CC BY
6УДК 632.754:633.11:577.151:577.27
РЕКОМБИНАНТНЫЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ АНТИТЕЛА КАК ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИЗУЧЕНИЯ ГЛЮТЕНИН-ГИДРОЛИЗУЮЩИХ ПРОТЕИНАЗ КЛОПА ВРЕДНАЯ ЧЕРЕПАШКА (EURYGASTERINTEGRICEPS PUT.)
В.В. Долгих, А.А. Царев, И.В. Сендерский, С.А. Тимофеев, А.В. Конарев
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
Хлебные клопы рода Eurygaster Lap. наносят огромный ущерб качеству зерна пшеницы в России и за ее пределами. Протеиназы слюнных желез таких клопов как вредная черепашка, гидролизующие основные белки клейковины пшеницы - глиадины и глютенины, являются важными факторами вредоносности. В предыдущих исследованиях мы осуществили гетерологичную экспрессию глютенин-гидролизующей протеиназы GHP3 клопа вредная черепашка E. integriceps в бактериях E. coli. В данном исследовании была сконструирована библиотека одноцепочечных антител на основе вариабельных фрагментов иммуноглобулинов мышей, иммунизированных выделенной рекомбинантной протеиназой. Использование технологии фагового дисплея позволило отобрать из полученной библиотеки рекомбинантное мини-антитело, распознающее GHP3 в пробах белков слюнных желез клопа. Иммуноблоттинг с использованием полученного scFv-фрагмента подтвердил факт присутствия незначительных количеств зрелой формы фермента в поврежденном зерне. Рассматриваются перспективы использования одноцепочечных рекомбинантных антител для дальнейшего изучения протеиназы вредной черепашки, а также для создания ингибиторов глютенин-гидролизующей активности фермента.
Ключевые слова: вредная черепашка, слюнная железа, поврежденное зерно, клейковина, глютенин, протеиназа, одноцепочечные антитела, фаговый дисплей, ингибиторы, иммунодиагностика.
Хлебные клопы рода Eurygaster Lap. наносят большой ущерб качеству зерна пшеницы в России, Европе и на Ближнем Востоке [Critchley, 1998; Алехин, 2002; Sivri et al., 2002; Vaccino et al., 2006; Павлюшин и др., 2010]. Одним из самых опасных вредителей пшеницы является клоп вредная черепашка Eurygaster integriceps Put. При питании насекомое вводит в эндосперм зерна секрет слюнных желез, содержащий протеиназы и другие пищеварительные ферменты, а затем всасывает частично гидролизован-ные продукты. При этом ферменты, оставшиеся в зерне в следовых количествах, не только негативно влияют на всхожесть семян [Капусткина, Нефедова, 2013], но и нарушают процесс формирования клейковины при замесе теста [Hariri et al., 2000; Гапонов и др., 2009; Каменченко и др., 2010; Torbica et al., 2014]. Основной мишенью проте-иназ хлебных клопов являются главные белки клейковины - глиадины и глютенины.
Среди возможных экологически безопасных подходов к снижению потерь, вызываемых хлебными клопами, можно выделить использование устойчивых сортов [Вил-кова, Конарев, 2010; Крупнов, 2011]. Такая устойчивость может быть основана на особенностях структуры запасных белков зерна [Fatehi et al., 2008; Werteker, Kramreither, 2008] или на внедрении в растение генов белковых ингибиторов протеиназ и других гидролаз [Dunaevsky et al., 2005; Gatehouse, 2011; Jamal et al., 2012]. Поиск и конструирование новых специфичных ингибиторов гидролаз хлебных клопов весьма актуальны, поскольку ферменты их слюнных желез малочувствительны к известным растительным ингибиторам [Konarev et al., 2011]. В медицине конструирование специфичного ингибитора может быть успешно осуществлено, если взять за основу одну их известных форм. Например, циклический ингибитор трипсина из подсолнечника SFTI-1 [Luckett et al., 1999; Konarev et al., 2000] можно химически модифицировать и сделать специфичный ингибитор к протеиназам, активность которых возрастает при различных патологиях [Avrutina et al., 2012; Zoller et al., 2012]. Другой способ создания специ-
фичных ингибиторов - использование антител, специфичных к активному центру фермента [Ganesan et al., 2010].
Для использования в области защиты растений большой интерес представляют рекомбинантные одноцепочечные антитела (scFv-фрагменты), представляющие собой два вариабельных фрагмента легкой и тяжелой цепи иммуноглобулинов, соединенные между собой с помощью гибкого линкера. В отличие от иммуноглобулина, scFv-фраг-мент представляет собой единую полипептидную цепь и его ген может быть встроен в геном растения для блокирования активности чужеродных ферментов. Наряду с созданием устойчивых сортов растений, рекомбинантные одноцепочечные антитела к гидролазам хлебных клопов могут быть использованы и для разработки систем иммунодиагностики поврежденного зерна. К преимуществам использования scFv-молекул относятся их низкая себестоимость наработки в бактериях и возможность внесения самых разнообразных модификаций в последовательность белка для придания новых свойств [Albrecht et al., 2006].
