CC BY
56
et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nat. Neurosci. 2013; 16: 64—70.
31. Petreanu L., Huber D., Sobczyk A., Svoboda K. Channelrhodopsin-2 — assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 2007; 10: 663—8.
32. Richter C.-P., Tan X. Photons and neurons. ELSEVIER. 2014; 1—17.
33. Shimizu-Sato S., Huq E., Tepperman J.M., Quail P.H. A lightswitchable gene promoter system. Nat. Biotechnol. 2002; 20(10): 1041—4.
34. T0nnesen J., S0rensen A., Deisseroth K., Lundberg C., Kokaia M. Optogenetic control of epileptiform activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106: 12162—7.
35. Tsai H.C., Zhang F., Adamantidis A., Stuber D.G. et al. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral condition. Science. 2009; 324. № 5930: 1080—4.
36. Wang X., Chen X., Yang Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 2012; 9(3): 266—9.
37. Yin T., Wu Y. Guiding lights: recent developments in optogenetic control of biochemical signals. J. Physiol. 2013; 465: 397—408.
38. Yizhar O., Fenno L.E., Davidson T.J., Morgi M., Deisseroth K. Optogenetics in neuronal systems. Neuron. 2011; 71: 9—34.
39. Zeng H., Madisen L. Mouse transgenic approaches in optogenetics. Prog. Brain Res. 2012; 196: 193—213.
40. Zhao S., Cunha G., Zhang F., Liu Q. et al. Improved expression of
halorhodopsin for light-induced silencing of neuronal activity. Brain Cel.lBiol. 2008; 36(1—4): 141—54.
Поступила 17.09.15
E.V. Borisova, E.A. Epifanova, SA. Tutukov, VA. Salina, AA. Babaev
OPTOGENETIC APPROACHES IN NEUROBIOLOGY
Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod, 603950, Nizhny Novgorod, Russian Federation
Optogenetics is a rapidly developing new technique that combines optic methods with techniques used in molecular biology. It can be used for monitoring various optic processes in cells and controlling their activity using light. The technique is based on bacterial opsin expression in mammalian neurons. In this review, the use of optogenetics for controlling the activity of specific neuron populations in different regions of the human brain is considered in detail. The paper also presents information about light-sensitive proteins, genetically encoded optical instruments and their use for activation or inhibition of neurons, and the research into the cause-and-effect relationship between neural networks and pathological symptoms.
Key words: optogenetics, opsins, сhannelrhodopsin-2 (ChR2), halorhodopsin (NpHR), archeorhodopsin-3 (Arch), virus vectors, Cre recombinases, loss of motor function, Parkinson s disease, epilepsy.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-128-132
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 579.842.11:579.22]:615.272.2.012.6
Карягина А.С.1-3, Бокша И.С.1, Грунина Т.М.1, Демиденко А.В.1, Попонова М.С.1, Сергиенко О.В.1'3, Лящук А.М.1, Галушкина З.М.1, Соболева Л.А.1, Осидак Е.О.1'4, Семихин А.С.1, Громов А.В.1, Лунин В.Г.1'3
оптимизация ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВНОЙ ФОРМЫ rhBMp-2 В ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ СИСТЕМЕ ЭКСПРЕССИИ С ПОМОЩьЮ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ
'ФГБУ «ФНИЦ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва, Россия; 2НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского ФГБОУ «МГУ им. М.В. Ломоносова», 119991, Москва, Россия; 3ФГБНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии, 127550, Москва, Россия; 4ООО фирмы «Имтек», 121552, Москва, Россия
Рекомбинантный костный морфогенетический белок-2 (Bone Morphogenetic Protein-2 (rhBMP-2)) обладает выраженными остеоиндуктивными свойствами, что подтверждается результатами экспериментальной и клинической практики. Это относится как к белку, получаемому в клетках эукариот, так и к белку, синтезируемому в клетках бактерий. В эукариотических системах экспрессии выход белка крайне мал, и, как следствие, стоимость препаратов на его основе очень высока. Поэтому актуальной задачей является оптимизация гетерологичных систем экспрессии rhBMP-2. В настоящей работе проведена оптимизация кодонного состава нуклеотидной последовательности и вторичной структуры транскрипта гена rhBMP-2 и подобран штамм, обеспечивающий эффективную экспрессию гена. Полученный продуцент на основе Escherichia coli B1-21(DE3) обеспечивает высокий уровень синтеза rhBMP-2 (около 57% от суммарного белка клетки). Биологическую активность выделенных из полученного продуцента препаратов димерной формы rhBMP-2 определяли по индукции активности щелочной фосфатазы клетками С2С12. Она не уступает активности коммерческого препарата rhBMP-2 (R&D Systems, США), синтезированного в клетках E. coli. Очищенные препараты rhBMP-2 не содержат примесей эндотоксина E. coli и могут применяться в экспериментах по исследованию процессов остеоиндукции на лабораторных животных.
Ключевые слова: костный морфогенетический белок-2 (Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2); rhBMP-2; гетерологич-ная система экспрессии; кодонный состав, активная форма, димер.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-132-137 Введение
Костный морфогенетический белок-2 (Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2)) относится к суперсемейству белков трансформирующего фактора роста бета, которые играют важную роль в процессах регенерации костной ткани и в эмбриональном развитии [1]. В тканях млекопитающих BMP-2 синтезируется в виде гликозилированного белка-предшественника, состоящего из 396 а.о., который протеолитически гидро-лизуется и димеризуется, что приводит к образованию зрелой формы гомодимерного BMP-2, состоящей из двух субъединиц по 114 а.о. каждая. Подобно другим членам суперсемейства TGFP мономер BMP-2 включает 6 цистеиновых остатков, которые формируют 3 внутримолекулярные дисульфидные связи и один остаток
цистеина, формирующий межсубъединичную дисуль-фидную связь [2].
