protein and normally does not penetrate through the blood-brain barrier. This review covers the basic opportunities to improve BDNF level in the brain, in particularly due to cell technologies and drug targeting. The article contains information on the stimulation of this neurotrophin production with reflex impacts such as acupuncture. Injection of stem cells into the brain able to compensate the deficit of BDNF. Finally, targeted transport with nanoscale carriers (nanoparticles, liposomes) can provide its delivery to the brain through the BBB.

Key words: neurotrophins; brain derived nerve factor; BDNF; BBB; stem cells; nanoparticles; drug targeting. Bibliographic description: Alyautdin RN, Romanov BK, Lepakhin VK, Khalin IV, Bunyatyan ND, Merkulov VA, Mironov AN. Recombinant brain derived nerve factor: a panacea for the brain? Biopreparation (Biopharmaceuticals) 2014; 2:22-30.

Последнее десятилетие ознаменовалось впечатляющими достижениями в области патофизиологии многих заболеваний ЦНС, включая нейродегенеративные расстройства. Во многом эти успехи обусловлены пониманием роли нейротрофических факторов в

функционировании нервной системы. Несмотря на то, что первый нейротрофин был выделен Р. Леви-Мон-тальчини в 1952 году (Rita Levi-Montalcini, 1909-2012) истинная роль этих цитокинов стала понятна сравнительно недавно. Нейротрофины составляют группу

( Обзор

Review

I

регуляторных белков, играющих важную роль в пролиферации, дифференциации, развитии, выживаемости и пластичности нейронов ЦНС и периферической нервной системы [1]. К числу нейротрофинов относят синтезируемый в головном мозге нейротрофический фактор головного мозга (brain derived nerve factor; BDNF), фактор роста нервов (nerve growth factor; NGF), ней-ротрофин-3 (neurotrophin-3; NT-3) и нейротрофин-4/5 (neurotrophin-4/5; NT-4/5) [2]

Влияние BDNF на ЦНС. BDNF является важнейшим белком, определяющим не только пролиферацию и выживаемость холинергических, серотонинергических и дофаминергических нейронов, но также представляет собой ключевой компонент гипоталамического пути регуляции веса тела и энергетического гомеостаза [3]. Дефицит BDNF снижает пластичность нейронов, нарушает память и обучаемость, когнитивные способности [4,5,6]. Этот цитокин представляет гомодимер с молекулярной массой 27 кДа. Каждый мономер состоит из 120 аминокислот. Как и все нейротрофины, BDNF проявляет биологическую активность только в состоянии димеризации [7].

Действие нейротрофинов, к которым относятся фактор роста нервов, BDNF, NT-3 и NT-4/5, определяется их связыванием с мембранными специфическими рецепторами. Выделяют два типа рецепторов к нейротро-финам, р75м_т и Trk. BDNF пре- и постсинаптически связывается с обоими типами рецепторов. К общему для всех нейротрофинов рецептору р75м_т относящемуся к семейству рецепторов ФНО, BDNF имеет незначительное сродство [8]. Высокий аффинитет нейротрофины проявляют к Trk рецепторам. Семейство Trk рецепторов относится к тирозинкиназным и подразделяется на 3 подтипа: Trk-А, активируемый фактором роста нервов, Trk-В, с которым связываются BDNF и NT-4/5, и наконец, Trk-С, агонистом которого является NT-3 [9, 10].

Связывание BDNF с Trk-B приводит к усилению трофического влияния, с которым связывают основные эффекты этого нейротрофина. Влияние, опосредуемое через р75м"т рецепторы, более сложное и неоднозначное. Так, эти рецепторы способны как потенцировать, так и угнетать нейротрофическое действие Trk-В рецепторов или независимо от них запускать апопто-тический сигнальный каскад [11]. В норме в большинстве областей взрослого мозга, опосредуемая через р75м_т рецепторы, активность угнетена за счет их down регуляции. Однако в условиях патологии, например, при повреждении головного мозга, активность р75м_т рецепторов быстро экспрессируется, что может вызывать гибель нейронов [12].

Trk-В рецепторы состоят из вне- и внутриклеточного доменов. Внеклеточный домен представлен пятью субъединицами из которых первая и третья являются цисте-ин-богатыми фрагментами, вторая - лейцин-богатым, а последние две, четвертая и пятая - иммуноглобулин-подобным фрагментом [8]. Стимуляция Trk-B рецептора молекулой BDNF запускает три каскада реакций, опосредуемых за счет активации внутриклеточного домена, тороидально соединенного с внеклеточной частью рецептора. Каскады этих реакций типичны для большинства тирозинкиназных рецепторов и инициируются фосфоли-пазой Су ^Су), фосфатидилинозитол-3-киназой (PI-3K), митоген-активируемой протеинкиназой (MAPK) (рис. 1).

Рис. 1. Опосредуемое через TrkB рецептор влияние BDNF на метаболизм клетки.

Основные клеточные эффекты BDNF опосредуются через систему фосфолипазы Су,

митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК) и фосфоинозитол-3-киназы (PI-3K).

DAG - диацилглицерол, IP3 - инозитол-3-фосфат, CREB -транскрипционный фактор.