В данном исследовании планировалось сконструировать библиотеку одноцепочечных антител (scFv-фрагмен-тов) на основе вариабельных фрагментов иммуноглобулинов мышей, иммунизированных рекомбинантной формой глютенин-гидролизующей протеиназы rGHP3e клопа вредная черепашка E. integriceps, экспрессированной в бактериях E. coli [Долгих и др., 2014]. Далее, с использованием технологии фагового дисплея мы попытались отобрать из полученной библиотеки рекомбинантное мини-антитело, специфичное против глютенин-гидролизующей протеиназы GHP3, и оценить возможность и перспективы использования одноцепочечных рекомбинантных антител для дальнейшего изучения протеиназы вредной черепашки, а также для создания ингибиторов глюте-нин-гидролизующей активности фермента.
Методика исследований
Создание библиотеки рекомбинантных антител к протеи-назе rGHP3e. Гетерологичную экспрессию протеиназы GHP3 в бактериях E. coli, выделение и солюбилизацию рекомбинантной
протеиназы проводили по ранее описанной методике [Долгих и др., 2014]. ^шей иммунизировали рекомбинантным белком в ходе 4 внутрибрюшинных инъекций с 10 дневным интервалом, используя полный адъювант Фрейнда при первой инъекции и неполный при последующих. Общую РНК селезенки иммунизированных животных выделяли с использованием реагента Trizol (Thermo Fisher Scientific) согласно инструкции производителя. Синтез кДНК осуществляли в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 2.5 мкг РНК, 10 мM Tрис-a (pH 8.8), 50 мM KCl, 5 мM MgCl2, 1 мM каждого дНTФ, 1 мкг олиго-дT в качестве затравки, 200 ед. RevertAidTMM-MuLV-обратной транскриптазы (Thermo Fisher Scientific) и 5 ед. ингибитора РНКазы в течение часа при 37 °C. После этого смесь прогревали 5 мин при 95 °C и использовали 1.6 мкл смеси для постановки ПЦР. 20 мкл смеси для проведения ПЦР помимо кДНК содержала 67 ^iM Tрис-Cl (pH 8.6), 2.5 мM MgCl2, 16.6 мM (NH4)2SO4, 0.5 мM каждого дШФ, 10 пмоль праймеров и 2.5 ед. Taq ДНК полимеразы (Силекс). Для амплификации всего разнообразия последовательностей вариабельных фрагментов тяжелых (VH) и легких (VL) цепей IgG мыши были использованы 22 сочетания специально подобранных праймеров (Progen). Maтрицу денатурировали 3 мин при 94 °C и ДНК амплифицировали в течении 30 циклов каждый из которых включал денатурацию (94 °C, 30 сек), отжиг (55 °C, 30 сек) и синтез (72 °C, 30 сек). ПЦР-продукты размером около 400 пн выделяли из агарозного геля и использовали в качестве матрицы для проведения второго раунда ПЦР с праймерами, содержащими на 5'-конце сайты рестриктаз для встраивания в вектор pSEX81 (Progen). ПЦР-продукты, кодирующие VH-фрагменты, после электрофореза выделяли из агарозного геля, объединяли и встраивали в вектор по сайтам рестриктаз NcoI и HindIII. Клетки E. coli (штамм XL1-Blue MRF') трансформировали полученными конструкциями с помощью электропорации, высевали на твердую среду SOB, содержащую ампицилин (100 мкг/мл), 0.1 M глюкозу (SOB-ГА) и растили в течение суток при 30 °C. Бактериальные клетки соскребали стеклянным шпателем с чашек и хранили при -80 °C в среде 2хУT с ампицилином (100 мкг/мл) и 0.1 M глюкозой ^YT-rA) в присутствии 25 / глицерина. Плаз-мидная ДНК из приблизительно полумиллиона бактериальных колоний была выделена с помощью метода щелочного лизиса и использована для встраивания последовательностей, кодирующих VL-фрагменты легких цепей иммуноглобулинов по сайтам рестрикцииMluI / Notl. Электропорация клеток XL1-Blue MRF' конструкциями после лигирования позволила получить библиотеку, высеянную на 20 чашек с твердой средой SOB-ГА и также состоящую приблизительно из 500 тысяч колоний-трансформантов. Бактериальные клетки соскребали с чашек стеклянным шпателем и полученную библиотеку хранили при -80 °C в 2хYT-ГA в присутствии 25 / глицерина.
Отбор рекомбинантных scFv-фрагментов к rGHP3e. Полученную библиотеку в виде 50 мл бактериальной суспензии в среде 2хYT-ГA с плотностью 0.025 оптических единиц при длине волны 600 нм (OD600 0.025) доращивали при 37 °C до OD600 0.1 и заражали хелперным гиперфагом M13 K07ДpШ (Progen), добавляя приблизительно 100 фаговых частиц на каждую бактериальную клетку. После инкубации 20 мин при 37 °C без перемешивания и 50 мин при перемешивании на орбитальном шейкере (260 об/мин), среду заменяли на 2хУT с ампицилином (100 мкг/мл) и канамицином (50 мкг/мл). Бактериальную культуру инкубировали на орбитальном шейкере в течение ночи при 37 °C, клетки осаждали центрифугированием и к супернатанту добавляли 1/5 объема 20 / ПЭГ6000 (Serva), содержащего 2.5 M NaCl. После инкубации суспензии на льду в течение часа фаговые частицы осаждали центрифугированием при 14000 g и температуре 4 °C в течение 20 мин, ресуспендировали в 4.5 мл буфера для разведения фаговых частиц (10 мM Tрис-Cl (pH 7.5), 20 мM NaCl, 2 мM ^QTA) и хранили при -80 °C. Для отбора вирусных частиц, несущих антитела к rGHP3e, 0.75 мл (1/6 часть) полученной суспензии фагов разводили 1:5 в Tрис-солевом буферном растворе
(ТСБ, 50 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 150 мМ NaCl), содержащем 1 % БСА, инкубировали 15 мин при комнатной температуре и переносили в пробирки с рекомбинантным белком, иммобилизованным на полосках нитроцеллюлозы. Для иммобилизации антигена рекомбинантный белок rGHP3e, наработанный в бактериях E. coli, разделяли с помощью электрофореза в присутствии доде-цилсульфата Na (ДСН-ПААГЭ) в 12 %% геле, переносили на ни-троцеллюлозную мембрану и окрашивали с помощью красителя Понсо. Мажорную полосу, соответствующую рекомбинантному белку, вырезали, фрагментировали, отмывали буфером ТСБТ (ТСБ, 0.1 %% Твин-20) и блокировали 2 часа в том же буфере в присутствии 1 %% БСА. Далее полоски инкубировали в присутствии суспензии фаговых частиц, переворачивая в течение ночи при 4 °C.