Благодаря выраженным остеоиндуктивным свойствам рекомбинантного человеческого BMP-2 (rhMP-2), получаемого в эукариотических системах экспрессии, материалы, содержащие rhBMP-2, успешно применяются в реконструктивной хирургии для заживления и замещения дефектов костной ткани. Однако продукция rhBMP-2 в эукариотических клетках очень низка, что приводит к крайне высокой стоимости содержащих его материалов. Поэтому представляет интерес разработка способов получения заведомо более дешевых высокоактивных препаратов rhBMP-2 с помощью микробиологического синтеза. rhBMP-2, получаемый синтезом в клетках Escherichia coli, не гликозилируется, имеет меньшую растворимость и склонен к образованию агрегатов. Тем не менее имеются многочисленные исследования in vitro и на лабораторных животных, свидетельствующие о том, что остеогенная активность синтезированного в E. coli rhBMP-2 не уступает активности белка, полученного в клетках эукариот [3—б]. Более того, имеются примеры успешного применения препаратов, содержащих rhBMP-2 микробиологического производства, в хирургической практике [7—10], а также в стоматологии [10—12]. Перспективность использования препаратов rhBMP-2 для целей практической медицины определяет актуальность получения более эффективных микробиологических продуцентов rhBMP-2 с помощью микробиологических и молекулярно-генетических подходов.
В работе получена генно-инженерная конструкция, обеспечивающая высокую степень продукции белка rhB-MP-2 в клетках E. coli за счет подбора штамма-продуцента и оптимизации кодонного состава синтетического гена, кодирующего рекомбинантный фактор. Активность ди-мерной формы препарата rhBMP-2 по индукции синтеза щелочной фосфатазы клетками линии C2C12 не уступает активности коммерческого препарата rhBMP-2 (R&D Systems, США), наработанного в клетках E. coli.
Mатериал и методы
В работе использовали бактериальные штаммы E. coli M15 [pREP4] (F-, Ф80ДlacM15, thi, lac-, mtl-, recA+, KmR) (Qiagen, США); E. coliBL21(DE3) (E. coliB F- dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal X(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5] [malB+]K-12(XS)) (Agilent Technologies, США); ClearColi® BL21(DE3) E. coli strain (msbA148, ДgutQ, AkdsD, ДlpxL, Д^хЫ, ДpagP, ДфхЕ5, ДeptA) (Lucigen, Франция) и плазмидные векторы pQE6 (Qiagen, США) и pET30a+ (Novagen, США).
Оптимизацию кодонного состава нуклеотидной последовательности гена rhBMP-2 проводили с помощью программы JCat (http:// www.jcat.de/), корректировку вторичной структуры транскрибируемой РНК — с помощью DINAMelt Web сервера (http://mfold.rna.al-bany.edu/?q = DINAMelt/Two-state-folding). Синтез гена проводила фирма «Евроген» (Mосква, Россия).
Выделение плазмидной ДНК, гидролиз ДНК, лигирование, электрофорез в агарозном геле и другие стандартные процедуры выполняли согласно общепринятым методам [13].
Культуры клеток E. coli выращивали в колбах на жидкой среде LB с добавлением соответствующих антибиотиков при 37 °C на качалке при 180 об/мин до ОПб00 1—1,2. Индукцию проводили 0,5 мM раствором изопропилтиогалактопиранозида (ИПТГ), далее культуры выращивали еще 4 ч в тех же условиях. Культуры центрифугировали при 10 000 об/мин в течение 30 мин при 10°C. Полученный осадок ресуспендировали в буфере, содержащем 0,1 M Трис-HCl, pH 8,0, 10 мM этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), pH 8,0, 0,1 мM фенилметана сульфонилфторида (PMSF), 2% Тритон X-100, после чего центрифугировали еще раз. Ресуспендирование с последующим центрифугированием проводили трижды с целью удаления липополисахаридов (LPS) E. coli.
Клетки обоих штаммов-продуцентов синтезируют целевой
Ncol BamHI
ссАте GGA ТСС CAG GCT AAA CAC AAA CAG CGT AM CGC CTG AM TCT TCT TGC AM
SEI CAG GCT AAA CAC AAA CAG CGC AM CGC CTT MG AGC AGC TGC AM
M G S Q A К H К Q R К R L К S S С К
65 74 83 92 101 110
CGT CAC CCG CTG TAC GTA GAC TTC TCT GAC GTT GGT TGG MC GAC TGG АТС GTT
CGC CAC CCG CTG TAC GTA GAC TTC AGC GAC GTT GGT TGG Mс GAC TGG АТС GTT
R H P L Y V D F S D V G W N D W I V
119 128 137 146 155 164
GCT CCG CCG GGT TAC CAC GCT TTC TAC TGC CAC GGC GM TGC CCG TTC CCG CTG
GCT CCG CCG GGT TAC CAC GCT TTC TAC TGC CAC GGT GM TGC CCG TTC CCG CTG
A P P G Y H A F Y С H G E С P F P L
173 182 191 200 209 218
GCT GAC CAC CTG MC TCT ACC MC CAC GCG АТС GTT CAG ACC CTG GTA MC TCT
GCT GAC CAC CTG AAC AGC ACC MC CAC GCT АТС GTG CAG ACC CTG GTT MC AGC
A D H L N S T N H A I V Q T L V N S
227 236 245 254 263 272
GTT AAC TCT AAA АТС CCG AAA GCT TGC TGC GTT CCG ACC GM CTG TCT GCT АТС
GTA AAC AGC AAA АТС CCG AAA GCA TGC TGC GTT CCG ACC GAG CTG AGC GCA АТС
V N S К I P К A С С V P T E L S A I
281 290 299 308 317 326
AGC ATG CTG TAC CTG GAC GAA MC GM AM GTT GTT CTG AM MC TAC CAG GAC
TCT ATG CTG TAC CTG GAC GAA MC GM AM GTT GTT CTG AM MC TAC CAG GAC
S M L Y L D E N E К V V L К N Y Q D
335 344 353 362
BglII Kpn2I
ATG GTT GTT GAA GGT TGC GGT TGC AGA TCT ÏA8 ТСС GGA 3'
ATG GTT GTT GAA GGT TGC GGT TGC CGC TÄA A
M V V E G С G С R S *
Рис. 1. Нуклеотидные последовательности генов rhBMP-2.