BDNF и патология ЦНС

Болезнь Альцгеймера. Изменение содержания BDNF в мозге способно привести к развитию патологического процесса, например, при болезни Альцгеймера (БА), Паркинсона (БП) или Хантингтона (БХ) [15]. Показано, что ген, кодирующий синтез BDNF, является одним из определяющих факторов поддержания длительной пластичности в гиппокампе. Именно эта структура является ключевой в развитии начальных симптомов БА. В эксперименте BDNF оказывал протективное действие на холинергическую систему мозга при моделировании БА [13]. Посмертное исследование головного мозга больных БА показало, что содержание BDNF было снижено в гиппокампе, височной и лобной коре [14,15,16]. Одной из причин снижения содержания BDNF в мозге при БА является угнетение продукции этого нейротрофина дендритными клетками под воздействием бета-амилоида, что приводит к дефициту трофических влияний [17]. Снижение уровня мРНК при БА отмечено в гиппокампе, париетальной коре и базальных ганглиях [18]. Существует возможность снижения содержания BDNF за счет его депонирования. С помощью иммунохими-ческих реакций в сенильных бляшках в коре головного мозга обнаруживаются BDNF-подобные соединения [19]. Снижение уровня мРНК, кодирующей TrkB рецепторы, позволяет предположить участие этого механизма в дегенеративных процессах в головном мозге. Однако при этом сложно сказать, какой процесс является первичным, снижение выработки BDNF и последующее снижение синтеза рецепторов или наоборот, первичное снижение синтеза рецепторов приводит к дальнейшему нарушению синтеза BDNF [13].

Болезнь Паркинсона. Известно, что болезнь Паркинсона обусловлена дегенерацией дофаминергических нейронов в черной субстанции головного мозга. При этом в pars compacta этой структуры отмечено выраженное снижение содержания BDNF. Учитывая, что именно в этой части черного вещества происходит

наиболее драматичная потеря нейронов, можно предположить, что этим фактором объясняется снижение содержания BDNF. Однако анализ выживших нейронов substantia nigra показал, что содержание BDNF в них также снижено [20]. Howells и совт. (1999) обнаружили, что в контроле 65% меланинсодержащих нейронов продуцируют BDNF, в то время как при БП BDNF обнаружен лишь в 9,6% пигментсодержащих нейронов. Более того, в тельцах Lewy был найден белок, иммуно-реактивный к BDNF. Это указывает на то, что, несмотря на присутствие в клетке BDNF, патологические изменения, типичные для БП, могут развиваться [20].

Болезнь Хантингтона. БХ относится к нейродегене-ративным заболеваниям, для которых также характерно изменение содержания BDNF. Удлинение в геноме триплетного повтора белка хантингтина (ЦАГ) вызывает изменение конформации последнего. Это приводит к потере нейронов в полосатом теле с последующим нарушением двигательной функции. Снижение уровня BDNF в нейронах наблюдается в клеточных и in vivo генетических моделях БХ. Низкий уровень этого нейро-трофина и рецепторов к нему обнаружены при посмертном исследовании полосатого тела головного мозга пациентов с БХ [21]. В плазме пациентов с БХ уровень BDNF также был снижен, причем степень снижения положительно коррелировала с длиной повторяющихся ЦАГ триплетов и выраженностью заболевания [13].

Психические болезни. Изменения концентрации BDNF имеют высокую степень корреляции с развитием психических заболеваний. При моделировании депрессии посредством иммобилизационного стресса, теста принудительно погружения, условном пищевом шоке, выученной беспомощности у животных в гиппокам-пе регистрировали снижение уровня мРНК BDNF [22]. Down-регуляция этого нейротрофина предотвращалась антидепрессантами. Содержание BDNF в плазме крови, очевидно отражающее его содержание в мозге, снижено у пациентов с депрессией. При этом лечение антидепрессантами восстанавливало уровень BDNF до исходного. Факт down-регуляции BDNF в мозге при депрессии и возможность восстановления с помощью антидепрессантов позволяет предположить его участие в патогенезе депрессии. Однако пока не удалось выявить прямую связи между снижением активности сигнального пути BDNF и развитием депрессии [23]. Данные о взаимосвязи уровня BDNF в плазме крови и клиническими проявлениями шизофрении неоднородны, что не позволяет оценить значение нейротрофина при этой патологии.

Инсульт головного мозга. Инсульт является одной из главных причин развития нетрудоспособности, что придает этому заболеванию выраженный социально-экономический аспект. Несмотря на желание получить максимальное восстановление после инсульта, ответ на проводимую терапию крайне вариабелен. Анализ показывает, что причиной этого разброса результатов лечения являются не столько различия в лечении, сколько индивидуальные механизмы молекулярного и генетического восстановления поврежденных областей мозга. Полиморфизм гена, кодирующего BDNF Val66Met, является одним из наиболее тщательно изученных генетических полиморфизмов, связанных с восстановлением после инсульта. Указанный выше

э

полиморфизм объясняет снижение секреции BDNF и уменьшение нейрональной пластичности, что приводит к истощению функционального резерва восстановления при инсульте [24]. Клинические наблюдения показывают, что у пациентов с данным полиморфизмом восстановление после инсульта протекает медленнее и в меньшем объеме. Актуальность этой проблемы велика, так как 30-50% всего населения имеют, по крайней мере, один Met аллель в гене BDNF [24, 25].