После тщательной отмывки ТСБТ, а затем ТСБ связавшихся фагов элюировали в течение 5 мин в 0.75 мл 0.1 М триэтиламина и элюант быстро нейтрализовали добавлением равного объема 1М Трис-Cl (pH 7.5). Полученную суспензию фагов добавляли к 20 мл культуры клеток E. coli XL1-Blue MRF', дорощенных в 2xYT при 37 °C до OD600 0.4. После инкубации 20 мин при 37 °C без перемешивания и 50 мин при перемешивании на орбитальном шейкере (260 об/мин) инфицированных фагом бактерий высевали на 5 чашек с твердой селективной средой SOB-ГА и колонии трансформантов выращивали при 30 °C. Общее количество колоний, полученных после первого раунда селекции, составило приблизительно 60 тысяч.
Повторное заражение бактериальной суспензии хелперным фагом, наработка и ПЭГ-преципитация фаговых частиц, несущих рекомбинантные антитела, инкубация суспензии в присутствии иммобилизованного антигена и последующая элюция вирусов позволили заразить ими клетки E. coli и осуществить таким образом второй, а затем и третий раунд отбора. После третьего раунда селекции было осуществлено выделение плазмидной ДНК и переклонирование последовательностей, кодирующих рекомбинантные антитела в экспрессирующий вектор p0PE101 (Progen) по сайтам рестрикции NcoI / Notl.
Гетерологичная экспрессия scFv-фрагментов в бактериях E. coli. Полученные конструкции были использованы для трансформации бактерий XL1-Blue MRF' методом электропорации. Выросшие на чашках с селективной средой SOB-ГА при 30 °C колонии-трансформанты переносили в виде реплик на нитроцел-люлозную мембрану и помещали на ту же среду, но без глюкозы и с добавлением 0.4 мМ ИПТГ - специфичного индуктора промотора, контролирующего экспрессию антител. После инкубации колоний на чашках 4 часа при 30 °C мембрану кипятили 5 мин в 0.5 %% ДСН и использовали для Вестерн-блот анализа с антителами к полигистидиновой последовательности (Sigma-Aldrich), входящей в состав рекомбинантных антител. Отдельные колонии, показавшие высокий уровень экспрессии антител, переносили в лунки иммунологических планшетов, доращивали в жидкой среде 2хYT-ГА до OD600 0.4, осаждали клетки центрифугированием и ресуспендировали в той же среде с добавлением 0.04 мМ ИПТГ, но без глюкозы. После экспрессии рекомби-нантных антител в течение 4 часов при комнатной температуре к суспензии добавляли 1 мМ ФМСФ, 1 мМ ЭДТА-Ма2, 1мкг/мл пепстатина А (указаны конечные концентрации), бактерий разрушали ультразвуком, дебрис осаждали центрифугированием планшетов при 2500 об/мин 30 мин и супернатант использовали для тестирования антиген-связывающей активности антител. В каждую лунку помещалась полоска нитроцеллюлозы с иммобилизованной рекомбинантной протеиназой. Поскольку при иммуноблоттинге использовались антитела к полигистидино-вой последовательности, входящей в состав рекомбинантного антитела, для тестирования антител рекомбинантную протеи-назу экспрессировали в векторе pRSETа, в котором полигисти-диновая последовательность была заменена на последовательность FLAG (DYKDDDDK). Данная плазмида была любезно предоставлена сотрудником ВНИИСХМ Долгих Е.А. В качестве
контрольного белка на нитроцеллюлозную мембрану наносили рекомбинантный экстраклеточный домен рецептора HER2 человека, экспрессированный в E. coli в составе того же вектора.
Наработку антител в большем объеме бактериальной культуры (50 мл) осуществляли по методике, использованной для анализа колоний в иммунологических планшетах. Клетки осаждали центрифугированием и разрушали ультразвуком на льду в 5 мл ТСБ с добавлением ФМСФ, пепстатина А и ЭДТА. После разрушения гомогенат центрифугировали 15 мин на холоду при 14 000 g и супернатант в небольших аликвотах хранили при -80 °C.