В верхней строчке показана последовательность гена из настоящей работы, во второй строчке — последовательность синтетического гена из статьи Ihm с соавт. [15], запись GenBank EF446372. В нижней строчке — трансляция мРНК из настоящей работы. Серым фоном выделены ини-циаторные и терминирующие кодоны. Полужирным шрифтом отмечены отличающиеся во второй последовательности нуклеотидные остатки.
белок rhBMP2 в мономерной форме в составе телец включений, которые выделяли согласно стандартной процедуре, описанной ранее [14]. Выделение и очистку rhBMP-2, содержащего преимущественно димерную форму, проводили согласно методу, предложенному в работе [14], за исключением того, что рефолдинг белка после растворения телец включений в 8 М мочевине со 100 мМ дитиотреитолом (ДТТ) проводили последовательным диализом против 4 М мочевины и 0,5 М L-аргинина, pH 8,8, а затем против 8 М мочевины в Трис-HCl, pH 8,5 вместо диализа против буфера сложного состава, содержащего N-циклогексил аминоэтансульфоновую кислоту (CHES).
Оценку содержания (доли) целевого белка (димерных и мономерных форм) на различных стадиях очистки и молекулярной массы димерных и мономерных форм проводили с помощью программ Gel-Pro Analyzer 3.1 («Media Cybernetics», США), при этом погрешность определения значения молекулярной массы не превышала 0,5 кДа.
Поликлональные антитела к rhBMP-2 (иммуноглобулиновую фракцию иммунных сывороток) получали после иммунизации кроликов по схеме: первая иммунизация — 150 мкг очищенного белка с полным адъювантом Фрейнда и две реиммунизации по 100 мкг белка с неполным адъювантом Фрейнда. Титры сывороток тестировали твердофазным ИФА. Иммуноблоттинг проводили согласно стандартному протоколу Amersham GE Healthcare с использованием мембран PVDV Hybond для переноса белков. Белковые экстракты клеток готовились в буфере для образца электрофореза по Лэммли с восстановителем (2 мМ ЭДТА, 125 мМ Трис-HCl, pH 6,8, 20% глицерин, 4% додецилсульфат Na, 0,015% бромфенолового синего, 0,2 М ДТТ). При выявлении димерных форм BMP-2, выделенных и очищенных из биомасс клеток продуцентов, эти пробы белков готовились в буфере для образца э/ф по Лэммли без ДТТ. Окраска нитроцеллюлозы производилась специфическими кроличьими антисыворотками (1:1000), а затем — конъюгатом с пероксидазой иммуноглобулинов козы против иммуноглобулинов кролика (1:1000, P-GAR Iss 1.0 ml #71214 ИМТЕК, Россия).
Определение активности rhBMP-2 in vitro проводили по измерению активности щелочной фосфатазы, синтезируемой миобластами линии C2C12 после добавления фактора, по ранее описанной методике [3].
Рис. 2. Картина, полученная после электрофореза в 12% ПААГ белковых экстрактов клеток различных штаммов E. coli (a) и фракций с мономерной и димерной формами rhBMP-2 при хроматографии на колонке с гепарин-сефарозой (б). а) 1, 2 — E. coli M-15[pREP4, pR1149] (до и после индукции); 3, 4 — ClearColi BL21(DE3) [pET1149] (до и после индукции); 5, 6 — E. coli BL21(DE3) [pET1149] (до и после индукции); 7 — маркеры молекулярной массы: 14,4; 20; 27; 30; 50; 85 кДа. б) 1 — образец, нагружаемый на колонку, 2 — маркеры молекулярной массы: 14,4; 25; 27; 40; 50; 85 кДа, 3—8 — фракции, элюированные с колонки градиентом концентрации NaCl.
Определение наличия в пробах белка эндотоксина E. coli проводили с помощью Limulus Amebocyte Pysate (PAP) теста (Pyrosate, США).
Результаты и обсуждение Возможность гетерологичной экспрессии гена rhBMP-2 в клетках E. coli была продемонстрирована ранее [3—6]. При этом во всех перечисленных работах для получения экспрессирующих генно-инженерных конструкций использовали нативную последовательность гена bmp-2, амплифицированную с помощью ПЦР. Уровень экспрессии при этом не превышал 25% от суммарного белка клетки [3], и белок синтезировался в виде нерастворимых телец включения. Повышение уровня экспрессии может быть достигнуто как с помощью микробиологического (перебор штаммов), так и молекулярно-генетического (оптимизация кодонного состава) подходов. В настоящей работе были использованы оба подхода.