BDNF и ГЭБ. Очевидно, что BDNF играет важную роль в физиологии и патологии ЦНС. Естественно, это приводит к мысли о создании на основе этого нейротрофина инновационного препарата для лечения заболеваний головного мозга. Однако надежды на быстрое появление лекарственных препаратов нового поколения, в том числе и геномных, пока не оправдываются. Более того, скорость появления новых препаратов после 2000 года снижается. Время, необходимое для создания нового нейротропного препарата, составляет 12-16 лет, а стоимость 0,8-1,7 миллиарда долларов. Кроме обычных требований к новому лекарственному препарату - оптимальной активности, избирательности, биодоступности, препарат, действующий на ЦНС, должен проникать через гемато-энцефалический барьер [26]. Наличие гемато-энцефалического барьера впервые было продемонстрировано Паулем Эрлихом в 1885 г. (Paul Ehrlich, 1854-1915). В экспериментах на животных он показал, что краситель трипановый синий после введения в кровь выходил из карилляров и прокрашивал периферические ткани, но не мозг. П. Эрлих предположил, что мозг имеет низкое сродство к красителю. В 1913 г. ученик П. Эрилиха Эдвин Голдманн (Edwin Goldmann, 1862-1913) показал, что при введении красителя не в вену, а в ликвор, мозг окрашивается, но остальные ткани - нет. Э. Голдманном был сделан вывод о существовании барьера между ликвором и кровью [27].

ГЭБ формируется эндотелиальными клетками, образующими капилляры спинного и головного мозга, а также различными периваскулярными клетками -гладкомышечными, перицитами, микроглиальными и астроцитами [28]. Важной особенностью эндотелия сосудов головного мозга является асимметричное распределение связанных с мембраной транспортных систем, что указывает на функциональные различия апикальной и базолатеральной мембран эндотелиаль-ных клеток. Наличие ГЭБ характерно для всех животных с развитой нервной системой, и в процессе эволюции основные барьерные функции перешли от глиальных к эндотелиальным клеткам [29].

Основным фактором, определяющим развитие ГЭБ, явилась необходимость защиты нейронов усложняющейся структуры головного и спинного мозга и их предохранение от возникающих в плазме флуктуаций содержания ее компонентов, вызванных изменением двигательной активности, частотой дыхания, приемом пищи и т.д.

Функциональные особенности эндотелиальных клеток сосудов головного мозга определяются морфологическим строением, выделяющим их из общего ряда этого типа клеток. К числу наиболее важных особенностей следует отнести отсутствие фенестрации цитоплазмы, характерной для периферических эндоте-

( Обзор

Review

D

лиальных клеток, меньшее количество пиноцитозных пузырьков, значительное количество митохондрий, что предполагает большую метаболическую активность и, наконец, формирование «плотных контактов» (ПК) между мембранами соседних клеток. ПК состоят из трансмембранных белков, направленных в парацеллюлярное пространство и фактически заполняющих это пространство, предотвращая, таким образом, парацеллюлярный транспорт. ПК являются серьезным препятствием для макромолекул и полярных гидрофильных соединений [30]. Условно парацеллюлярную область можно разделить на 2 зоны: собственно плотные контакты (tight junction) и слипчивые контакты (adherence junction). Комплекс плотных контактов представлен, в основном, окклудином, клаудином 3 и 5. Эти белки блокируют пара-целлюлярный транспорт и обеспечивают как барьерную функцию, так и высокое электрическое сопротивление мембраны. Указанные белки экспрессированы только на поверхностях эндотелиальных клеток, обращенных в межклеточное пространство. При этом основная роль в формировании барьерной функции принадлежит, по-видимому, клаудину, так как у нокаутных по окклудину мышей барьерная функция сохраняется, в то время как мыши, нокаутные по клаудину, не жизнеспособны. Клау-дины образуют петли, направленные в просвет межклеточного пространства и эти петли, связываясь, прочно перекрывают межклеточное пространство (рис. 2). Количество экспрессированных молекул клаудина определяет надежность плотного соединения[30].

Как повысить содержание BDNF в головном мозге

Низкая проницаемость через ГЭБ является не единственным препятствием при создании нейротропных препаратов на основе белковых субстанций. Дополнительными факторами являются низкая биодоступность и Т1/2 за счет поотеолиза или гидоолиза. В этой связи

попытки повышения содержания BDNF за счет стимуляции синтеза являются вполне рациональными. Так, в опытах in vitro Meng C. и соавт. (2013) анализировали влияние лазерного излучения на нейроны гиппо-кампа, полученные из мозга трансгенных мышей APP/ PS1 (используемых в качестве модели БА). Нейроны этих мышей активно синтезируют бета-амилоид, и у животных нарушения памяти и обучения наблюдаются раньше, чем у особей дикого типа. Было установлено, что облученные лазером клетки имели большую выживаемость, сохраняя при этом дендриты интактными. Иммунохимический анализ позволил сделать вывод, что лазерное облучение клеток вызывает увеличение содержания мРНК BDNF и как следствие повышение концентрации нейротрофина. Аналогичные результаты были получены с нейронами дикого типа при добавлении в среду бета-амилоида [31]. Электроакупунктура также способна увеличить содержание BDNF в головном мозге. В опытах на мышах с фокальной ишемией головного мозга было показано, что электрическая стимуляция зон, аналогичных акупунктурным точкам Dazhui и Baihui, вызывала ускорение восстановления моторных функций этих животных. Морфологические исследования показали активацию репаративных процессов в головном мозге. Иммунохимический анализ и вестерн-блот выявили увеличение концентрации BDNF и сосудистого эндотелиального фактора в головном мозге мышей [32].