ДСН-ПААГЭ и иммуноблоттинг. Отпрепарированные слюнные железы вредной черепашки E. intrgriceps выделяли из взрослых клопов, собранных в Краснодарском крае в 2013 и 2015 гг., гомогенизировали в микроцентрифужных пробирках с помощью пластикового пестика в присутствии ТСБ с добавлением ФМСФ, пепстатина А и ЭДТА. Полученный гомогенат центрифугировали 15 мин при 14000 g и супернатант использовали для приготовления проб.
Образцы зерна пшеницы, поврежденного вредной черепашкой, были получены из Саратовской области (сорт Джангаль, 2009 г.) и Турции (сорт Ege-88, 2004 г.). Неповрежденные зерна использовали в качестве контроля. Для приготовления проб белков поврежденного и контрольного зерна пшеницы приблизительно 150 мг муки каждого из вариантов ресуспендировали в 1 мл того же раствора, инкубировали в течение часа при 37 °C, периодически перемешивая, и после осаждения нерастворимого материала центрифугированием при 14000 g 15 мин супернатант использовали для приготовления проб.
Полученные супернатанты смешивали с равным объемом 125 мМ Трис-Cl буфера содержащего 4 % ДСН, 10 % 2-меркапо-этанола, 20 %о глицерина и инкубировали в течение 10 мин при 95 °C. Белки разделяли с помощью ДСН-ПААГЭ в 12 %о геле с использованием камеры Mini-PROTEAN® (Bio-Rad) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану того же производителя с помощью вкладыша для блоттинга Mini-Trans-Blot® согласно
Результаты
Переклонирование последовательностей, отобранных в результате трех раундов селекции, в экспрессирующий вектор позволило наработать рекомбинантные антитела в бактериях в растворимой форме и показать, что часть полученных трансформантов продуцируют антитела, распознающие протеиназу rGHP3e в ходе иммуноблоттин-га. Из 96 проанализированных колоний приблизительно 10 % трансформантов продуцировали антитела, специфично распознающие рекомбинантный белок, иммобилизованный на полосках нитроцеллюлозы. Выделение плазмидной ДНК из пяти положительных колоний-трансформантов, амплификация белок-кодирующих последовательностей с использованием праймеров pSEX Nco for (TGCTGCTGCTGGCAGCTCAG) и pSEX Not rev (TGATATCTTTGGATCCAG) и последующий рестрикци-онный анализ ПЦР-продуктов с помощью частощепящей рестриктазы HaeIII показали, что отобранные положительные трансформанты дают идентичный рисунок рестрикции (рис. 1) и продуцируют один тип антител.
Расшифровка белок-кодирующей последовательности в составе вектора pOPE 101 показала, что в состав рекомбинантного антитела входят VH и VL-фрагменты, состоящие, соответственно, из 130 и 116 аминокислотных остатков (рис. 2). BLAST-анализ аминокислотной последовательности VH выявил 84-85 % идентичности с некоторыми вариантами вариабельных фрагментов иммуноглобулинов мыши (BAC54674.1, BAC54572.1), пред-
инструкции. Мембраны блокировали час в присутствии ТСБТ, 1 % БСА, инкубировали ночь при 4 °C с разбавленными тем же раствором 1:50 рекомбинантными антителами, выделенными из бактерий, и отмывали ТСБТ. Далее мембраны последовательно инкубировали 2 часа при комнатной температуре с монокло-нальными антителами к полигистидиновой последовательности (Sigma-Aldrich), разбавленными ТСБТ 1:2000, а затем с поли-клональными антителами к иммуноглобулинам мыши, конъю-гированными с пероксидазой хрена (Bio-Rad), с промежуточной отмывкой ТСБТ. Обработку мембран поликлональными антителами к rGHP3e осуществляли по методике, описанной ранее [Dolgikh et al., 2011]. После отмывки в ТСБТ, а затем ТСБ мембраны инкубировали в свежеприготовленном растворе для проявления пероксидазной реакции содержащем ТСБ, 15 % метанол, 0.05 % 4-хлоро-1-нафтол (Sigma-Aldrich), 0.02 % Н2О2.
Анализ последовательности, кодирующей отобранное антитело. Плазмидную ДНК выделяли из выращенных в 2xYT-rA бактерий и последовательность в составе вектора pOPE, кодирующую отобранное рекомбинантное антитело, секвенировали с использованием праймеров AAGAGGAGAAATTAACCATGA (прямой) и TCATTAGCACAGGCCTCTAGA (обратный).
Иммобилизация scFv-антител на Ni-содержащей смоле и попытка выделения протеиназы из гомогената слюнных желез вредной верепашки. Рекомбинантные антитела, выделенные из 50 мл бактериальной культуры в 5 мл ТСБ с добавлением ФМСФ, пепстатина А и ЭДТА, инкубировали в течение ночи с 0.1 мл смолы HIS-Select® Nickel Affinity Gel (Sigma-Aldrich) при 4 °C. После этого смолу отмывали ТСБ и продолжали инкубацию при тех же условиях с 3 мл растворимой фракции белков слюнных желез клопа вредная черепашка, приготовленную также как и при приготовлении проб для ДСН-ПААГЭ. После тщательной отмывки ТСБ связавшиеся белки элюировали в присутствии 0.3 М имидазола или 0.1 М триэтиламина с последующей нейтрализацией равным объемом 1 М Трис-Cl буфера (рН 7.4). Пробы анализировали с помощью иммуноблоттинга с использованием рекомбинантного или поликлональных антител.