Оптимизация нуклеотидной последовательности гена rhBMP-2
Нуклеотидная последовательность гена BMP-2 была оптимизирована за счет вырожденных позиций нуклео-тидных остатков таким образом, чтобы в ней по возможности присутствовали наиболее часто встречающиеся в E. coli K12 кодоны. Одновременно с этим проводилась корректировка вторичной структуры транскрибируемой мРНК с целью предупреждения образования длинных шпилек и более сложных элементов вторичной структуры, которые могут снижать эффективность трансляции. Полученная нуклеотидная последовательность характеризуется величиной CAI (Codon Adaptation Index, Индекс Адаптации Кодонов) 0,88, что существенно превышает CAI исходной последовательности — 0,28. Последовательность была фланкирована сайтами эндонуклеаз рестрикции NcoI и BamHI на 5'-конце гена и сайтами BglII и Kpn2I на З'-конце для целей последующего клонирования (рис. 1).
В литературе описана еще одна оптимизированная нуклеотидная последовательность, использованная в работе [15] для клонирования гена rhBMP-2 в E. coli. Она характеризуется величиной CAI 0,84 и отличается от последовательности, подобранной в настоящей работе, более чем в 30 позициях нуклеотидных остатков (см. рис. 1).
Получение генно-инженерных конструкций.
Синтетический ген rhBMP-2 встраивали в плазмиду pQE6 по NcoI и Kpn2I сайтам под контроль индуцибельного промотора фага Т5. Полученной плазмидой pR1149 трансформировали клетки E. coli M15[pRep4]. Субклонирование синтетического гена rhBMP-2 с кодон-ным составом, оптимизированным для экспрессии в E. coli, в вектор pET30m осуществляли гидролизом плазмиды pR1149 рестриктазами NcoI и Kpn2I. Полученный фрагмент, содержащий синтетический ген BMP2, клонировали в вектор pET30m, гидролизованный рестриктазами NcoI и AgeI. Вектор pET30m получали делецией участка 218— 351 п.н. и инсерцией сайта эндонуклеазы рестрикции AgeI в положение 164—165 вектора pET30a(+). Полученной плазмидой pET1149 трансформировали клетки E. coli BL21(DE3) и ClearColi BL21(DE3).
Характеристика экспрессии гена по уровню синтеза целевого белка rhBMP-2 в различных штаммах E. coli
Результаты электрофоретического разделения белковых экстрактов клеток, позволяющие оценить уровень экспрессии гена по уровню синтеза целевого белка rhBMP-2 после индукции ИПТГ в различных штаммах E. coli, показаны на рис. 2, а. В штамме E. coli M-15[pREP4], трансформированном плазмидой pR1149 с синтетическим геном rhBMP-2, продукции белка с молекулярной массой, соответствующей rhBMP-2 (13,4 кДа), не наблюдается (см. рис. 2, дорожки 1—2). В штаммах ClearColi BL21(DE3) (см. рис. 2, дорожки 3—4) и E. coli BL21(DE3) (см. рис. 2, дорожки 5—6) экспрессия гена с оптимизированным кодонным составом приводит к синтезу целевого белка, который составляет соответственно 37,8 и 56,7% от суммарного белка клетки, что в 1,5 и в 2,3 раза больше, чем при экспрессии гена с нативной последовательностью в E. coli BL21(DE3) — 25%, продемонстрированной ранее [3]. При этом следует отметить, что ген с нативной последовательностью экспрессировался также под контролем T7 промотора в E. coli BL21(DE3).
Отсутствие целевого продукта экспрессии в штамме E. coli M-15[pREP4] после индукции синтеза ИПТГ, видимо, связано с тем, что белок rhBMP-2 при гетеро-логичной экспрессии в клетках бактерий синтезируется в малорастворимой форме, далекой от нативной структуры белка, и агрегирует. Неправильно свернутые или агрегированные (аберрантные) белки подвергаются протеолизу бактериальной Lon-протеазой [16, 17]. В отличие от E. coli M-15 штамм E. coli BL21(DE3), относящийся к штаммам E. coli B, и его производное, ClearColi BL21(DE3), не содержат Lon-протеазу и несут мутацию в гене мембранной протеазы E. coli OmpT, что также
Рис. 3. Зависимость активности щелочной фосфатазы (ед. активности/мл) в клетках линии C2C12 от концентрации добавленного rhBMP-2 (мкг/мл): димерная форма rhBMP-2, выделенная в настоящей работе (а), и фирменный препарат rhBMP-2 (R&D Systems, США) (б).
Коэффициенты детерминации (R2) равны 0,9612 (а) и 0,9645 (б) (p < 0,0001).
снижает деградацию экспрессируемых эукариотиче-ских белков.
Таким образом, оптимизация нуклеотидной последовательности гена, кодирующего эукариотический белок BMP-2, для экспрессии в E. coli, а также подбор штамма, в котором не происходит деградации синтезируемого белкового продукта, приводят к существенному (в 2,3 раза) повышению уровня экспрессии гена rhBMP-2 по сравнению с экспрессией гена с нативной последовательностью. Синтетическая последовательность с оптимизированным кодонным составом была использована также при гетерологичной экспрессии гена rhBMP-2 в работе Ihm и др. [15]. Продукция BMP-2 в этой работе составляла порядка 15—20% от суммарного белка клетки. Однако корректное сравнение уровней экспрессии генов, полученных в нашей работе и работе [15], не представляется возможным, поскольку в работе [15] был реализован другой вариант гетерологичной экспрессии — получение белка в растворимой форме в присутствии тиоредоксина в штамме E. coli Rosetta-gami B(DE3), хотя для растворимого белка такой уровень продукции является достаточно высоким.