Перспективы создания препаратов передовой терапии. Для успешной таргетной доставки пептидных и белковых препаратов необходимы транспортные системы, которые позволяют избежать быстрой элиминации из кровообращения, обусловленной ферментативной деградацией и захватом ретикуло-эндоте-лиальной системой. Опыт подкожного введения BDNF пациентам с боковым амиотрофичесим склерозом показал неэффективность этого пути введения. Пои-

СХЕМАТИЧНОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА

просвет сосуда

«ПЛОТНЫЕ КОНТАКТЫ» КАПИЛЛЯРОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА

актин

эндотелиальная клетка

астроцит

м

ия

мозг

Рис.2. Строение «плотныхконтактов» гемато-энцефалического барьера: 1 - окклудин, 2 - клаудин, 3 - JAM (junctional adhesion molecule), 4 - «слипчивые» контакты.

G

менение рекомбинантного нейротрофина в течение 9 месяцев в дозе 25мкг/кг не выявило терапевтического действия по сравнению с плацебо. При увеличении дозы нейротрофина до 100 мкг/кг авторы отметили тенденцию к развитию положительного эффекта [33, 34],что подтверждает постулат о необходимости системы направленной доставки BDNF в мозг. Опыт введения родственного BDNF протеина рекомбинантного GDNF в желудочки мозга пациентам с паркинсонизмом также не выявил впечатляющего эффекта. Исследователи не отметили клинического улучшения или тенденции к репарации нейронов. Этот способ введения был небезопасен для больных и вызывал побочные эффекты: парестезии, галлюцинации, появление антител к GDNF [35, 36]. Возможно, что введение GDNF в желудочки мозга не обеспечивает его проникновения вглубь тканей мозга. Однако в эксперименте при аналогичном пути введения крысам BDNF с помощью помпы было отмечено нейропротективное действие, уменьшение зоны некроза и значительное снижение количества нейронов с апоптозом [34]. С целью повышения биодоступности в пределах ЦНС рекомбинантный BDNF связывали с полиэтиленгликолем (ПЭГилировали). При этом отмечено драматическое увеличение проникновения препарат в ткани мозга [37].

Стимуляция синтеза BDNF с помощью генной и клеточной терапии. Способность аденовируса доставлять ДНК, кодирующую BDNF, в изолированные ганглио-нарные клетки послужила основой для создания эндогенной системы синтеза BDNF. В экспериментах in vitro инфицирование клеток таким аденовирусом приводило к стимуляции синтеза нейротрофина, а при введении этой системы в мозг в эксперименте in vivo наблюдалось нейропротективное действие, ускорение репарации при травме спинного мозга и при БХ [32, 38]. Вирусные системы доставки при системном введении быстро захватываются клетками РЭС и способны вызвать иммунные реакции. Альтернативой вирусной доставке является трансплантация в мозг клеток, синтезирующих нейро-трофины. Стволовые клетки костного мозга при трансплантации в головной мозг способны синтезировать одновременно фактор роста нервов, BDNF и нейро-трофин-3, стимулируя рост поврежденных аксонов [39, 40]. Таким образом, трансфицирование аденовирусом с ДНК BDNF и трансплантация стволовых клеток способны обеспечит синтез BDNF в головном мозге в количествах, достаточных для развития эффекта. Однако при сопоставлении этих систем эффективность аденовирусной доставки оказалась выше [41].

Коллоидные наноразмерные полимерные системы доставки. Необходимость введения аденовирусных структур и стволовых клеток в головной или спинной мозг являются, безусловно, ограничением для их использования. Попыткой преодолеть этот недостаток явилось создание наночастиц и липосом для направленного транспорта BDNF в мозг. Для того чтобы «скрыть» наноразмерные носители от РЭС используется так называемая «stealth» технология, заключающаяся в покрытии наночастиц сурфактантом. Такие наночастицы и липосомы не захватываются купферов-скими клетками печени. Из плазмы крови наночастицы, естественно, не могут проникнуть через ГЭБ напрямую, поэтому с целью преодоления этого препятствия

Рис. 3. Направленный транспорт лекарственных веществ с помощью полимерных наночастиц, принцип «троянского» коня: 1 - полимерная наночастица, 2 - транспортируемое лекарственное вещество, 3 - сурфактант, препятствующий захвату наночастиц клетками РЭС и сорбирующий апоЕ. А и Б соответственно наночастицы с апоЕ, сорбированным на поверхности или «пришитым» к поверхности наночастицы. Мехнизм проникновения наночастиц через ГЭБ см. в тексте.

используется технология «троянского коня» [42]. Для этого на поверхность наночастиц помещают молекулы аполипопротеинов или трансферрина, которые взаимодействуют с соответствующими рецепторами эндо-телиальных клеток капилляров мозга. При этом клетка, по ошибке принимая наночастицу соответственно за липопротеин низкой плотности или трансферрин, используя механизм рецептор-опосредованного эндоци-тоза пропускает наночастицу с лекарственным веществом в мозг [43, 44]. Таким образом, обеспечивается доставка в мозг пептидных и белковых препаратов, включая фактор роста нервов (рис. 3). Наноразмерные носители способны обеспечить транспорт фактора роста нервов в мозг в дозе, достаточной для проявления нейропротективного действия. Эффективность этого вида направленного транспорта была показана в экспериментах, моделирующих БА, БП и инсульт. Анализ концентрации нейротрофина в мозге с помощью ELISA показал значительное увеличение его содержания при внутривенном введении в составе наночастиц [45].