исследований
ставленных на сайте Национального центра биотехнологической информации США (NCBI). Последовательность VL показала 97-96 % идентичности с некоторыми вариантами вариабельных фрагментов каппа легких цепей иммуноглобулинов мыши (AAG12167.1, AAL24040.1). Наиболее близкое из представленных на сайте NCBI рекомбинантное антитело (CAB60133.1) имеет 74.4 и 95.4 % идентичности, соответственно, для VH и VL-фрагментов. Таким образом, в результате выполненных исследований нами получено новое рекомбинантное антитело, не имеющее полной гомологии с какими-либо известными последовательностями.
ПН
1000
500
Рисунок 1. Анализ последовательностей ДНК, кодирующих scFv-фрагменты, с использованием частощепящей рестриктазы ИаеШ. Плазмидную ДНК из различных колоний использовали для амплификации белок-кодирующих последовательностей с последующим рестрикционным анализом ПЦР-продуктов. Все трансформанты, продуцирующие специфичные к протеиназе антитела, показали идентичный рисунок рестрикции (обозначенные цифрой 1 дорожки). Дорожки 2-4 - другие варианты антител.
MmiPrM^SiiiM^QP^/W^QVQLQQPGAELVRPGSSVKLSCKTSGYTFTSYWLHWVKRRPGQGLEWIGNINPS TGGTNSNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGNOGYYPYYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPKL EEGEFSEARVDILMTQ5QKFMSTSVGDRVSVTCKASQMVGTNVAWYQQKPGQ5PQALIYSASYRYSGVPDRFTGS GSflTDFriTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLTFSGGTKLEIKRADAAPTVSAAAGSEQICLISEEDLStftftfWtfH
Рисунок 2. Аминокислотная последовательность рекомбинантного scFv-фрагмента, специфичного к глютенин-гиролизующей протеиназе вредной черепашки, в составе вектора pOPElOl. Вариабельные фрагменты тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей иммуноглобулинов подчеркнуты, N-концевая сигнальная последовательность PelB, ответственная за транспорт гетерологичного белка в периплазматическое пространство бактерий E. coli, и полигистидиновая последовательность выделены курсивом.
Иммуноблоттинг показал, что отобранное рекомби-нантное антитело распознает глютенин-гидролизующую протеиназу, накапливающуюся в слюнных железах вредной черепашки в виде предшественника (рис. 3, А, дорожка 1, верхняя мажорная полоса), а также его зрелую форму с удаленным пропептидом (рис. 3, А, дорожка 1, нижняя полоса). Идентичная картина наблюдалась и при анализе этой пробы с помощью полученных ранее поликлональных антител (иммунной сыворотки) к рекомбинантному белку ЮНР3е (рис. 3, Б, дорожка 1). Отобранный scFv-фрагмент также подтвердил накопление зрелой формы протеиназы в пробах поврежденной клопом (рис. 3, А, дорожка 2), но не контрольной (рис. 3, А, дорожка 3) муки. Проведенный эксперимент ясно показал, что изучаемая протеиназа действительно выделяется вредной черепашкой в поврежденное зерно. Два типа независимо полученных антител распознают при иммуноблоттинге белков поврежденного зерна одну и ту же полосу, соответствующую по своему размеру зрелой форме протеиназы, присутствующей в слюнных железах клопа.
Рисунок 3. Иммуноблоттинг белков слюнных желез вредной черепашки (дорожки 1), поврежденной клопом (дорожки 2) и контрольной (дорожки 3) муки пшеницы с помощью отобранного scFv-фрагмента (А) и иммунной сыворотки к белку ЮБР3е (Б). Длинная и короткая стрелки указывают на белковые полосы, соответствующие предшественнику и зрелой форме протеиназы.
На следующем этапе исследования представляло интерес выяснить, узнает ли полученный scFv-фрагмент протеиназу клопа в нативной конформации. При создании библиотеки (иммунизации мышей) и отборе фаговых ча-
стиц нами была использована денатурированная форма rGHP3e, полученная в ходе солюбилизации нерастворимых включений, часто образующихся при экспрессии гетерологичных белков в бактериях [de Groot et al. 2008]. Таким образом, распознаваемый рекомбинантным антителом эпитоп мог быть пространственно скрыт при нахождении протеиназы в нативной конформации.
Наличие полигистидиновой последовательности в С-концевой области рекомбинантной молекулы позволило успешно иммобилизовать наработанный в E. coli scFv-фрагмент на Ni-содержащей агарозной смоле His-Select Nickel Affinity Gel. Инкубация частиц агарозы с растворимой фракцией гомогената слюнных желез вредной черепашки и с растворимыми белками поврежденной клопами муки, отмывка смолы и элюция комплекса антиген-антитело в присутствии 0.3 М имидазола не привели к выделению нативного фермента. Во фракциях после элю-ции с помощью иммуноблоттинга было обнаружено лишь рекомбинантное антитело размером около 34 кДа (рис. 4, указано стрелкой).
Рисунок 4. Инкубация белков слюнных желез Е. integriceps и поврежденной вредной черепашкой муки с иммобилизованным на №-содержащей смоле scFv-фрагментом не привела к связыванию нативного фермента.
