CC BY
23
https://doi.org/10.17116/molgen20203801124
Рекомбинантный фактор роста костной ткани BMP-2 человека, получаемый синтезом в клетках Escherichia coli. Часть 1: от очистки белка до экспериментальных моделей исследования эффективности
© А.В. ГРОМОВ1, М.С. ПОПОНОВА1, А.С. КАРЯГИНА1, 2 3
'Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, Москва, Россия; 2Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, Москва, Россия;
3НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
Резюме
Обзор посвящен рассмотрению методов очистки и эффективности применения для регенерации костной ткани реком-бинантного BMP-2, получаемого синтезом в клетках Escherichia coli, в составе различных материалов. Описаны способы наработки белка в гетерологичной системе экспрессии генов с последующей очисткой и рефолдингом, приводящие к получению активного димера белка. Эффективность BMP-2 прокариотического происхождения в отношении индукции остеогенеза, не уступающая эффективности белка, нарабатываемого в культурах эукариотических клеток, показана в многочисленных исследованиях с использованием разнообразных носителей и моделей на лабораторных животных. Поиск литературы проводился по базам данных PubMed Central (U.S. National Institutes of Health's National Library of Medicine, NIH/NLM), PubMed (NLM National Center for Biotechnology Information, NCBI) и e-library («Научная электронная библиотека»).
Ключевые слова: BMP-2, Escherichia coli, выделение и очистка белка, регенерация костной ткани, остеопластические материалы, обзор.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:
Громов А.В. — e-mail: alexander.v.gromov@gmail.com; https://orcid.org/0000-0001-8815-6138 Попонова М.С. — e-mail: m.poponova@gmail.com
Карягина А.С. — e-mail: akaryagina@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-2580-3489 Автор, ответственный за переписку: Громов А.В. — е-mail: alexander.v.gromov@gmail.com КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Громов А.В., Попонова М.С., Карягина А.С. Рекомбинантный фактор роста костной ткани BMP-2 человека, получаемый синтезом в клетках Escherichia coli. Часть 1: от очистки белка до экспериментальных моделей исследования эффективности. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2020;38(1):24-33. https://doi.org/10.17116/molgen20203801124
Recombinant human bone growth factor BMP-2 obtained by synthesis in Escherichia coli. Part 1: from protein purification to experimental efficiency research models
© A.V. GROMOV1, M.S. POPONOVA1, A.S. KARYAGINA1, 2, 3
1Gamaleya National Research Center of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Moscow, Russia; 2All-Russia Research Institute of Agricultural Biotechnology, Moscow, Russia;
3Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia Abstract
The review is devoted to purification and efficiency for bone tissue regenerartion of recombinant BMP-2 obtained by synthesis in Escherichia coli cells in the composition with different materials. The methods of protein synthesis in a heterologous gene expression system with subsequent purification and refolding, resulting in the production of an active dimer of the protein, are described. The effectiveness of BMP-2 of prokaryotic origin for the induction of osteogenesis, not inferior to the efficiency of the protein produced in eukaryotic cells, is shown in numerous studies using a variety of carriers and models in laboratory animals. For literature search we used data bases PubMed Central (U.S. National Institutes of Health's National Library of Medicine (NIH/ NLM)), PubMed (NLM National Center for Biotechnology Information (NCBI)) and e-library («Science Electronic Library»).
Keywords: BMP-2, Escherichia coli, protein isolation and purification, bone tissue regeneration, osteoplastic materials, review. INFORMATION ABOUT AUTHORS:
Gromov A.V. — е-mail: alexander.v.gromov@gmail.com; https://orcid.org/0000-0001-8815-6138 Poponova M.S. — е-mail: m.poponova@gmail.com
Karyagina A.S. — е-mail: akaryagina@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-2580-3489
Corresponding author: Gromov A.V. — e-mail: alexander.v.gromov@gmail.com TO CITE THIS ARTICLE:
Gromov A.V., Poponova M.S., Karyagina A.S. Recombinant human bone growth factor BMP-2 obtained by synthesis in Escherichia coli. Part 1: from protein purification to experimental efficiency research models. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2020;38(1): 24-33 (Russian). https://doi.org/10.17116/molgen20203801124
Костный морфогенетический белок 2 (Bone Mor-phogenetic Protein 2, BMP-2) относится к семейству белков TGF-в (Transforming Growth Factor в). В клетках человека BMP-2 синтезируется в виде гликози-лированного белка-предшественника длиной 396 а.о., который состоит из сигнального пептида (23 а.о.), пропептида (259 а.о.) и зрелого белка (114 а.о.). При попадании в эндоплазматический ретикулум происходит отщепление сигнального пептида с Ж-конца белка, далее в аппарате Гольджи происходит его ди-меризация и протеолитический гидролиз после Arg-283. После этого зрелая форма белка, представляющая собой гомодимер, секретируется из клетки (рис. 1) [1, 2]. При димеризации между остатками Cys-78 мономеров образуется дисульфидная связь. Каждый из мономеров в свою очередь имеет 3 внутренних дисульфидных связи между Cys-43 и Cys-111, Cys-47 и Cys-113, Cys-14 и Cys-79, образующих структурный мотив «цистиновый узел» (cystine knot) [3]. Активная димерная форма BMP-2 взаимодействует с двумя типами клеточных рецепторов; к первому относятся BMPR1a и BMPR1b, ко второму — BMPR2, ActRIfo и ActRIIb (см. рис. 1). Взаимодействие гомодимера BMP-2 с рецепторами обоих типов приводит к их активации путем автофосфорилиро-вания. Далее происходит активация сигнальных белков семейства SMAD путем фосфорилирования [4]. Активированный комплекс белков SMAD регулирует транскрипцию соответствующих генов, что, в конечном счете, приводит к проявлению биологических свойств BMP-2, основным из которых является синтез новообразованной костной ткани (остеогенез) [5]. Препарат INFUSE Bone Graft Kit (Medtronic, США), продаваемый в Европе под названием InductOS Kit (Wyeth, США), представляет собой адсорбирующую коллагеновую губку, пропитанную рекомбинантным BMP-2, полученным синтезом в эукариотических клетках. Этот препарат используют при переломах и для лечения заболеваний опорно-двигательной системы у пациентов в США и странах Западной Европы [6, 7]. Одна доза препарата (зависящая от размера дефекта костной ткани) включает от 1 до 12 мг белка. Учитывая низкий выход белка при его синтезе в эукариотических клетках и, соответственно, высокую стоимость производства, при таком расходе белка стоимость препарата очень велика — она исчисляется в тысячах долларов, что ограничивает возможность его применения в российской медицинской практике.