Таким образом, BDNF оказывает уникальное действие на ЦНС, стимулируя в нейронах репаративные процессы, повышая синаптическую пластичность, устойчивость клеток ЦНС к повреждающим факторам. Решение проблемы направленной доставки этого нейротрофина в мозг позволит создать перспективное лекарственное средство для лечения целого ряда заболеваний ЦНС.

Литература:

1. Autry AE, Monteggia, LM. Brain-derived neurotrophic factor and neuropsychiatrie disorders. Pharmacol. Rev. 2012; 64: 238-58.

2. Bekinschtein P, Cammarota M, Katche C., Slipczuk L, Rossato Jl, Goldin A. et al. BDNF is essential to promote persistence of long-term memory storage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105: 2711-16

3. Wisse BE, Schwarz V.W. The skinny on neurotrophins. Nat Neurosci. 2003; 6: 655-8

Э

(Öbsöf

Review

4. Tyler WJ , Alonso M, Bramham M., Pozzo-Miller L. From acquisition to consolidation: on the role of Brain-Derived Neurotrophic Factor signaling in hippocampal-dependent learning. Learn Mem. 2002; 9:224-8

5. Chaldakov GN, Tonchev AB., Manni L., Hristova MG, Nikolova V, Fiore M, et al. Comment on. Diabetologia. 2007;50:1781-82

6. Henderson CE, Camu W., Mettling C., GouinA, Poulsen K, Karihaloo M, et al. Neurotrphins promote motor neuron survival and are present in embryonic limb fuid. Nature. 1993; 363:266-269

7. Robinson RC, Radziejewski C, Spraggon, G. Greenwald J, Kostura MR, Burtnick LD et al. The structures of the neurotrophin-4 homodimer and thebrain-derived neurotrophic factor/neurotrophin-4 heterodimer reveal a common Trk-binding site. Protein Sci. 1999; 8: 2589-2597.

8. Pattarawarapan M, Burgess K. Molecular basis of neurotrophin-receptor interactions. J. Med. Chem. 2003;46:5277-91.

9. Nagahara AH, Tuszynski, MH. Potential therapeutic uses

of BDNF in neurological and psychiatric disorders. Nat. Rev. Drug Discov. 2011;10:209-19.

10. Geral C, Angelova A, Lesieur S. From molecular to nanotechnologystrategiesfordeliveryofneurotrophins: emphasis on Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF). Pharmaceutics. 2013;5:127-67

11. Baker SJ, Reddy EP. Transducers of life and death: TNF receptor superfamily and associated proteins. Oncogene. 1996;12: 1-9.

12. Kalb R. The protean actions of neurotrophins and their receptors on the life and death of neurons. Trends Neurosci. 2005;28:5-11.

13. Hu Y, Russek S. BDNF and the diseased nervous system: a delicate balance between adaptive and pathological processes of gene regulation. J. Neurochem. 2008;105: 1-17

14. Phillips HS, Hains JM, Armanini M, Laramee GR, Johnson SA, Winslow JW. BDNF mRNA is decreased in the hippocampus of individuals with Alzheimer's disease. Neuron. 1991; 7:695-702.

15. Siegel GJ, Chauhan NB. Neurotrophic factors in Alzheimer's and Parkinson's disease brain. Brain. Res. Brain. Res. Rev. 2000; 33:199-227

16. Salani F, Bizzoni F, Orfei MD, Langella R, Angelucci F, Spalletta G, et al.The stimulation of dendritic cells by amyloid beta 1-42 reduces BDNF production in Alzheimer's disease patients. Brain, Behavior, and Immunity. 2013;32:29-32

17. Robyn K, Honea RA, Cruchaga C. et al. Characterizing the role of Brain Derived Neurotrophic Factor genetic variation in Alzheimer's Disease. Neurodegeneration. PLOS ONE, 2013, 8, e76001

18. Fahnestock M, Garzon D, Holsinger R. M, Michalski B. Neurotrophic factors and Alzheimer's disease: are we focusing on the wrong molecule? J. Neural. Transm. Suppl. 2002;62:241-52.

19. Ferrer I, Marin C, Rey M J et al.. BDNF and full-length and truncated TrkB expression in Alzheimer disease.

Implications in therapeutic strategies. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1999;58:729-39.

20. Howells D W, Porritt M J, Wong J Y, Batchelor PE, Kalnins R, Hughes AJ, Donnan GA. Reduced BDNF mRNA expression in the Parkinson's disease substantia nigra. Exp. Neurol.2000; 166: 127-35.

21. Ciammola A, Sassone J, Cannella M., Calza S, Poletti B, Frati L et al. Low brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels in serum of Huntington's disease patients. Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet. 2007;144: 574-7

22. Tsankova NM, Berton O, Renthal W., Kumar A, Neve RL, Nestler EJ. Sustained hippocampal chromatin regulation in a mouse model of depression and antidepressant action. Nat.Neurosci. 2006;9:519-25.

23. Karege F, Vaudan G, Schwald M. Perroud N, La Harpe R. Neurotrophin levels in postmortem brains of suicide victims and the effects of antemortem diagnosis and psychotropic drugs. Brain Res. Mol. Brain Res. 2005; 136:29-37.

24. Egan MF, Kojima M, Callicott JH, Goldberg TE, Kolachana BS, Bertolino A. et al. The BDNF val66met polymorphism affects activity-dependent secretion of BDNF and human memory and hippocampal function. Cell. 2003;112:257-269.