А. Растворимые белки слюнных желез (дорожка 1) инкубировали с иммобилизованным антителом и после промывки частиц агарозы от несвязавшегося материала (дорожка 2) элюцию комплекса антиген-антитело осуществляли в присутствии 0.3 М имидазола в виде двух фракций (дорожки 3 и 4). Перенесенные на нитроцеллюлозу белки анализировали с использованием иммунной сыворотки к ЮБР3е. Стрелкой отмечена протеиназа, выявляемая во фракции белков слюнных желез.
Б, В. Растворимые белки поврежденной клопом муки инкубировали с иммобилизованным антителом и после промывки смолы от несвязавшегося материала элюцию осуществляли или в присутствии 0.3 М имидазола (дорожки 1) или в присутствии 0.1 М триэтиламина (дорожки 2).
Перенесенные на нитроцеллюлозу белки анализировали с использованием scFv-фрагмента и антител к полигистидиновой последовательности (Б) или с помощью иммунной сыворотки к ЮБР3е (В). Стрелкой на изображении Б отмечен элюированный со смолы scFv-фрагмент, распознаваемый антителами к полигистидиновой последовательности.
Заключение
В данной работе мы получили рекомбинантное одно-цепочечное антитело к обладающей глютенин-гидролизу-ющей активностью трипсин-подобной протеиназе клопа вредная черепашка и смогли доказать, что фермент действительно выделяется вредителем в эндосперм пшеницы, длительное время сохраняясь в поврежденном зерне в зрелой форме. Кроме того, мы получили данные о том, что отобранный scFv-фрагмент распознает протеиназу черепашки лишь в денатурированной форме и может быть использован для обнаружения фермента при иммуноблот-тинге в сочетании с ДСН-ПААГЭ. Для дальнейшего изучения этого фермента, чрезвычайно важного как с практической, так и с научной точек зрения, необходимы новые
эксперименты, связанные с гетерологичной экспрессией протеиназы в нативной конформации. Ранее мы показали, что гетерологичная экспрессия фермента в дрожжевых грибах РкЫа pastoris позволяет получить протеиназу в растворимой, нативной конформации, обладающую глю-тенин-гидролизующей активностью [Долгих и др., 2014; Конарев и др., 2014]. В дальнейших экспериментах мы планируем использовать наработанный в Р pastoris фермент для получения новой высокопредставительной библиотеки рекомбинантных антител и приступить к поиску scFv-фрагментов, распознающих протеиназу в нативной конформации и способных ингибировать его глютенин-ги-дролизующую активность.
Исследование выполнено при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований
(РФФИ, проект № 15-08-04247).
Библиографический
Алехин В.Т. Вредная черепашка // Защита и карантин растений. 2002. N 4. С. 65(1)-91(27).
Вилкова Н. А., Конарев А. В. Современные проблемы иммунитета растений к вредителям // Вестник защиты растений. 2010. N 3. С. 3-15.
Гапонов С. Н., Васильчук Н. С., Шутарева Г. И. Влияние вредной черепашки (Eurygaster integriceps Put.) на качество зерна твердой пшеницы (Triticum durum Desf.) // Аграрный вестник Юго-Востока. 2009. N 2. С. 23-26.
Долгих В. В., Сендерский И. В., Конарев А. В. Получение и свойства ре-комбинантных протеиназ Eurygaster integriceps Put., гидролизующих глютенин // Прикладная биохимия и микробиология. 2014. Т. 50. N 4. P. 1-9.
Каменченко С.Е., Лебедев В.Б., Наумова Т.В. Вредоносность клопа вредная черепашка (Eurygaster integriceps) и качество зерна // Аграрный вестник Юго-Востока, 2010. N 1. C. 36-37.
Капусткина А.В., Нефедова Л.И. Прорастание и морфогенез семян пшеницы при повреждении вредной черепашкой // Вестник защиты растений. 2013. N 2. С. 48-55.
Конарев Ал.В., Долгих, В.В. Сендерский И.В., Нефедова Л.И., Конарев А.В., Губарева Н.К. Свойства нативных и рекомбинантных протеиназ слюнных желез клопа вредная черепашка (Eurygaster integriceps Put.), гидролизующих клейковину пшеницы // Вестник защиты растений. 2014. N 2. С. 3-16.
Крупнов В. А. Селекция пшеницы на устойчивость к вредным клопам (Eurygaster spp.): нет ли риска? // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011. Т. 15. N 3. С. 572-578.
Павлюшин В.А., Вилкова Н.А., Сухорученко Г.И., Нефедова Л.И. Ка-пусткина А.В. Вредная черепашка и другие хлебные клопы. Санкт-Петербург.: 2015. 280 с.
Albrecht H., DeNardo G.L., DeNardo S.J. Monospecific bivalent scFv-SH: Effects of linker length and location of an engineered cysteine on production, antigen binding activity and free SH accessibility // J. Immunol. Methods. 2006. V. 310. N 1-2. P. 100-116.
Avrutina O., Fittler H., Glotzbach B., Kolmar H., Empting M. Between two worlds: a comparative study on in vitro and in silico inhibition of trypsin and matriptase by redoxstable SFTI-1 variants at near physiological pH // Organic and Biomolecular Chemistry. 2012. V. 10. N 38. P. 7753-7762.
Critchley B.R. Literature review of sunn pest Eurygaster integriceps Put. (Hemiptera, Scutelleridae) // Crop Protection. 1998. V. 17. N 4. P. 271-287.
de Groot N.S., Espargaro A., More M., Ventura S. Studies on bacterial inclusion bodies // Future Microbiol. 2008. V. 3. N 4. P. 423-435.