Привлекательной альтернативой синтезу в клетках эукариот является получение биологически активного rhBMP-2 в бактериальных системах экспрессии, которые обеспечивают значительно больший выход белка и тем самым обеспечивают существенное удешевление получаемых на его основе препаратов. Синтез в бактериальных продуцентах, как правило, приводит к отложению белка в составе телец включений и требует проведения достаточно длительной процедуры рефолдинга с целью получения активной димерной формы BMP-2 с правильно сформированными дисульфидными связями. Несмотря на отсутствие гликозилирования, характерного для белка, полученного синтезом в эукариотических клетках, белок, полученный прокариотическим синтезом, способен взаимодействовать с клеточными рецепторами и обладает специфическими in vitro и in vivo активностями, не уступающими BMP-2, полученному в клетках эукариот [8, 9]. В многочисленных работах показана его способность к остеоиндукции при применении с различными носителями в различных моделях на лабораторных животных. Имеются первые данные о клиническом применении препаратов на основе BMP-2, синтезированного клетками прокариот [10—15]. Целью данного обзора является рассмотрение текущего состояния разработок в области получения новых материалов на основе BMP-2, синтезированного в бактериальных продуцентах, и перспектив их внедрения в медицинскую практику.
Получение активного фактора BMP-2 в бактериальных продуцентах, обзор методов выделения и рефолдинга
Получение rhBMP-2 в клетках E. coli описано в нескольких работах [16—27]. С целью повышения выхода белка при синтезе в клетках E. coli используют процедуру оптимизации кодонного состава зрелой формы BMP-2. Это позволяет достичь высокого уровня синтеза BMP-2 — 50—60% от суммарного белка клетки [26, 28, 29].
В большинстве случаев при синтезе в клетках E. coli образуются нерастворимые тельца включений. Схемы очистки, различающиеся в деталях, как правило, включают растворение телец включений и ре-фолдинг [6, 17, 18, 22, 23, 26], приводящий к получению димерной формы белка, обладающей биологической активностью.
Рефолдинг BMP-2 проводят с использованием различных химических агентов, таких как окис-
Схема механизма действия BMP-2.
Образование комплекса BMP-2 с рецепторами обоих типов запускает активацию белков SMAD (сигнальные медиаторы BMP рецепторов), которые проникают в ядро и регулируют транскрипцию соответствующих генов [4].
ленный и восстановленный глутатионы [18, 22, 23], дитиотреитол (ДТТ) [20, 26], цистеин/цистин [23], обеспечивающих условия дисульфидного обмена; L-аргинин [20, 22, 23], снижающий степень агрегации; и других в различных комбинациях, условиях ионной силы, при разной температуре. В некоторых работах описано систематическое исследование с целью подбора лучших условий для рефолдинга. Так, в работе L. Vallejo и соавт. [17] проведено сравнение нескольких буферов для рефолдинга, включающих 3-(1-пиридино)-1-пропансульфонат (3-(1-pyridin-io)-1-propanesulfonate, PPS), пиридин-3 сульфоновую кислоту (pyridine-3 sulfonic acid, PSA), 2-(циклогек-силамино) этансульфоновую кислоту (2-(cyclohexyl-amino) ethanesulfonic acid, CHES) или никотиновую кислоту (nicotinic acid, NA). Рефолдинг проводили в
течение 4 дней при 20 °С. Наилучший результат был получен в случае присутствия в буфере для рефолдинга CHES. Однако, поскольку данный реагент является дорогостоящим, были предприняты дальнейшие попытки оптимизации условий рефолдинга на основе буферов с более дешевыми компонентами. В работе S. Long и соавт. [20] был опробован набор буферов, среди которых был отобран буфер, включающий 55 мМ Tris-HCl, pH 8,2, 10,56 мМ NaCl, 0,44 мМ KCl, 550 мМ гуанидин хлорида, 2,2 мМ MgCl2, 2,2 мМ CaCl2, 550 мМ L-аргинина, 1 мМ ДТТ. Инкубацию проводили в течение ночи при 0 °С, после чего мономерную и димерную формы BMP-2 разделяли на колонке с гепарин-сефарозой. Мономерную форму и смесь мономерной и димерной форм, полученные после хроматографии, опять подвергали рефолдингу
с последующей хроматографической очисткой. Путем многократного повторения стадий рефолдинга и хроматографии на гепарин-сефарозе удалось перевести в активную димерную форму более 60% BMP-2, изначально синтезированного в виде телец включений. В работе D. Nasrabadi и соавт. [23] был проведен сравнительный анализ различных окислительно-восстановительных систем и схем рефолдинга, оптимальной среди которых оказалась двухстадий-ная схема, включающая инкубацию в течение 48 ч в буфере, содержащем по 0,1 мМ окисленного и восстановленного глутатионов, и инкубацию в течение 2 ч с раствором равного объема, содержащим BMP-2, предварительно полученным с 0,5 мМ окисленного и 5 мМ восстановленного глутатионов с последующим диализом. Приведенная схема позволила повысить долю димерной формы.
Как правило, рефолдинг проводят при достаточно низкой концентрации BMP-2, обычно составляющей 0,1 мг/мл. При этом в одной из работ описана процедура пульс-ренатурации в присутствии CHES, позволяющая получить рефолдированный белок в концентрации 2,1 мг/мл [18]. Описан способ рефол-дирования BMP-2 на колонке со слабым катионоо-бменником в окислительных условиях с постепенным понижением концентрации денатурирующего агента и последующей гель-фильтрацией [30].
В одной из работ [28] описано получение растворимой формы BMP-2, синтезируемой в клетках E. coli Rogetta-gami B (DE3) c одновременной экспрессией гена тиоредоксина. Очистка белка, полученного таким образом, не требовала стадий растворения телец включений и рефолдинга. Полученный белок обладал активностью in vitro.
В ряде случаев для повышения растворимости и стабилизации BMP-2, синтезируемого в клетках E. coli, используются подходы с получением BMP-2 в составе слитых конструкций с различными tag доменами, такими как 6-His-тиоредоксин [29], s-tag (15-звенный олигопептид из рибонуклеазы А поджелудочной железы быка), димеризационный домен «лейциновая молния» из транскрипционного фактора дрожжей GCN4 [24, 27]. Показана биологическая активность BMP-2 с tag доменами как in vitro [27, 29], так и in vivo [31—36], а также возможность получения активной димерной формы зрелого BMP-2 после протеолитического отщепления соответствующих доменов [27, 37].
Описан пример получения в клетках E. coli варианта BMP-2 с присоединенным к нему коллаген-свя-зывающим доменом из фактора фон Виллебранда [38]. Такой белок лучше, чем нативный фактор, связывается с коллаген-содержащими матриксами, в частности с деминерализованным костным матрик-сом (ДКМ), и проявляет статистически достоверно более выраженную активность in vivo [39]. BMP-2 с коллаген-связывающим доменом в комбинации с коллаген-содержащим носителем эффективен на мо-
дели спондилодеза у крыс в очень низкой дозе — 0,02 мг/см3, что позволяет рассматривать такой препарат в качестве альтернативы INFUSE Bone Graft Kit (Medtronic, США), многочисленные побочные эффекты которого связаны с высокими дозами входящего в него BMP-2 эукариотического происхождения, в спинальной хирургии.