Получение очищенного rhBMP-2 в димерной форме
В клетках E. coli BL21(D3) [pET1149] и ClearColi BL21(DE3) [pET1149] рекомбинантный белок rhBMP-2 синтезируется в мономерной форме и откладывается в тельцах включения. Поскольку биологическую активность проявляют лишь димерные формы rhBMP-2, в настоящей работе стояла задача получения препарата, содержащего исключительно димеры rhBMP-2. На первой стадии получения димеров rhBMP-2 дисульфидные связи в белке полностью восстанавливали, инкубируя раствор телец включения с 100 мМ ДТТ, а затем раствор белка освобождали от восстановителя путем диализа. С целью отделения образовавшихся димерных форм от мономеров применяли колоночную хроматографию на гепарин-сефарозе, как предложили авторы работы [14]. При элю-ировании градиентом концентрации NaCl от 0 до 1 М с колонки элюировались сначала фракции, содержащие мономерные формы rhBMP-2, а затем его димерные формы (см. рис. 2, б). Выход целевого белка (димерной формы) составил приблизительно 9 мг из 1 г влажной биомассы клеток E. coli BL21(D3) [pET1149] и 6 мг из 1 г клеток ClearColi BL21(DE3) [pEt1149]. Фракции, содержащие димерные формы, для предотвращения дальнейшего дисульфидного обмена переводили в 25 мМ буферный раствор ацетата аммония, pH 4,5, путем постепенного,
длительного диализа. Молекулярная масса очищенной димерной формы составляет около 26 кДа. Димерные формы rhBMP-2, выделенные из двух штаммов-продуцентов, были идентичны по свойствам. В других исследованиях, посвященных выделению димерной формы rhBMP-2, полученного гетерологичной экспрессией в E. coli, выход целевого продукта составлял от 0,2 мг [18] до 30 мг [19] из 1 г сырой биомассы. В работе [19] проводили оптимизацию условий ре-фолдинга rhBMP-2, однако попытка воспроизвести подобранные условия в настоящей работе не привела к успеху (данные не приводятся). Выход, полученный в настоящей работе (9 мг/г), примерно соответствует выходу, полученному в работе [18] — 10 мг/г, в которой была использована примерно та же схема получения димерной формы, однако для рефолдинга в работе [14] применялся буфер с высокой концентрацией крайне дорогостоящего компонента CHES. Следует также отметить, что в цитируемой работе ген rhBMP-2 имел нативную последовательность, при этом повышенная продукция белка достигалась за счет биотехнологического подхода — выращивания продуцента в биореакторе и получения культуры с высокой плотностью клеток.
С целью иммунодетекции целевого белка в белковых экстрактах штаммов продуцентов с помощью иммунозон-дов и проверки сохранности иммунореактивных эпито-пов в ходе выделения и очистки димерных форм rhBMP-2 проводили эксперименты по иммуноблоттингу, в которых использовали кроличью антисыворотку к рекомбинант-ному белку, выделенному и очищенному в настоящей работе из штамма-продуцента на основе E. coli BL21(DE3). Антисыворотка окрашивала димерные формы rhBMP-2, выделенные из обоих продуцентов (ClearColi и E. coli BL21(DE3)), а также выявляла в полученном микробиологическим синтезом фирменном препарате rhBMP-2 (R&D, США) зону белка, соответствующую заявленной фирмой молекулярной массе димера BMP-2 (26 кДа). В белковых экстрактах клеток штаммов-продуцентов (после индукции ИПТГ) антисыворотка выявляла мономеры rhBMP-2 (при обработке восстановителем димерные формы, если они и присутствовали, распадались до мономеров вследствие восстановления дисульфидных связей). Антисыворотку можно считать моноспецифической, т. к. она выявляла единственную зону целевого белка в белковых экстрактах клеток штаммов-продуцентов.
Определение активности rhBMP-2 в клеточном тесте in vitro
Для определения биологической активности rhBMP-2 использовали препараты, содержащие димерную форму белка. При внесении rhBMP-2 в среду культивирования миобластов линии C2C12 происходила индукция синтеза щелочной фосфатазы, при этом повышение ее активности зависело от количества внесенного rhBMP-2 (p < 0,0004). Активность полученного rhBMP-2 не уступала полученному микробиологическим синтезом препарату rhBMP-2 фирмы R&D Systems, США (рис. 3).
Существенной характеристикой препаратов, получаемых микробиологическим синтезом, которые планируется использовать для введения в организм лабораторных животных, а в перспективе - и в клинической практике, является содержание эндотоксина E. coli, вы-
зывающего пирогенный эффект. Содержание эндотоксина в пробах белка, выделенных из обоих продуцентов, определенное с помощью LAL-теста, составляло менее 10 EU на 1 мкг белка. При этом следует отметить важность использованной в работе стадии трехкратной предварительной отмывки биомассы перед выделением целевого белка (см. Материал и методы), поскольку исключение этой стадии в случае продуцента на основе E. coli BL-21(DE3) приводило к содержанию эндотоксина в пробах белка более 100 EU на 1 мкг. В других работах, в частности, в работах [3, 14], содержание эндотоксина не определяли.