Dolgikh V.V., Senderskiy I.V., Pavlova O.A., Naumov A.M., Beznoussenko G.V. Immunolocalization of an alternative respiratory chain in Antonospora (Paranosema) locustae spores: mitosomes retain their role in microsporidial energy metabolism // Eukaryotic cell. 2011. V. 10. N 4. P. 588-593.
Dunaevsky Ya.E., Elpidina E.N., Vinokurov K.S., Belozersky M.A. Protease inhibitors in improvement of plant resistance to pathogens and insects // Molecular Biology. 2005. V. 39. N 4. P. 60-8613.
список (References)
Fatehi F., Behamta M. R., Zali A.A. Evaluating the resistance to sunn pest (Eurygaster integriceps Put.) and its relationship with high-molecular-weight glutenin subunit in wheat. Proc. 11th Int. Wheat Genet. Symp., Brisbane, Australia, Sydney University Press, 2008, 3, p. 741-743.
Ganesan R., Eigenbrot C., Kirchhofer D. Structural and mechanistic insight into how antibodies inhibit serine proteases // Biochem. J. 2010. V. 430. N 2. P.179-189.
Gatehouse J.A. Prospects for using proteinase inhibitors to protect transgenic plants against attack by herbivorous insects // Current Protein and Peptide Science. 2011. V. 12. N 5. P. 409-416.
Hariri G., Williams P.C., Jaby E.L., Haramein F. Influence of Pentatomidae insects on the physical dough properties and two layered flat-bread baking quality of Syrian wheat // J. Cereal Sci. 2000. V. 31. P. 111-118.
Jamal F., Pandey P.K., Singh D., Khan M.Y. Serine protease inhibitors in plants: nature's arsenal crafted for insect predators // Phytochemistry Reviews. 2012. P. 1-34.
Konarev A.V., Anisimova I.N., Gavrilova V.A., Rozhkova V.T., Fido R., Tatham A.S., P. R. Shewry // Novel proteinase inhibitors in seeds of sunflower (Helianthus annuus L.): polymorphism, inheritance and properties // Theoretical and Applied Genetics. 2000. V. 100. N 1. P. 82-88.
Konarev A.V., Beaudoin F., Marsh J., Vilkova N.A., Nefedova L.I., Sivri D., Koksel H., Shewry P.R., Lovegrove A. Characterization of a glutenin-specific serine proteinase of sunn bug Eurygaster integricepts Put. // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2011.V. 59. N 6. P. 2462-2470.
Luckett S., Garcia R.S., Barker J.J., Konarev A.V., Shewry P.R., Clarke A.R., Brady R.L. High-resolution structure of a potent, cyclic proteinase inhibitor from sunflower seeds // Journal of molecular biology. 1999. V. 290. N. 2. P. 525-533.
Sivri D., Sapirstein H. D., Bushuk W., Koksel H. Wheat intercultivar differences in susceptibility of glutenin protein to effects of bug (Eurygaster integriceps) protease // Cereal Chem. 2002. V. 79. N. 1. P. 41-44.
Torbica A.M., Mastilovic J. S., Pojic M.M., Kevresan Z.S. Effects of wheat bug (Eurygaster spp. and Aelia spp.) infestation in preharvest period on wheat technological quality and gluten composition // The Scientific World Journal. 2014. Article ID 148025 (http://dx.doi.org/10.1155/2014/148025). (Accessed 15.12.2016)
Vaccino P., Corbellini M., Reffo G., Zoccatelli G., Migliardi M., Tavella L. Impact of Eurygaster maura (Heteroptera: Scutelleridae) feeding on quality of bread wheat in relation to attack period // Journal of Economic Entomology. 2006. V. 99. N 3. P. 757-763.
Werteker M., Kramreither G. Relation between susceptibility to wheat bug attack and digestibility of glutenin // Journal of Cereal Science. 2008. V. 47. N 2. P. 226-232.
Zoller F., Markert A., Askoxylakis V., Altmann A., Barthe P., Weichert W., Zhao W., Mier W., Haberkorn U. Combination of phage display and molecular grafting generates highly specific tumor-targeting miniproteins // Angewandte Chemie - Int. Edition. 2012. V. 51. N 52. P. 13136-13139.
Translation of Russian References
Alekhin V.T. Sunn pest. Zashchita i karantin rastenii. 2002. N 4. P. 65(1)-91(27). (In Russian).
Dolgikh V.V., Senderskii I.V., Konarev A.V. Production and properties of recombinant glutenin-hydrolyzing proteinases from Eurygaster integriceps
Put. Applied biochemistry and microbiology. 2014. V. 50. N 5. P. 433-440. (English translation).
Gaponov S.N., Vasilchuk N.S., Shutareva G.I. Sunn pest (Eurygaster integriceps Put.) influence on Durum wheat (Triticum durum Desf.) grain quality. Agrarnyi vestnik Yugo-Vostoka. 2009. N 2. P. 23-26. (In Russian).
Kamenchenko S.E., Lebedev V.B., Naumova T.V. Harmfulness of corn bug (Eurygaster integriceps) and grain quality. Agrarnyi vesntnik Yugo-Vostoka. 2010. N 1. P. 36-37. (In Russian).