25. Shimizu E, Hashimoto K, Iyo M. Ethnic difference of the BDNF 196G/A (val66met) polymorphism frequencies: the possibility to explain ethnic mental traits. Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiat.r Genet. 2004;126B:122-123.

26. Trahan MA, Kahng S, Fisher AB, Hausman NL. Behavior-analytic research on dementia in older adults. J. Appl .Behav. Anal. 2011; 44: 687-91.

27. Alyautdin R, Khalin I, Nafeeza M. et al. Nanoscale Drug Delivery Systems and the Blood_Brain Barrier. Int. J. Nanomed. 2014; 9: 795-811

28. Begley DJ. Delivery of therapeutic agents to the central nervous system: the problems and the possibilities. Pharmacol. Ther. 2004;104:29-45.

29. Abbott N J. Comparative physiology of the blood-brain barrier. In: Bradbury, M. W. B. (ed.), Physiology and Pharmacology of the Blood-Brain Barrier, Heidelberg: Springer-Verlag; 1992

30. Correale J., Villa A. Cellular Elements of the Blood-Brain Barrier. Neurochem Res. 2009;34. :2067-77.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

31. Meng C, He Z, Xing D. Low-level laser therapy rescues dendrite atrophy via upregulating BDNF expression: implications for Alzheimer's disease. J. of Neurosci. 2013;14, P:13505-17

32. Knüsel B, Beck KD, Winslow JW, Rosenthal A, Burton LE, Widmer HR et al.. Brain-derived neurotrophic factor administration protects basal forebrain cholinergic but not nigral dopaminergic neurons from degenerative changes after axotomy in the adult rat brain. J. Neurosci. 1992;19:245-7

33. Kim Y, Kim H, Ahn S, Choi YH, Shin HK, Choi BT. Elec-troacupuncture promotes post-stroke functional recovery via enhancing endogenous neurogenesis in mouse focal cerebral ischemia. Plos one. 2014. V. 9, e90000

G

34. Takeshim, Y, Nakamura M, Miyake H. Neuroprotection with intraventricular brain-derived neurotrophic factor in rat venous occlusion model./ Neurosurgery. 2011;68: 1334-41.

35. Kordower JH, Palfi S, Chen M.. Clinico-pathological findings following intraventricular GDNF treatment in patient with Parkinson's disease. Ann. Neurol. 1999;46:419-24.

36. Nutt JG. Burchiel KJ, Comella, CL., Jankovic J, Lang AE, Laws ER et al. Randomized, double-blind trial of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in PD. Neurology 2003;60: 69-73.

37. AnkeniDP, McTique DM, GuanZ, Yan Q. Pegilatedbrain-derived nerve grouth factor shows improved distribution into spinal cord. Exp. Neurol. 2001;170:75-100

38. Ramaswamy S, Kordower JH. Gene therapy for Huntington's disease. Neurobiol. Dis. 2012;48:243-54

39. Kojima H, Inuzuka S, Furukawa S, Construction and characterization of adenoviral vector expressing active BDNF.Bioch.Biophys. Res.Com. 1995;212: 712-17

40. Lu P, Jones LL, Tuszynski MH. BDNF-expressing marrow stromal cells support extensive axonal growth at sites of spinal cord injury./Exp. Neurol. 2005;191:344-7

41. Jeong CH, Kim SM, Lim K, Ryu CH. Mesenchymal stem cells expressing Brain-Derived Neurotrophic Factor enhance endogenous neurogenesis in an ischemic stroke model. BioMed Res. Int. 2014. Article ID 129145

42. Boado RJ, Pardridge WM. The Trojan horse liposome technology for nonviral gene transfer across the blood-brain barrier. J. Drug Deliv. 2011;296:1-12

43. Аляутдин РН, Кройтер Й, Харкевич ДА. Доставка лекарственных препаратов в мозг с помощью на-ночастиц. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2003; 66: 65-8.

44. Петров ВЕ, Иванов АА, Кройтер Й, Аляутдин РН, Харкевич ДА. Транспорт гексапептида даларгина через гемато-энцефалический барьер с помощью полимерных наночастиц. Экспериментальная и клиническая фармакология. 1996; 59:57-61

45. Kurakhmaeva К, Voronina ТА, Kapica I, Kreuter J, Nerobkova LN, Seredenin SB et al. Antiparkinsonian effect of nerve growth factor adsorbed on polybut-ylcyanoacrylate nanoparticles coated with polysor-bate-80. Bul. of Exp. Biol. Med. 2009;145 (2):259-62

References:

1. Autry AE, Monteggia, LM. Brain-derived neurotrophic factor and neuropsychiatric disorders. Pharmacol. Rev. 2012; 64:238-58.