Заключение Таким образом, с помощью оптимизации кодонного состава нуклеотидной последовательности и вторичной структуры транскрипта гена rhBMP-2, а также подбора штамма, обеспечивающего эффективную экспрессию гена, получен штамм-продуцент с высокой продукцией белка rhBMP-2. Показана биологическая активность препаратов димерной формы в in vitro тесте по индукции синтеза щелочной фосфатазы при добавлении rhBMP-2 в культуральную среду миобластов линии C2C12. Активность белка не уступает активности коммерческого препарата rhBMP-2 (R&D Systems, США), наработанного в клетках E. coli.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (грант № 16-15-00133).
ЛИТЕРАТУРА
1. Зайцев В.В., Карягина А.С., Лунин В.Г. Костные морфогене-тические белки (BMP): общая характеристика, перспективы клинического применения в травматологии и ортопедии. Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. 2009; 4: 79—84.
2. Scheuxer C., Sebald W., Hulsmeyer. M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 A resolution. J. Mol. Biol. 1999; 287: 103—15. doi:10.1006/jmbi.1999.2590
3. Шарапова Н.Е., Котнова А.П., Галушкина З.М., Лаврова Н.В., Полетаева Н.Н., Тухватулин А.Э. и др. Получение рекомбинант-ного костного морфогенетического белка 2 человека в клетках Escherichia coli и тестирование его биологической активности in vitro и in vivo. Мол. биол. 2010; 44(6): 1036—44.
4. Yano K., Hoshino M., Ohta Y., Manaka Т., Naka Y., Imai Y. et al. Osteoinductive capacity and heat stability of recombinant human bone morphogenetic protein-2 produced by Escherichia coli and di-merized by biochemical processing. J. Bone Miner. Metab. 2009; 27: 355—63. doi: 10.1007/s00774-009-0040-3
5. Bessho K., Konishi Y., Kaihara S., Fujimura K., Okubo Y., Iizuka Т. Bone induction by Escherichia coli-derived recombinant human bone morphogenetic protein-2 compared with Chinese hamster ovary cell-derived recombinant human bone morphogenetic protein-2. Br. J. Oral. Maxillofac. Surg. 2000; 38: 645—9. doi: http://dx.doi. org/10.1054/bjom.2000.0533
6. Kim I.S., Lee E.N., Cho Т.Н., Song Y.M., Hwang S.J., Oh J.H. et al. Promising efficacy of Escherichia coli recombinant human bone morphogenetic protein-2 in collagen sponge for ectopic and ortho-topic bone formation and comparison with mammalian cell recombinant human bone morphogenetic protein-2. Tissue. Eng. Part A. 2011; 17(3—4):337—48. doi: 10.1089/ten.TEA.2010.0408
7. Гинцбург А.Л., Карягина А.С., Лунин В.Г., Семихин А.С. Разработка препаратов нового поколения для эффективной регенерации костной ткани. Лечение и профилактика. 2011; 1: 78—81.
8. Гинцбург А.Л., Шарапова Н.Е., Надеждин С.В., Федорова М.З., Карягина А.С., Лунин В.Г. Новые препараты, стимулирующие регенерацию костной ткани. Современные медицинские технологии. 2011; 7: 60—2.
9. Донченко С.В., Карягина А.С., Алексеев Д.В., Лунин В.Г. Первый опыт применения остеопластических материалов нового поколения, содержащих рекомбинантные человеческие костные морфогенетические белки (rhBMPs), при дефектах и посттравматической патологии костной ткани. Московский медицинский журнал. 2012; 4: 16—21.
10. Бартов М.С., Карягина А.С., Громов А.В., Мишина Д.М., Трунова Г.В., Сидорова Е.И. и др. Остеопластические препараты нового поколения «Гамалант», содержащие факторы роста и реге-
нерации костной ткани. Кафедра травматологии и ортопедии. 2012; 2: 21—5.
11. Магамедханов Ю.М., Буравцова Е.А., Гришкова Н.О., Ромашко Н.А., Захаров П.А., Кащенко П.В. и др. Оптимизация предымплан-тологической подготовки альвеолярной лунки удаленного зуба с помощью отечественного материала «Gamalant™-паста-ФОРТЕ Плюс». Российский стоматологический журнал. 2012; 6: 14—5.
12. Олесова В.Н., Кононенко В.И., Берсанов Р.У., Кащенко П.В., Ни-кончук Е.Е., Чуянова Е.Ю. Предимплантологическая подготовка альвеолярной лунки удаленного зуба с использованием отечественного материала Gamalant™-паста-ФОРТЕ Плюс. Фарма-тека. 2013; 2(13): 28—30.
13. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis Т. Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor laboratory Press; 1989.