Kapustkina A.V., Nefedova L.I. Germination and morphogenesis of wheat seeds damaged by Eurygaster integriceps. Vestnik zaschity rasternii, Saint Petersburg, 2013. N 2. P. 48-55. (In Russian).
Konarev Al.V., Dolgikh V.V., Senderskii I.V., Nefedova L.I., Konarev A.V., Gubareva N.K. Properties of natural and recombinant Sunn pest (Eurygaster
Plant Protection News, 2017, 1(91), p. 21-26
integriceps) salivary gland proteinases hydrolyzing wheat gluten. Vestnik zaschity rasternii, Saint Petersburg, 2014. N2. P. 3-16. (In Russian).
Krupnov V.A. Wheat Breeding for resistance to harmful bugs (Eurygaster spp.): Are there risks? Vavilovskii zhurnal genetiki i selektsii. 2011. V. 15. N 3. P. 572-578.
Pavlyushin V.A., Vilkova N.A., Sukhoruchenko G.I., Nefedova L.I., Kapustkina A.V. Sunn pest and other grain bugs. Saint Petersburg. 2015. 280 p. (In Russian).
Vilkova N.A., Konarev A.V. Modern problems of immunity of plants to pests. Vestnik zaschity rasternii, Saint Petersburg, 2010. N 3. P. 3-15. (In Russian).
RECOMBINANT SINGLE CHAIN ANTIBODIES AS IMPLEMENT FOR DETECTION AND STUDYING EURYGASTER INTEGRICEPS PROTEINASES HYDROLYZING GLUTEN V.V. Dolgikh, A.A.Tsarev, I.V. Senderskiy, S.A. Timofeev, A.V. Konarev
All-Russian Institute of Plant Protection, St. Petersburg, Russia
Wheat bugs of genus Eurygaster Lap. cause great damage to the quality of wheat in Russia and abroad. Proteases of the salivary glands of such bug as sunn pest Eurygaster integriceps, hydrolyzing the basic proteins of wheat gluten (gliadins and gluteins), are important factors of harmfulness. In previous studies, we over-expressed E. integriceps gluten-hydrolyzing proteinase GHP3 in bacteria E. coli. Here we have constructed the library of single chain antibodies (scFv-fragments) on the basis of variable fragments of immunoglobulins of mice immunized with recombinant proteinase. Phage display technology has enabled us to select the mini-antibody specifically recognizing GHP3 in samples of bug salivary glands. Immunoblotting using scFv-fragment has also confirmed the presence of minor amounts of the enzyme in damaged grain. The prospects of use of single-chain recombinant antibodies for further study of bug proteinases, as well as for construction of inhibitors of their glutenin-hydrolyzing activity are discussed.
Keywords: Sunn pest; Eurygaster integriceps; salivary gland; damaged grain; gluten; glutenin; proteinase; single chain antibody; phage display; inhibitor; immunodiagnostics.
Сведения об авторах
Всероссийский НИИ защиты растений, шоссе Подбельского, 3, 196608
Санкт-Петербург, Пушкин, Российская Федерация
*Долгих Вячеслав Васильевич. Ведущий научный сотрудник, кандидат
биологических наук, e-mail: dol1slav@yahoo.com
Царев Александр Александрович. Студент СПбГУ,
e-mail: alexandretsarev@gmail.com
Сендерский Игорь Вадимович. Младший научный сотрудник, e-mail: sen54@mail.ru
Тимофеев Сергей Александрович. Ведущий инженер, e-mail: ts-bio@yandex.ru
Конарев Александр Васильевич. Ведущий научный сотрудник, доктор биологических наук, e-mail: al_konarev@hotmail.com
* Ответственный за переписку
Information about the authors
All-Russian Institute of Plant Protection, Podbelskogo shosse, 3, 196608, St. Petersburg, Pushkin, Russian Federation *Dolgikh Viacheslav Vassiljevich. Leading Researcher, PhD in Biology,
e-mail: dol1slav@yahoo.com TsarevAlexandrAlexandrovic. Student, Saint-Petersburg State University,
e-mail: alexandretsarev@gmail.com Senderskiy Igor Vadimovich. Researcher, e-mail: sen54@mail.ru Timofeev Sergey Alexandrovich. Leading Engineer, e-mail: ts-bio@yandex.ru
Konarev Alexander Vasilievich. Leading Researcher, DSc in Biology, e-mail:
al_konarev@hotmail.com
* Responsible for correspondence
УДК: 632.38:635.21
ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ПЕРЕНОСА Y ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ ХИЩНЫМ КЛОПОМ ORIUSMAJUSCULUS REUTER (HEMIPTERA, ANTHOCORIDAE) И ОБЫКНОВЕННОЙ ЗЛАКОВОЙ ТЛЕЙ SCHIZAPHIS GRAMINUM RONDANI (HOMOPTERA: APHIDIDAE)
И.М. Пазюк, Т.С. Фоминых, К.Д. Медведева
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт Петербург
В защите овощных культур закрытого грунта часто применяются хищный клоп Orius majusculus и обыкновенная злаковая тля Schizaphis graminum: первого выпускают против сосущих вредителей, вторую предлагают на растениях-накопителях в качестве источника дополнительного питания для различных энтомофагов. В лабораторных условиях нами была проведена оценка возможности переноса Y вируса картофеля этими насекомыми с целью их дальнейшего использования в системе защитных мероприятий меристемного картофеля от вредителей. В результате было показано,