Носители BMP-2
В единственном широко применяемом в настоящее время в США и странах Западной Европы препарате INFUSE Bone Graft Kit (Medtronic, США) в качестве носителя BMP-2 используется коллагеновая губка. Первые проведенные клинические испытания препарата показали его высокую эффективность и безопасность, на основании чего было выдано разрешение FDA на его применение в спинальной хирургии для лечения переломов длинных костей и в черепно-лице-вой хирургии. Это привело к очень широкому применению препарата. Так, в США процент операций по спондилодезу с использованием BMP-2 вырос с 0,69% в 2002 г. до 24,89% в 2006 г. [40]. Одновременно с ростом популярности препарата стали появляться статьи об осложнениях, вызываемых его применением, таких как эктопический остеогенез, отек мягких тканей и др. Были проведены дополнительные клинические исследования, направленные на уточнение данных об эффективности и безопасности BMP-2 [41]. Высокая эффективность применения INFUSE Bone Graft Kit была подтверждена, а риск для пациентов был оценен в 10—50 раз выше, чем в изначально проведенных клинических исследованиях. Причинами такой высокой частоты осложнений могут быть случаи неправильного применения препарата, а также неоптимальный носитель (коллагеновая губка) и/или очень высокое — миллиграммовое — количество вводимого в организм фактора, в миллионы раз превышающее содержание BMP-2 в костной ткани [42].
В связи с этим важнейшими направлениями исследований в области регенеративной медицины являются разработка новых носителей для BMP-2 и подходов к уменьшению концентрации фактора в препаратах без снижения эффективности материалов. Такие исследования проводятся как на основе использования BMP-2, синтезированного в клетках эукариот, и таких работ — большинство, так и на основе BMP-2, полученного синтезом в клетках E. coli. Например, в работе H.S.Yang и соавт. [43] показано, что гепарин-конъюгированный фибрин (HCF — Heparin Conjugated Fibrin) демонстрирует лучшие свойства по сравнению с адсорбирующей коллагено-вой губкой в качестве носителя BMP-2 прокариоти-ческого происхождения: выход BMP-2 в случае HCF происходит в течение 20 дней, а в случае коллагено-вой губки — в течение 6 дней, активность in vitro BMP-2, вышедшего из HCF, выше, 100% репарация краниальных дефектов у мышей на сроке 8 нед после
операции в случае HCF наблюдается при дозе 0,5 мкг, а в случае коллагеновой губки — при 2 мкг BMP-2.
Носители для BMP-2 можно условно разделить на 4 группы: носители природного происхождения (коллаген, фибрин, фибриноген, органическая составляющая кости и т.д.), неорганические носители (гиалу-роновая кислота, гидроксилапатит, соли кальция, неорганическая составляющая кости), синтетические носители (различные полимеры: PCL, PDLLA и т.п.) и композитные носители (состоящие из нескольких компонентов). В табл. 1 приведены примеры исследования эффективности применения природных, неорганических и композитных носителей в комплексе с прокариотическим BMP-2 на различных моделях in vitro и in vivo. Наиболее часто в качестве носителей для BMP-2 используют материалы на основе коллагена в различных формах: в виде мембран, блоков, гелей и т.д. [39, 44], а также композитные носители [45—52].
В большинстве работ проводится сравнительное исследование материалов, содержащих и не содержащих BMP-2. Так, с применением носителей из фибро-нектина, желатина и коллагена [39, 53, 54, 58] было показано, что биологическая активность материалов с BMP-2 в составе носителя выше, чем на материалах без фактора, как в опытах на животных моделях, так и на культурах эукариотических клеток. Подобные результаты были получены и с применением неорганических матриксов — фосфатов кальция, биокерамики, гидроксилапатита, гиалуроновой кислоты [46, 48, 55—58], которые также обладают улучшенной остео-генной активностью в комплексе с BMP-2.
Хорошие результаты по восстановлению костных дефектов были отмечены при использовании модификаций природных носителей неорганическими компонентами (хитозан — фосфат кальция), неорганических с дополнительными составляющими (гидроксилапатит — магний) [45, 47]. Подобные модификации замедляют выход BMP-2 из носителя, что продемонстрировано на клеточных и животных моделях. Достаточно часто используются композиты синтетических полимеров с неорганическими компонентами [49—51], которые при использовании совместно с BMP-2 показывают хороший остеоиндуктивный эффект. В работах J. Patel и соавт. [49] и N. Moser и соавт. [50] охарактеризованы материалы с замедленным выходом BMP-2 из носителей, что позволило уменьшить дозу белка и получить более равномерный рост костной ткани.
Таким образом, работа по созданию новых, более эффективных по сравнению с адсорбирующей коллагеновой губкой, носителей BMP-2, в частности BMP-2 прокариотического происхождения, ведется во многих направлениях и пока далека до завершения. Основной тенденцией в этой области является создание материалов с замедленной скоростью выхода BMP-2 из носителя. Конечной целью этих разработок является снижение эффективной дозы BMP-2 в остеопластических материалах.
Экспериментальные модели на лабораторных
животных для тестирования эффективности
материалов, содержащих BMP-2
Материалы, содержащие BMP-2 как эукариоти-ческого, так и прокариотического происхождения, тестируются на одних и тех же моделях лабораторных животных. Выбор конкретной модели определяется не типом белка, а конечной целью исследования; свойствами носителя; бюджетом проекта, в рамках которого выполняется эксперимент; предшествующим опытом исследовательской группы. Тем не менее в данном обзоре, описывая ту или иную экспериментальную модель, мы приводим примеры использования конкретной модели для тестирования материалов с BMP-2, синтезированного в клетках прокариот.
Наиболее распространенными моделями, используемыми для тестирования эффективности материалов, содержащих BMP-2, являются модели, основанные на хирургически создаваемых дефектах костной ткани, так называемых дефектах критического размера. Дефектом критического размера называют дефект, который самопроизвольно, без какого-либо лечения, не зарастает в течение жизни лабораторного животного или на протяжении эксперимента [59]. Наиболее распространенными дефектами критического размера, используемыми в различных лабораториях, являются дефекты костей свода черепа и длинных костей.