14. Vallejo P.F., Brokelmann M., Marten S., Trappe S., Cabrera-Crespo J., Hoffmann A. et al. Renaturation and purification of bone mor-phogenetic protein-2 produced as inclusion bodies in high-cell-density cultures of recombinant Escherichia coli. J. Biotech. 2002; 94: 185—94. doi:10.1016/S0168-1656(01)00425-4
15. Ihm H.J., Yang S.J., Huh J.W., Choi S.Y., Cho S.W. Soluble expression and purification of synthetic human bone morphogenetic protein-2 in Escherichia coli. BMB Rep. 2008; 41(5): 404—7. PMD: 18510873
16. Shineberg B., Zipser D. The lon gene and degradation of beta-galac-tosidase nonsense fragments. J. Bacteriol. 1973; 116(3): 1469—71. PMCID: PMC246507
17. Fredriksson A., Ballesteros M., Dukan S., Nyström Т. Defense against protein carbonylation by DnaK/DnaJ and proteases of the heat shock regulon. J. Bacteriol. 2005; 187(12): 4207—13. doi: 10.1128/JB.187.12.4207-4213.2005
18. Ruppert R., Hoffmann E., Sebald W. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. Eur. J. Biochem. 1996; 237: 295—302. doi: 10.1111/ j.1432-1033.1996.0295n.x
19. Pong S., Truong P., Bennett K., Phillips A., Wong-Staal F., Ma H. Expression, purification, and renaturation of bone morphogenetic protein-2 from Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 2006; 46(2): 374—8. doi:10.1016/j.pep.2005.09.025
REFERENCES
1. Zaytsev V. V., Karyagina A.S., Punin V.G. Bone morphogenetic proteins (BMPs): general characteristics, prospects of clinical application in traumatology and orthopedics. 2009; 4: 79—84. (in Russian)
2. Scheukher C., Sebald W., Hulsmeyer. M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 A resolution. J. Mol. Biol. 1999; 287: 103—15. doi:10.1006/jmbi.1999.2590
3. Sharapova N.E., Kotnova A.P., Galushkina Z.M., Pavrova N.V., Poletaeva N.N., Tukhvatulin A.E. et al. Production of the recombinant human bone morphogenetic protein-2 in Escherichia coli and testing of its biological activity in vitro and in vivo. Mol. biol. 2010; 44(6): 1036—44. (in Russian)
4. Yano K., Hoshino M., Ohta Y., Manaka Т., Naka Y., Imai Y. et al. osteoinductive capacity and heat stability of recombinant human bone morphogenetic protein-2 produced by Escherichia coli and dimerized by biochemical processing. J. Bone Miner. Metab. 2009; 27: 355—63. doi: 10.1007/s00774-009-0040-3
5. Bessho K., Konishi Y., Kaihara S., Fujimura K., Okubo Y., Iizuka T. Bone induction by Escherichia coli-derived recombinant human bone morphogenetic protein-2 compared with Chinese hamster ovary cell-derived recombinant human bone morphogenetic protein-2. Br. J. Oral. Maxillofac. Surg. 2000; 38: 645—9. doi: http://dx.doi. org/10.1054/bjom.2000.0533
6. Kim I.S., Pee E.N., Cho T.H., Song Y.M., Hwang S.J., Oh J.H. et al. Promising efficacy of Escherichia coli recombinant human bone morphogenetic protein-2 in collagen sponge for ecto-pic and orthotopic bone formation and comparison with mammalian cell recombinant human bone morphogenetic protein-2. Tissue. Eng. Part A. 2011; 17(3—4):337—48. doi: 10.1089/ten. TEA.2010.0408
7. Gintsburg A.P., Karyagina A.S., Punin V.G., Semikhin A.S. Development of new generation materials for effective bone regeneration. Lechenie i profilaktika. 2011; 1: 78—81. (in Russian)
8. Gintsburg A.P., Sharapova N.E., Nadezhdin S.V., Fedorova M.Z., Karyagina A.S., Punin V.G. New materials that stimulate bone tissue regeneration. Sovremennye meditsinskie tekhnologii. 2011; 7: 60—2. (in Russian)
9. Donchenko S.V., Karyagina A.S., Alekseev D.V., Punin V.G. The first experience of usage of osteoplastic materials of new generation, containing recombinant human bone morphogenetic proteins (rhBMPs), for treatment of defects and post-traumatic pathology of bone tissue. Moskovskiy meditsinskiy zhurnal. 2012; 4: 16—21. (in Russian)
10. Bartov M.S., Karyagina A.S., Gromov A.V., Mishina D.M., Truno-va G.V., Sidorova E.I. et al. New generation osteoplastic materials «Gamalant» containing protein factors of bone tissue growth and regeneration. Kafedra travmatologii i ortopedii. 2012; 2: 21—5. (in Russian)
11. Magamedkhanov Yu.M., Buravtsova E.A., Grishkova N.O., Romashko N.A., Zakharov P.A., Kashchenko P.V. et al. Optimization of before implantation preparation of the alveolar holes remote tooth with the help of Russian material «GamalantTM-paste-FORTE Plus». Rossiyskiy stomatologicheskiy zhurnal. 2012; 6: 14—5. (in Russian)
12. Olesova V.N., Kononenko V.I., Bersanov R.U., Kashchenko P.V., Nikonchuk E.E., Chuyanova E.Yu. Before implantation preparation of the alveolar holes remote tooth with the help of domestic material «GamalantTM-paste-FORTE Plus». Farmateka. 2013; 2(13): 28—30. (in Russian)
13. Sambrook J., Fritch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
14. Vallejo L.F., Brokelmann M., Marten S., Trappe S., Cabrera-Crespo J., Hoffmann A. et al. Renaturation and purification of bone morphogenetic protein-2 produced as inclusion bodies in high-cell-density cultures of recombinant Escherichia coli. J. Biotech. 2002; 94: 185—94. doi:10.1016/S0168-1656(01)00425-4
15. Ihm H.J., Yang S.J., Huh J.W., Choi S.Y., Cho S.W. Soluble expression and purification of synthetic human bone morphogenetic protein-2 in Escherichia coli. BMB Rep. 2008; 41(5): 404—7. PMID: 18510873
16. Shineberg B., Zipser D. The lon gene and degradation of beta-galactosidase nonsense fragments. J. Bacteriol. 1973; 116(3): 1469—71. PMCID: PMC246507
17. Fredriksson A., Ballesteros M., Dukan S., Nyström T. Defense against protein carbonylation by DnaK/DnaJ and proteases of the heat shock regulon. J. Bacteriol. 2005; 187(12): 4207—13. doi: 10.1128/JB.187.12.4207-4213.2005
18. Ruppert R., Hoffmann E., Sebald W. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. Eur. J. Biochem. 1996; 237: 295—302. doi: 10.1111/j.1432-1033.1996.0295n.x
19. Long S., Truong L., Bennett K., Phillips A., Wong-Staal F., Ma H. Expression, purification, and renaturation of bone morphogenetic protein-2 from Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 2006; 46(2): 374—8. doi:10.1016/j.pep.2005.09.025
Поступила 13.05.16
A.S. Karyagina12-3,1.S. Boksha1, T.M. Grunina1, A.V. Demidenko1, M.S.