2. Bekinschtein P, Cammarota M, Katche C., Slipczuk L, Rossato JI, Goldin A. et al. BDNF is essential to promote persistence of long-term memory storage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105:2711-16

3. Wisse BE, Schwarz V.W. The skinny on neurotrophins. Nat Neurosci. 2003; 6: 655-8

4. Tyler WJ , Alonso M, Bramham M., Pozzo-Miller L. From acquisition to consolidation: on the role of Brain-Derived Neurotrophic Factor signaling in hippocampal-dependent learning. Learn Mem. 2002; 9:224-8

5. Chaldakov GN, Tonchev AB., Manni L., Hristova MG, Nikolova V, Fiore M, et al. Comment on. Diabetologia. 2007;50:1781-82

6. Henderson CE, Camu W., Mettling C., GouinA, Poulsen K, Karihaloo M, et al. Neurotrphins promote motor neuron survival and are present in embryonic limb fuid. Nature. 1993; 363:266-269

7. Robinson RC, Radziejewski C, Spraggon, G. Greenwald J, Kostura MR, Burtnick LD et al. The structures of the neurotrophin-4 homodimer and thebrain-derived neurotrophic factor/neurotrophin-4 heterodimer reveal a common Trk-binding site. Protein Sci. 1999; 8: 2589-2597.

8. Pattarawarapan M, Burgess K. Molecular basis of neurotrophin-receptor interactions. J. Med. Chem. 2003;46:5277-91.

9. Nagahara AH, Tuszynski, MH. Potential therapeutic uses of BDNF in neurological and psychiatric disorders. Nat. Rev. Drug Discov. 2011;10:209-19.

10. Geral C, Angelova A, Lesieur S. From molecular to nanotechnologystrategiesfordeliveryofneurotrophins: emphasis on Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF). Pharmaceutics. 2013;5:127-67

11. Baker SJ, Reddy EP. Transducers of life and death: TNF receptor superfamily and associated proteins. Oncogene. 1996;12: 1-9.

12. Kalb R. The protean actions of neurotrophins and their receptors on the life and death of neurons. Trends Neurosci. 2005;28:5-11.

13. Hu Y, Russek S. BDNF and the diseased nervous system: a delicate balance between adaptive and pathological processes of gene regulation. J. Neurochem. 2008;105: 1-17

14. Phillips HS, Hains JM, Armanini M, Laramee GR, Johnson SA, Winslow JW. BDNF mRNA is decreased in the hippocampus of individuals with Alzheimer's disease. Neuron. 1991; 7: 695-702.

15. Siegel GJ, Chauhan NB. Neurotrophic factors in Alzheimer's and Parkinson's disease brain. Brain. Res. Brain. Res. Rev. 2000; 33:199-227

16. Salani F, Bizzoni F, Orfei MD, Langella R, Angelucci F, Spalletta G, et al.The stimulation of dendritic cells by amyloid beta 1-42 reduces BDNF production in Alzheimer's disease patients. Brain, Behavior, and Immunity. 2013;32:29-32

17. Robyn K, Honea RA, Cruchaga C. et al. Characterizing the role of Brain Derived Neurotrophic Factor genetic variation in Alzheimer's Disease. Neurodegeneration. PLOS ONE, 2013, 8, e76001

18. Fahnestock M, Garzon D, Holsinger R. M, Michalski B. Neurotrophic factors and Alzheimer's disease: are we focusing on the wrong molecule? J. Neural. Transm. Suppl. 2002;62:241-52.

19. Ferrer I, Marin C, Rey M J et al.. BDNF and full-length and truncated TrkB expression in Alzheimer disease. Implications in therapeutic strategies. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1999;58:729-39.

20. Howells D W, Porritt M J, Wong J Y, Batchelor PE, Kalnins R, Hughes AJ, Donnan GA. Reduced BDNF mRNA

(Öbsöf

Review

expression in the Parkinson's disease substantia nigra. Exp. Neurol.2000; 166: 127-35.

21. Ciammola A, Sassone J, Cannella M., Calza S, Poletti B, Frati L et al. Low brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels in serum of Huntington's disease patients. Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet. 2007;144:574-7.

22. Tsankova NM, Berton O, Renthal W., Kumar A, Neve RL, Nestler EJ. Sustained hippocampal chromatin regulation in a mouse model of depression and antidepressant action. Nat.Neurosci. 2006;9:519-25.

23. Karege F, Vaudan G, Schwald M. Perroud N, La Harpe R. Neurotrophin levels in postmortem brains of suicide victims and the effects of antemortem diagnosis and psychotropic drugs. Brain Res. Mol. Brain Res. 2005; 136:29-37.

24. Egan MF, Kojima M, Callicott JH, Goldberg TE, Kolachana BS, Bertolino A. et al. The BDNF val66met polymorphism affects activity-dependent secretion of BDNF and human memory and hippocampal function. Cell. 2003;112:257-269.

25. Shimizu E, Hashimoto K, lyo M. Ethnic difference of the BDNF 196G/A (val66met) polymorphism frequencies: the possibility to explain ethnic mental traits. Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiat.r Genet. 2004;126B:122-123.

26. Trahan MA, Kahng S, Fisher AB, Hausman NL. Behavior-analytic research on dementia in older adults. J. Appl .Behav. Anal. 2011; 44: 687-91.

27. Alyautdin R, Khalin I, Nafeeza M. et al. Nanoscale Drug Delivery Systems and the BloodBrain Barrier. Int. J. Nanomed. 2014; 9: 795-811

28. Begley DJ. Delivery of therapeutic agents to the central nervous system: the problems and the possibilities. Pharmacol. Ther. 2004;104:29-45.

29. Abbott N J. Comparative physiology of the blood-brain barrier. In: Bradbury, M. W. B. (ed.), Physiology and Pharmacology of the Blood-Brain Barrier, Heidelberg: Springer-Verlag; 1992.