Круглый дефект теменной кости свода черепа обычно делается специальным хирургическим инструментом — трепаном, при этом очень важным является полное удаление кости без повреждения твердой мозговой оболочки. Диаметр дефекта критического размера зависит от вида животного: у мышей это 5 мм, у крыс — 8 мм, у кроликов — 15 мм, у обезьян — 15 мм, у собак — 20 мм, у овец — 22 мм [60]. Большинство исследований проводится на грызунах — мышах и крысах, поскольку работа с более крупными животными требует существенно больших материальных затрат и более трудоемка. При этом следует отметить, что особенно в случае мышей маленький размер дефекта и незначительная толщина костей требуют особой точности при проведении хирургических манипуляций, поэтому нельзя исключить появления ошибок, которые могут сказаться на результатах эксперимента. Модель дефекта критического размера свода черепа является, вероятно, самой распространенной экспериментальной моделью при исследовании остео-генности различных материалов вследствие ее высокой стандартизуемости и достаточно легкого хирургического доступа. Модель дефекта критического размера свода черепа крыс используется, например, в работе, показывающей остеоиндуктивность BMP-2, синтезированного в клетках E. coli, при его введении в дефект на адсорбирующей коллагеновой губке [61].
Сегментарные (с удалением части кости) дефекты длинных костей очень разнообразны как по месту ло-
Примеры применения различных носителей с BMP-2 прокариотического происхождения на моделях in vitro и in vivo
Носитель
Форма носителя Количество BMP-2
Модель
Результат
Ссылки
Коллаген
Коллаген
Фибрин
Желатин
Хитозан
Скаффолд
Губка Блок Мембрана Гидрогель
Природные носители
in vitro: 5 мкг In vitro: выход BMP-2 в
буфер
In vivo: модель срастания позвонков у крыс
in vivo: 3 мкг на скаффолд (2 скаффолда на животное) 10 мкг
10 мкг
Не указано
8 мкг
Фибронектин
Материал для нанесения на твердый носитель
0,5 мкг/см2
Дефект критического размера малой берцовой кости крыс Дефект критического размера малой берцовой кости крыс Радиальный дефект на диафизе правой передней
конечности кролика Модель in vitro на культуре клеток С2С12: выход BMP-2 в буфер In vivo: дефекты голеней кроликов
Эксперимент на культуре клеток С2С12
ДКМ
ДКМ
Мембраны
Гель
0,21—0,23 мг на 100 мг носителя; 0,5 мг на 100 мг носителя 2,5 мкг
Модель краниальных дефектов критического размера крыс и мышей Модель краниальных дефектов крыс
Аутогенная кость (автоклавируемая)
Неорганический костный матрикс (Bio-Oss (Geistlich, Wolhusen, Switzerland))
Неорганический костный матрикс (Bio-Oss (Geistlich, Wolhusen, Switzerland))
Гидроксилапатит
Гидроксилапатит
Блок
Матрикс
Блок
Гранулы
Гранулы
10 мкг
Дефект критического размера малой берцовой кости крыс Неорганические носители
10 мкг
1 мг/блок
10 мкг
70 мкг на 25 мг носителя
Модель краниальных дефектов кроликов
Дефект критического размера челюсти свиней
In vitro: на культуре эукариотических клеток С2С12
Модель краниальных дефектов кроликов
In vitro: взрывной выход [39] BMP-2, затем — выход на плато. In vivo: срастание позвонков Наблюдалось [44]
зарастание дефекта
Наблюдалось [44]
зарастание дефекта
Полное зарастание [53]
дефекта за 8 нед
Вначале взрывной [45]
выход BMP-2 в буфер, после чего выход замедлялся, активной пролиферации культуры клеток не наблюдалось in vivo образования кости не показано BMP-2 связывался с [54] фибронектином и не высвобождался после иммобилизации, BMP-2 проявлял биологическую активность на культуре клеток в связанном и
свободном виде Зарастание дефекта [31, 32] через 9 нед, резорбция носителя Зарастание дефекта [9]
через 4 и 8 нед, преимущество по сравнению с BMP-2 эукариотического происхождения Восстановление [44]
дефекта кости
Улучшенное [55]
восстановление дефекта
с ВМР-2 в составе носителя по сравнению с носителем без фактора Восстановление кости в [46] области дефекта
Показал меньшую [47]
активность по сравнению с модифицированным Mg
носителем Восстановление кости в [56] области дефекта
Окончание таблицы на след. стр.
Примеры применения различных носителей с BMP-2 прокариотического происхождения на моделях in vitro и in vivo
(окончание)
Носитель Форма носителя Количество BMP-2 Модель Результат Ссылки
ß-трикальций- Гранулы 5 мкг, 15 мкг, 50 мкг, Модель сращения Потеря подвижности [48]
фосфат (ß-TCP) 150 мкг на 500 мкг заднелатеральных позвонков, наилучшие
носителя поясничных позвонков результаты достигались
кролика при 50 и 150 мкг BMP-2
ß-трикальций- Гранулы 50 мкг Сегментарные дефекты 40% сращения на 12 нед [57]
фосфат критического размера и 90% сращения на 24
(ß-TCP) бедренной кости нед при использовании
кроликов BMP-2
Композитные носители
Поли-Е-капролактон Диск 1,4 мкг, 5 мкг, 20 мкг, In vitro: на культуре Показана [49]
(PCL) + гидроксил- 65 мкг эукариотических клеток биологическая
апатит С2С12 активность с BMP-
In vivo: подкожная 2 на культуре
имплантация мышам клеток, наблюдался
замедленный выход
белка из носителя,
наблюдался рост
костной ткани in vivo
Поли^^-молочная Гранулы 400 мкг/г, 800 мкг/г, Мандибулярные дефекты Дозозависимая [50]
кислота) (PDLLA)/ 1600 мкг/г и имплантация в ремодуляция кости,
CaCO3 ягодичные мышцы крыс экспрессия остеогенных
маркеров
Mg-гидроксилапатит Наночастицы 10 мкг In vitro: на культуре Большая биологическая [47]
эукариотических клеток активность по
С2С12 сравнению с
гидроксилапатитом
Керамика Блоки 500 мкг/блок In vitro: клеточная Активность на [46]
(ß-трикальций- культура С2С12 культуре C2C12, при
фосфат (ß-TCP)) + In vivo: имплантация в имплантации в мышцы
гидроксил-апатит) мышцы; дефект большой наблюдались очаги
берцовой кости кроликов формирования кости в
матриксе, образование
новой кости в области
дефекта
Хитозан + соли Гидрогель 8 мкг In vitro: выход BMP-2 в Замедленный выход [45]
фосфата кальция буфер; взаимодействие с BMP-2 из носителя,
клетками С2С12 после чего выход
In vivo: дефекты голеней замедлялся, активная
кроликов пролиферация
клеточной кульуры,
активное образование
трабекулярной кости
in vivo
а-трикальций- Диск 20 мкг/мл, 40 мкг/мл, In vitro: выход BMP-2 в В течение 2 ч [51]
фосфат/поли (D,L- 60 мкг/мл буфер; взаимодействие с наблюдался взрывной
лактид-ко-гликолид) клетками С2С12 выход BMP-2 из
(a-TCP/PLGA) носителя, после
чего выход фактора
стабилизировался,
наблюдалась
дозозависимая
биологическая
активность на культуре
клеток; разницы между
20 мкг/мл и 40 мкг/мл
BMP-2 не выявили
Фибриноген- Гидрогель 1 мкг/мл, 5 мкг/мл Модель дегенерации Побочных реакций [58]
гиалуроновая позвонков коз с помощью зафиксировано не
кислота хондроитиназы АВС было, регенерации
позвоночных дисков
также не было
Коллаген — Гидрогель 2 мкг Модель краниальных Заживление дефектов [52]
гидроксилапатит — дефектов мышей у молодых и старых
полиэтиленгликоль животных
кализации, так и по размерам, варьирующим от 0,4 см у мышей до 7—7,5 см у собак, коз и приматов [62]. Они используются реже, чем краниальные дефекты, поскольку выполнение операций по созданию таких дефектов требует более сложного хирургического доступа, в большинстве случаев нужно осуществлять внутреннюю или внешнюю фиксацию костей. Тем не менее, например, при разработке материалов, которые планируется применять для лечения несращений при переломах длинных костей, такого рода модели используются часто. В качестве примера использования таких моделей для оценки эффективности материалов с BMP-2 бактериального происхождения можно привести работу корейской группы исследователей, выполненную на моделях сегментарных дефектов малоберцовой кости крыс и лучевой кости кроликов [44].