Poponova1, O.V. Sergienko1-3, A.M. Lyaschuk1, Z.M. Galushkina1, LA.
Soboleva1, E.O. Osidak4, AS. Semikhin, A.V. Gromov1, V.G. Lunin1,3
OPTIMIZATION OF RHBMP-2 ACTIVE FORM PRODUCTION IN A HETEROLOGOUS EXPRESSION SYSTEM USING MICROBIOLOGICAL AND MOLECULAR GENETIC APPROACHES
1N.F. Gamaleya Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow;
2A.N.Belozersky Research Institute of Physico-Chemical Biology, M.V. Lomonosov MSU, 119991, Moscow; 3All-Russia Research Institute of Agricultural Biotechnology, 127550, Moscow; 4Imtek, 121552, Moscow, Russia
Recombinant bone morphogenetic protein-2 (Bone Morphogenetic Protein-2 (rhBMP-2)) has pronounced osteoinductive properties, as evidenced by the results of experimental and clinical practices. This applies both to the protein produced in eukaryotic cells and to the protein synthesized in bacterial cells. In eukaryotic expression system, production of the protein is extremely low and, consequently, the cost of materials based on it is very high. Therefore, optimization of heterologous expression systems for rhBMP-2 production represents an important task. In the present work optimization of codon composition of the rhBMP-2 gene nucleotide sequence and secondary structure of the transcript, as well as the strain selection for efficient gene expression were performed. The producing strain based on Escherichia coli BL-21(DE3) provides the high level of rhBMP-2 synthesis (about 57% of total cell proteins). Biological activity of rhBMP-2 dimeric forms purified from the obtained producing strain was measured by induction of alkaline phosphatase activity in C2C12 cells. It is comparable with that of commercial rhBMP-2 expressed in E. coli (R&D Systems, USA). Purified rhBMP-2 does not contain impurities of E. coli endotoxin and can be used in experimental studies of osteoinduction in laboratory animals. Keywords: Bone morphogenetic protein-2 (Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2); rhBMP-2; heterologous expression system; codon composition, the active form, dimer.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-132-137
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 616.821-005.4-085.214.3:577.21.084
Ставчанский В.В.1, Куриченкова Е.О.1, Дмитриева В.Г.1, Мясоедов Н.Ф.1, Лимборская С.А.1,2, Дергунова Л.В.12
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА CPLX2 В УСЛОВИЯХ ИШЕМИИ МОЭГА КРЫС ПРИ ВВЕДЕНИИ ПЕПТИДОВ СЕМАКС И PGP С ИСПОЛьзОВАНИЕМ
двух экспериментальных моделей
'ФГБУН «Институт молекулярной генетики» Российской академии наук, 123182, Москва, Россия; ^Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России, 117997, Москва, Россия
Комплексин 2 — цитозольный белок, участвующий в экзоцитозе синаптических везикул. С помощью метода ОТ-ПЦР в реальном времени исследована динамика изменения экспрессии гена Cplx2, кодирующего данный белок, в отделах мозга крыс в течение суток в условиях неполной глобальной ишемии, а также в условиях фокальной ишемии спустя 3; 24 и 72 ч после необратимой окклюзии средней мозговой артерии. Наиболее существенное снижение транскриптов гена Cplx2 в условиях неполной глобальной ишемии обнаружено в гиппокампе и лобной коре крыс спустя 12 и 24 ч после необратимой окклюзии общих сонных артерий соответственно. В условиях другой модели — фокальной ишемии мозга крыс — снижение содержания транскриптов гена Ср1х2 выявлено только в участке лобно-теменной коры, включающей очаг повреждения, спустя 24 ч после окклюзии. Мы также изучили воздействие нейропротекторного препарата семакс и его С-концевого фрагмента Рго-О1у-Рго на экспрессию
гена Cplx2 в условиях данных моделей ишемии. При неполной глобальной ишемии применение семакса компенсировало максимальное снижение экспрессии гена Cplx2 в лобной коре и гип-покампе крыс, вызванное повреждением, однако в условиях фокальной ишемии пептид не оказал эффекта. Воздействие PGP на экспрессию гена Cplx2 в условиях экспериментальной ишемии носит более сложный характер и не всегда совпадает с эффектами семакса. Полученные результаты дают представление об особенностях экспрессии гена Cplx2 в условиях экспериментальной ишемии мозга, а также приближают нас к пониманию механизмов действия пептидных препаратов.
Ключевые слова: комплексин 2, семакс, Pro-Gly-Pro, альтернативные транскрипты, экспериментальная ишемия мозга крыс, нейропротекция.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-137-142