30. Correale J., Villa A. Cellular Elements of the Blood-Brain Barrier. Neurochem Res. 2009;34. :2067-77.

31. Meng C, He Z, Xing D. Low-level laser therapy rescues dendrite atrophy via upregulating BDNF expression: implications for Alzheimer's disease. J. of Neurosci. 2013;14, P:13505-17

32. Knusel B, Beck KD, Winslow JW, Rosenthal A, Burton LE, Widmer HR et al.. Brain-derived neurotrophic factor administration protects basal forebrain cholinergic but not nigral dopaminergic neurons from degenerative changes after axotomy in the adult rat brain. J. Neurosci. 1992;19:245-7

33. Kim Y, Kim H, Ahn S, Choi YH, Shin HK, Choi BT. Elec-troacupuncture promotes post-stroke functional recovery via enhancing endogenous neurogenesis in mouse focal cerebral ischemia. Plos one. 2014. V. 9, e90000

34. Takeshim, Y, Nakamura M, Miyake H. Neuroprotection with intraventricular brain-derived neurotrophic factor in rat venous occlusion model./ Neurosurgery. 2011;68: 1334-41.

35. Kordower JH, Palfi S, Chen M.. Clinico-pathological findings following intraventricular GDNF treatment in patient with Parkinson's disease. Ann. Neurol. 1999;46: 419-24.

36. Nutt JG. Burchiel KJ, Comella, CL., Jankovic J, Lang AE, Laws ER et al. Randomized, double-blind trial of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in PD. Neurology 2003;60:69-73.

37. Ankeni DP, McTique DM, Guan Z, Yan Q. Pegilated brain-derived nerve grouth factor shows improved distribution into spinal cord. Exp. Neurol. 2001;170:75-100.

38. Ramaswamy S, Kordower JH. Gene therapy for Huntington's disease. Neurobiol. Dis. 2012;48:243-54

39. Kojima H, Inuzuka S, Furukawa S, Construction and characterization of adenoviral vector expressing active BDNF.Bioch.Biophys. Res.Com. 1995;212: 712-17

40. Lu P, Jones LL, Tuszynski MH. BDNF-expressing marrow stromal cells support extensive axonal growth at sites of spinal cord injury./Exp. Neurol. 2005;191:344-7

41. Jeong CH, Kim SM, Lim K, Ryu CH. Mesenchymal stem cells expressing Brain-Derived Neurotrophic Factor enhance endogenous neurogenesis in an ischemic stroke model. BioMed Res. Int. 2014. Article ID 129145

42. Boado RJ, Pardridge WM. The Trojan horse liposome technology for nonviral gene transfer across the blood-brain barrier. J. Drug Deliv. 2011;296:1-12.

43. Alyautdin RN, Kroyter I, Harkevich DA. Delivery of drugs to the brain using nanoparticles. Eksperimentalnaya i klinicheskaya farmakologiya 2003; 66: 65-68 (in Russian).

44. Petrov VE, Ivanov AA, Kroyter I, Alyautdin RN, Harkevich DA. Transport of hexapeptide dalargin across the blood brain barrier by using polymeric nanoparticles. Eksperimentalnaya i klinicheskaya farmakologiya 1996; 59: 57-60 (in Russian).

45. Kurakhmaeva K, Voronina TA, Kapica I, Kreuter J, Nerobkova LN, Seredenin SB et al. Antiparkinsonian effect of nerve growth factor adsorbed on polybutylcy-anoacrylate nanoparticles coated with polysorbate-80. Bul. of Exp. Biol. Med. 2009;145 (2):259-62

Authors:

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre on Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 8 Petrovsky Boulevard, Moscow, 127051, Russian Federation.

Alyautdin RN. Deputy director of Center of Expertise of Drug Safety. Doctor of Medical Sciences.

Romanov BK. Director of Center of Expertise of Drug Safety. Doctor of Medical Sciences.

Lepakhin VK. Principal researcher of Center of Expertise of Drug Safety. Doctor of Medical Sciences.

Bunyatyan ND. Deputy Director General for the scientific work. Doctor of Pharmaceutical Sciences.

Merkulov VA. First Deputy Director General. Doctor of Medical Sciences.

Mironov AN. Director General. Doctor of Medical Sciences.

Medical Faculty of the UPNM University, Kem Sungai Besi, Kuala Lumpur, 57000, Malaysia.

Halin IG. Senior lecturer. Candidate of Medical Sciences. Об авторах:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Российская Федерация, 127051, Москва, Петровский бульвар, 8.

Аляутдин Ренад Николаевич. Заместитель директора Центра экспертизы безопасности лекарственных средств, д-р мед. наук.

Романов Борис Константинович. Директор Центра экспертизы безопасности лекарственных средств, д-р мед. наук.

Лепахин Владимир Константинович. Главный науч-

ный сотрудник Центра экспертизы безопасности лекарственных средств, д-р мед. наук.

Бунятян Наталья Дмитриевна. Заместитель генерального директора по научной работе, д-р фарм. наук.

Меркулов Вадим Анатольевич. Первый заместитель генерального директора, д-р мед. наук.

Миронов Александр Николаевич. Генеральный директор, д-р мед. наук.

Медицинский факультет Национального Университета UPNM. Малайзия, 57000, Куала Лумпур, Кет Sungai Besi.

Халин Игорь Владимирович. Старший преподаватель, канд. мед. наук.

Адрес для переписки: Аляутдин Ренад Николаевич; Alyautdin@expmed.ru

Поступила 10.04.2014 г.

Принята 30.05.2014 г.

I0)

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.