Потребность в получении новых материалов для спинальной хирургии привела к разработке ряда моделей на животных, в основном на крысах и кроликах, в некоторых случаях — на более крупных животных, в которых исследуется эффективность сращения позвонков при введении BMP-2 с разными носителями. Так, в работе T. Matsumoto и соавт. [63] на модели спондилодеза поясничных позвонков у кроликов показана эффективность материала, представляющего собой композит из полимера PLA-PEG (Poly-D,L-Lactic Acid/PolyEthylene Glycol block copolymer) с ß-трикальцийфосфатом, с введенным в него BMP-2, полученным в клетках E. coli.
При разработке новых материалов для дентальной имплантологии и челюстно-лицевой хирургии используют различные модели дефектов челюсти. Например, в работе J.-S. Lee и соавт. [64] для сравнения остеоген-ных свойств двух материалов с BMP-2, полученным синтезом в клетках E. coli, использовали сразу 2 экспериментальных модели — модель синус-лифтинга у кроликов и модель заполнения исследуемым материалом лунок удаленных зубов у собак породы бигль.
Также широко используется модель эктопического остеогенеза, которая хирургически реализуется с помощью внутримышечной или подкожной имплантации лабораторным животным, в частности, мышам и крысам, носителей с BMP-2 или BMP-2 в сочетании с другими факторами. Примером работы,
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, Mitsock LM, Whitters MJ, Kriz RW. et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 1988;242:1528-1534. https://doi.org/10.1126/science.3201241
2. Israel DI, Nove J, Kerns KM, Moutsatsos IK, Kaufman RJ. Expression and characterization of bone morphogenetic protein-2 in Chinese hamster ovary cells. Growth Factors. 1992;7(2):139-150.
3. Scheuxer C, Sebald W, Hulsmeyer M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Ä resolution. J Mol Biol. 1999;287(1):103-115. https://doi.org/10.1006/jmbi.1999.2590
4. Granjeiro JM. Bone morphogenetic proteins: from structure to clinical use. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2005;38(10):1463-1473. https://doi.org/10.1590/s0100-879x2005001000003
включающей использование модели эктопического остеогенеза, является исследование, в котором было показано, что дексаметазон усиливает эктопический остеогенез при внутримышечном введении крысам блока из ß-трикальцийфосфата, пропитанного BMP-2 бактериального происхождения [65]. Другим примером является процитированная выше работа J. Lee и соавт. [61], в которой остеоиндуктивность BMP-2, синтезированного в E. coli, оценивалась также по степени эктопического остеогенеза у крыс при подкожном введении фактора на коллагеновой губке.
Заключение
Таким образом, рекомбинантный BMP-2, синтезируемый в клетках E. coli, представляет собой пример эукариотического белкового фактора, для которого удалось решить, казалось бы, непреодолимую по сложности задачу — разработать эффективные технологии синтеза белка в гетерологичной системе экспрессии генов с последующей очисткой и рефолдингом, приводящие к получению активного димера с правильно организованной системой дисульфидных связей: одной межмолекулярной и тремя внутримолекулярными в каждом мономере. На большом экспериментальном материале, включающем исследования с использованием широкого спектра разнообразных носителей и моделей на лабораторных животных, показана эффективность BMP-2 прокариотического происхождения в отношении индукции остеогенеза, не уступающая таковой для эукариотического рекомбинантного BMP-2.
Вторая часть обзора будет посвящена совместному применению BMP-2 c другими факторами в составе одного материала, а также медицинскому применению материалов с добавлением BMP-2 бактериального происхождения.
Благодарности. Авторы выражают благодарность д.б.н. Бокше И.С. за обсуждение обзора.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (грант №16-15-00133).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
5. Зайцев В.В., Карягина А.С., Лунин В.Г. Костные морфогенетические белки (BMP): общая характеристика, перспективы клинического применения в травматологии и ортопедии. Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. 2009;4:79-84.
Zaitsev VV, Karyagina AS, Lunin VG. Bone morphogenetic proteins (BMP): characteristics, prospects of clinical application in traumatology and orthopedics. Vestn Travmatol Ortopedim. N.N. Priorova. 2009;4:79-84. (In Russ.).
6. Li RH, Wozney JM. Delivering on the promise of bone morphogenetic proteins. TrendsBiotechnol. 2001;19(7):255-265.
7. Kirker-Head CA. Potential applications and delivery strategies for bone morphogenetic proteins. Adv Drug Deliv Rev. 2000;43(1):65-92.
8. Kim IS, Lee EN, Cho TH, Song YM, Hwang SJ, Oh JH, et al. Promising efficacy of Escherichia coli recombinant human bone morphogenetic pro-
tein-2 in collagen sponge for ectopic and orthotopic bone formation and comparison with mammalian cell recombinant human bone morphogenet-ic protein-2. Tissue. Eng Part A. 2011;17(3-4):337-348. https://doi.org/10.1089/ten.TEA.2010.0408
9. Jin YZ, Zheng GB, Lee JH. Escherichia coli BMP-2 showed comparable osteoinductivity with Chinese hamster ovary derived BMP-2 with deminer-alized bone matrix as carrier. Growth Factors. 2019;4:1-10. https://doi.org/10.1080/08977194.2019.1596905
10. Гинцбург А.Л., Карягина А.С., Лунин В.Г., Семихин А.С. Разработка препаратов нового поколения для эффективной регенерации костной ткани. Лечение и профилактика. 2011;1(1):80-84.
Gintsburg AL, Karyagina AS, Lunin VG, Semikhin AS. Development of new generation drugs for effective bone tissue regeneration. Lechenie i pro-filaktika. 2011;1(1):80-84. (In Russ.).
11. Гинцбург А.Л., Шарапова Н.Е., Надеждин С.В., Федорова М.З., Карягина А.С., Лунин В.Г. Новые препараты, стимулирующие регенерацию костной ткани. Современные медицинские технологии. 2011;7:60-62. Gintsburg AL, Sharapova NE, Nadezhdin SV, Fedorova MZ, Karyagina AS, Lunin VG. New drugs stimulating bone tissue regeneration. Sovremennye meditsinskie tekhnologii. 2011;7:60-62. (In Russ.).
12. Донченко С.В., Карягина А.С., Алексеев Д.В., Лунин В.Г. Первый опыт применения остеопластических материалов нового поколения, содержащих рекомбинантные человеческие костные морфогенетиче-ские белки (rhBMPs), при дефектах и посттравматической патологии костной ткани. Московский медицинский журнал. 2012;4:16-21. Donchenko SV, Karyagina AS, Alekseev DV, Lunin VG. First experience using new generation osteoplastic materials containing recombinant human bone morphogenetic proteins (rhBMPs) for defects and post-traumatic bone tissue pathology. Moskovskiy meditsinskiy zhurnal. 2012;4:16-21. (In Russ.).
13. Бартов М.С., Карягина А.С., Громов А.В., Мишина Д.М., Трунова Г.В., Сидорова Е.И. и др. Остеопластические препараты нового поколения «Гамалант», содержащие факторы роста и регенерации костной ткани. Кафедра травматологии и ортопедии. 2012;2:21-25.
Bartov MS, Karyagina AS, Gromov AV, Mishina DM, Trunova GV, Sidorova EI, et al. New generation osteoplastic drugs «Gamalant» containing growth factors and bone tissue regeneration. Kafedra travmatologii iortopedii. 2012;2:21-25. (In Russ.).
14. Олесова В.Н., Кононенко В.И., Берсанов Р.У., Кащенко П.В., Никон-чук Е.Е., Чуянова Е.Ю. Предимплантологическая подготовка альвеолярной лунки удаленного зуба с использованием отечественного материала Gamalant™-паста-ФОРТЕ Плюс. Фарматека. 2013;2:28-30. Olesova VN, Kononenko VI, Bersanov RU, Kashchenko PV, Nikonchuk EE, Chuyanova EYu. Pre-implantation preparation of an alveolar hole of an extracted tooth using national material «Gamalant™ paste-FORTE Plus». Farmateka. 2013;2:28-30. (In Russ.).
15. Huh J-B, Lee H-J, Jang J-W, Kim M-J, Yun P-Y, Kim S-H, et al. Randomized clinical trial on the efficacy of Escherichia coli-derived rhBMP-2 with ß-TCP/HA in extraction socket. The Journal of Advanced Prosthodontics. 2011;3(3):161-165.
https://doi.org/10.4047/jap.2011.3.3.161
16. Ruppert R, Hoffmann E, Sebald W. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. Eur J Biochem. 1996;237(1):295-302.
17. Vallejo LF, Brokelmann M, Marten S, Trappe S, Cabrera-Crespo J, Hoffmann A, et al. Renaturation and purification of bone morphogenetic pro-tein-2 produced as inclusion bodies in high-cell-density cultures of recombinant Escherichia coli. JBiotechnol. 2002;94(2):185-194.
18. Vallejo LF, Rinas U. Optimized procedure for renaturation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 at high protein concentration. Bio-technol Bioeng. 2004;85(6):601-609. https://doi.org/10.1002/bit.10906
19. Boix T, Gomez_Morales J, Torrent-Burgues J, Monfort A, Puigdomenech P, Rodriguez-Clemente R. Adsorption of recombinant human bone morphogenetic protein rhBMP-2 onto hydroxyapatite. JInorgBiochem. 2005;99(5):1043-1050. https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2005.01.011
20. Long S, Truong L, Bennett K, Phillips A, Wong-Staal F, Ma H. Expression, purification and renaturation of bone morphogenetic protein-2 from Esch-erichia coli. Protein Expr Purif. 2006;46(2):374-378. https://doi.org/10.1016/j.pep.2005.09.025
21. Zhang H, Wu J, Zhang Y, Fu N, Wang J, Zhao S. Optimized procedure for expression and renaturation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 at high protein concentrations. Mol Biol. 2010;37(7):3089-3095. https://doi.org/10.1002/bit.10906
22. Von Einem S, Schwarz E, Rudolph R. A novel two-step renaturation procedure for efficient production of recombinant BMP-2. Protein Expr Purif. 2010;73(1):65-69.
https://doi.org/10.1016/j.pep.2010.03.009
23. Nasrabadi D, Rezaeiani S, Sayadmanesh A, Eslaminejad MB, Shabani A. Inclusion body expression and refolding of recombinant bone morphogenetic protein-2. Avicenna J Med Biotechnol. 2018;10(4):202-207.
24. Zhang Y, Ma Y, Yang M, Min S, Yao J, Zhu L. Expression, purification, and refolding of a recombinant human bone morphogenetic protein 2 in vitro. Protein Expr Purif. 2011;75(2):155-160. https://doi.org/10.1016/j.pep.2010.07.014
25. Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М., Лаврова Н.В., Полетаева Н.Н., Тухватулин А.Э. и др. Получение рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 человека в клетках Escherichia coli и тестирование его биологической активности in vitro и in vivo. Мол биол. 2010;44(6):1036-1044.
Sharapova NE, Kotnova AP, Galushkina ZM, Lavrova NV, Poletaeva NN, Tukhvatulin AE, et al. Production of the recombinant human bone morpho-genetic protein-2 in Escherichia coli and testing of its biological activity in vitro and in vivo. Mol Biol. 2010;44(6):1036-1044. (In Russ.).
26. Karyagina AS, Boksha IS, Grunina TM, Demidenko AV, Poponova MS, Sergienko OV, et al. Optimization of rhBMP-2 active-form production in a heterologous expression system using microbiological and molecular genetic approaches. Mol Genet Mikrobiol Virol. 2016;31(4):208-213. https://doi.org/10.3103/S0891416816040030
27. Karyagina AS, Boksha IS, Grunina TM, Demidenko AV, Poponova MS, Ser-gienko OV, et al. Two variants of recombinant human bone morphogenetic protein 2 (rhBMP-2) with additional protein domains: synthesis in an Escherichia coli heterologous expression system. Biochemistry (Moscow). 2017;82(5):613-624. https://doi.org/10.1134/S0006297917050091
28. Ihm HJ, Yang SJ, Huh JW, Choi SY, Cho SW. Soluble expression and purification of synthetic human bone morphogenetic protein-2 in Escherichia coli. BMBRep. 2008;41(5):404-407. https://doi.org/10.5483/BMBRep.2008.41.5.404
29.
30.
Retnoningrum DS, Pramesti HT, Santika PY, Valerius O, Asjarie S, Sucia-ti T. Codon optimization for high level expression of human bone morphogenetic protein-2 in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2012;84(2):188-194. https://doi.org/10.1016/j.pep.2012.05.010
Rane AM, Jonnalagadda S, Li Z. On-column refolding of bone morphogenetic protein-2 using cation exchange resin. Protein Expr Purif. 2013;90(2):135-140. https://doi.org/10.1016/j.pep.2013.05.008
31. Bartov MS, Gromov AV, Poponova MS, Savina DM, Nikitin KE, Grunina TM, et al. Modern approaches to research of new osteogenic biomaterials on the model of regeneration of cranial critical-sized defects in rats. Bull Exp Biol Med. 2016;162(2):273-276. https://doi.org/10.1007/s10517-016-3593-x
32. Bartov MS, Gromov AV, Manskih VN, Makarova EB, Rubshtein AP, Poponova MS, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) with additional protein domain synthesized in E. coli: in vivo osteoinductivity in experimental models on small and large laboratory animals. Bull Exp Boil Med. 2017;164(2):148-151. https://doi.org/10.1007/s10517-017-3945-1
33. Гайфуллин Н.М., Карягина А.С., Громов А.В., Терпиловский А.А., Маланин Д.А, Демещенко М.В. и др. Морфологические особенности остеоинтеграции при использовании титановых имплантатов с биоактивным покрытием и рекомбинантного костного морфогенетического белка rhBMP-2. Морфология. 2016;149(1):7-84.
Gaifullin NM, Karyagina AS, Gromov AV, Terpilovskiy AA, Malanin DA, Demeshchenko MV, et al. Morphological characteristics of osteointegration of titanium implants with bioactive coating and recombinant bone morphogenetic protein. Morfologiya. 2016;149(1):77-84. (In Russ.).
34. Андреев А.Ю., Захаров В.Д., Зайратьянц О.В., Борзенок С.А., Хубе-цова М.Х., Осидак Е.О. и др. Перспективы использования фактора роста костной ткани в составе коллагенового носителя в целях укрепления роговицы (экспериментальное исследование). Современные технологии в офтальмологии. 2016;4:11-16.
Andreev AYu, Zakharov VD, Zairatyants OV, Borzenok SA., Khubetsova MKh, Osidak EO, et al. Prospects for the use of bone growth factor as a component of collagen matrix for cornea strengthening (experimental study). Sovr Tekhnol Oftalmol. 2016;4:11-16. (In Russ.).
35. Захаров В.Д., Андреев А.Ю., Зайратьянц О.В., Осидак Е.О., Борзенок С.А., Крашенинников С.В. и др. Морфологические изменения роговицы кроликов под влиянием фактора роста костной и хрящевой ткани rhBMP-2 в составе интракорнеального коллагенового имплантата. Клиническая и экспериментальная морфология. 2016;4:36-42. Zakharov VD, Andreev AYu, Zairatyants OV, Osidak EO, Borzenok SA, Krasheninnikov SV, et al. Morphological changes in rabbit cornea caused be the bone and cartilage growth factor rhBMP-2 used as a component intra-corneal implant. Klin Eksp Morfol. 2016;4:36-42. (In Russ.).
36.
Захаров В.Д., Зайратьянц О.В., Андреев А.Ю., Осидак Е.О., Борзенок С.А., Крашенинников С.В. и др. Влияние фактора роста rhBMP-2 в
составе коллагенового носителя на морфологические и биомеханические характеристики роговицы. Офтальмохирургия. 2016;4:20-28. Zakharov VD, Zairatyants OV, Andreev AYu, Osidak EO, Borzenok SA, Krasheninnikov SV, еt al. Influence of rhBMP-2 growth factor in composition with collagen carrier on morphological and biomechanical characteristics of cornea. Fyodorov Journal of Ophthalmic Surgery. 2016;4:20-28. (In Russ.).
37. Pramesti HT, Suciati T, Indrayati A, Asjarie S, Retnoningrum DS. Recombinant human Bone Morphogenetic Protein-2: optimization of overproduction, solubilization, renaturation and its characterization. Biotechnology. 2012;11(3):133-143.
https://doi.org/10.3923/biotech.2012.133.143
38. Chen B, Lin H, Zhao Y, Wang B, Zhao Y, Liu Y, et al. Activation of demin-eralized bone matrix by genetically engineered human bone morphogenetic protein-2 with a collagen binding domain derived from von Willebrand factor propolypeptide. JBiomed Mater Res A. 2007;80(2):428-434. https://doi.org/10.1002/jbm.a.30900
39. Han X, Zhang W, Gu J, Zhao H, Ni L, Han J, et al. Accelerated postero-lateral spinal fusion by collagen scaffolds modified with engineered collagen-binding human bone morphogenetic protein-2 in rats. PLoS ONE. 2014;9(5):e98480. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0098480
40. Cahill KS, Chi JH, Day A, Claus EB. Prevalence, complications, and hospital charges associated with use of bone-morphogenetic proteins in spinal fusion procedures. Jama — J Am Med Assoc. 2009;302(1):58-66. https://doi.org/10.1001/jama.2009.956
41. Carragee EJ, Hurwitz EL, Weiner BK. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 2011;11(6):471-491. https://doi.org/10.1016/j.spinee.2011.04.023
42. Gamradt SC, Lieberman JR. Genetic modification of stem cells to enhance bone repair. Ann Biomed Eng. 2004;32(1):136-147. https://doi.org/10.1023/B:ABME.0000007798.78548.b8
43. Yang HS, La W-G, Cho Y-M, Shin W, Yeo G-D, Kim B-S. Comparison between heparin-conjugated fibrin and collagen sponge as bone morphogenetic protein-2 carriers for bone regeneration. Exp Mol Med. 2012;44(5):350-355. https://doi.org/10.3858/emm.2012.44.5.039
44. Nam J-W, Kim H-J. Stepwise verification of bone regeneration using recombinant human bone morphogenetic protein-2 in rat fibula model. J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg. 2017;43(6):373-387. https://doi.org/10.5125/jkaoms.2017.43.6.373
45. Guzman R, Nardecchia S, Gutierrez MC, Ferrer ML, Ramos V, del Monte F, et al. Chitosan scaffolds containing calcium phosphate salts and rhBMP-2: in vitro and in vivo testing for bone tissue regeneration. PLoS ONE. 2014;9(2):e87149. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087149
46. Abarrategi A, Moreno-Vicente C, Martinez-Vazquez FJ, Civantos A, Ramos V, Sanz-Casado JV, et al. Biological properties of solid free form designed ceramic scaffolds with BMP-2: in vitro and in vivo evaluation. PLoS ONE. 2012;7(3):e34117. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0034117
47. Huang B, Yuan Y, Li T, Ding S, Zhang W, Gu Y, et al. Facilitated receptor-recognition and enhanced bioactivity of bone morphogenetic protein-2 on magnesium-substituted hydroxyapatite surface. Sci Rep. 2016;6:24323. https://doi.org/10.1038/srep24323
48. Dohzono S, Imai Y, Nakamura H, Wakitani S, Takaoka K. Successful spinal fusion by E. coli-derived BMP-2-adsorbed porous ß-TCP granules6 a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 2009;476(12):3206-3212. https://doi.org/10.1007/s11999-009-0960-1
49. Patel J, Flanagan CL, Hollister SJ. Bone morphogenetic protein-2 adsorption onto poly-8-caprolactone better preserves bioactivity in vitro and produces more bone in vivo than conjugation under clinically relevant loading scenarios. Tissue Engineering. 2015;21(5):489-498. https://doi.org/10.1089/ten.TEC.2014.0377
50. Moser N, Lohse N, Goldstein J, Kauffmann P, Sven B, Epple M, et al. Do we need retarded delivery of bone growth factors in facial bone repaire? An experimental study in rats. European Cells and Materials. 2017;134:162-179. https://doi.org/10.22203/eCM.v034a11
51. Sharma A, Meyer F, Hyvonen M, Best SM, Cameron RE, Rushton N. Os-teoinduction by combining bone morphogenetic protein (BMP)-2 with a bioactive novel nanocomposite. Bone Joint Res. 2012;1(7):145-151. https://doi.org/10.1302/2046-3758.17.2000082
52. Charles LF, Woodman JL, Ueno D, Gronowicz G, Hurley MM, Kuhn LT. Effects of low dose FGF-2 and BMP-2 on healing of calvarial defects in old mice. Exp Gerontol. 2015;64:62-69. https://doi.org/10.1016Xj.exger.2015.02.006
53. Kim S-G, Jeong J-H, Che X, Park Y-T, Lee S-W, Jung E-S, et al. Reconstruction of radial bone defect using gelatin sponge and a BMP-2 combination graft. BMBRep. 2013;46(6):328-333. https://doi.org/10.5483/BMBRep.2013.46.6.231
54. Hauff K, Zambarda C, Dietrich M, Halbig M, Grab AL, Medda R, et al. Matrix-immobilized BMP-2 on microcontact printed fibronectin as an in vitro tool to study BMP-mediated signaling and cell migration. Front Bioeng Biotechnol. 2015;3:62. https://doi.org/10.3389/fbioe.2015.00062
55. Huh J-B, Yang J-J, Choi K-H, Bae JH, Lee J-Y, Kim S-E, et al. Effect of rhBMP-2 immobilized anorganic bovine bone matrix on bone regeneration. Int J Mol. Sci. 2015;16(7):16034-16052. https://doi.org/10.3390/ijms160716034
56. Kim S-Y, Lee Y, Seo S-J, Lim J-H, Kim Y-G. Effects of Escherichia coli-derived recombinant human bone morphogenetic protein-2 loaded porous hydroxyap-tite-based ceramics on calvarial defect in rabbits. J Bone Metab. 2017;24(1):23-30. https://doi.org/10.11005/jbm.2017.24.1.23
57. Kuroiwa Y, Niikura T, Lee SY, Oe K, Iwakura T, Fukui T, Matsumoto T, et al. Escherichia coli-derived BMP-2-absorbed ß-TCP granules induce bone regeneration in rabbit critical-sized femoral segmental defects. Int Orthop. 2019;43(5):1247-1253. https://doi.org/10.1007/s00264-018-4079-4
58. Peeters M, Detiger SEL, Karfeld-Sulzer LS, Smit TH, Yayon A, Weber FE, et al. BMP-2 and BMP-2/7 heterodimers conjugated to a fibrin/hyaluron-ic acid hydrogel in a large animal model of mild intervertebral disc degeneration. Bio Research. 2015;4(1):398-406. https://doi.org/10.1089/biores.2015.0025
59. Schmitz JP, Hollinger JO. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clin Orthop Relat Res. 1986;205:299-308.
60. Szpalski C, Barr J, Wetterau M, Saadeh PB, Warren SM. Cranial bone defects: current and future strategies. Neurosurg Focus. 2010;29(6):E8. https://doi.org/10.3171/2010.9.F0CUS10201
61. Lee JH, Kim CS, Choi KH, Jung UW, Yun JH, Choi SH, et al. The induction of bone formation in rat calvarial defects and subcutaneous tissues by recombinant human BMP-2, produced in Escherichia coli. Biomaterials. 2010;31(13):3512-3519.
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2010.01.075
62. Horner EA, Kirkham J, Wood D, Curran S, Smith M, Thomson B, et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Ehgineering: Part B. 2010;16(2):263-271. https://doi.org/10.1089/ten.TEB.2009.0224
63. Matsumoto T, Toyoda H, Dohzono S, Yasuda H, Wakitani S, Nakamura H. et al. Efficacy of interspinous process lumbar fusion with recombinant human bone morphogenetic protein-2 delivered with a synthetic polymer and ß-tricalcium phosphate in a rabbit model. Eur Spine J. 2012;21(7):1338-1345. https://doi.org/10.1007/s00586-011-2130-x
64. Lee J-S, Kim T-W, Park S, Kim B-S, Im G-I, Cho K-S, et al. Reduction of adipose tissue formation by the controlled release of BMP-2 using a hydroxy-apatite-coated collagen carrier system for sinus-augmentation/extraction-socket grafting. Materials (Basel). 2015;8(11):7634-7649. https://doi.org/10.3390/ma8115411
65. Yuasa M, Yamada T, Taniyama T, Masaoka T, Xuetao W, Yoshii T, et al. Dexamethasone enhances osteogenic differentiation of bone marrow- and muscle-derived stromal cells and augments ectopic bone formation induced by bone morphogenetic protein-2. PLoS One. 2015;10(2):e0116462. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0116462
Поступила в редакцию 04.06. 19
Received 04.06. 19
После доработки 04.09. 19
Revised 04.09. 19
Принята к публикации 15.09. 19
Accepted 15.09. 19
