CC BY
280
УДК 571.27
Регуляция процессинга иммуногена: сигнальные последовательности и их использование для создания нового поколения ДНК-вакцин
Е.С. Стародубова1*, М.Г. Исагулянц2,3*, В.Л. Карпов1
1 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32
2 Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16
3 Institute of Microbiology, Cell and Tumor Biology, Karolinska Institutet, 17177, Stockholm, Sweden * E-mail: estarodubova@yandex.ru, maria.isaguliants@smi.se
реферат Среди новых направлений в создании профилактических и терапевтических вакцин против различных патогенов весьма перспективным считается использование ДНК-вакцин. Активно разрабатывается целый ряд ДНК-вакцинных препаратов, часть из которых уже проходят клинические испытания. Тем не менее иммуноген-ность ДНК-вакцин, особенно для человека, еще недостаточно высока. Для повышения их эффективности используются различные подходы. Одним из таких подходов является модификация иммуногенов, изменяющая путь их процессинга и презентации, что в свою очередь изменяет иммунный ответ на иммуноген. Такая модификация основана на конструировании эукариотических экспрессионных векторов, кодирующих химерные белки, состоящие из антигена и специализированных сигнальных последовательностей. В обзоре рассмотрены различные сигналы, направляющие несущий их белок в определенные компартменты клетки, а также примеры их использования для создания ДНК-иммуногенов.
ключевые слова ДНК-вакцины, МНС-I, MHC-II, презентация антигена.
список сокращений эндоплазматический ретикулум (ER), убиквитин (Ub), вирус гепатита C человека (HCV), орнитиндекарбоксилаза (ODC), обратная транскриптаза HIV-1 (RT), Ca2+-связывающий белок калретикулин (CRT), вирус папилломы человека-16 (HPV-16), лизосомоассоциированный белок 1 (LAMP-1), нуклеокапсидный белок коронавируса SARS (sarsN), вирус лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), главный комплекс гистосов-местимости класса I (MHC-I), главный комплекс гистосовместимости класса II (MHC-II).
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время активно развиваются вакцины, создаваемые генно-инженерными методами. Среди них весьма перспективными считаются ДНК-вакцины. В самом простом варианте ДНК-вакцина представляет собой плазмиду, содержащую ген белка патогена и элементы, необходимые для транскрипции этого гена в клетках млекопитающих. При иммунизации ДНК попадает в клетки организма, транскрибируется и происходит синтез закодированного антигена, который, в свою очередь, инициирует иммунный ответ (рис. 1). В отличие от белковых вакцин ДНК-вакцины на основе генов вирусов и раковых антигенов имеют то преимущество, что специфический иммуноген синтезируется непосредственно в организме хозяина и правильно процес-сируется, что в итоге индуцирует иммунный ответ желаемой специфичности. Также эта технология является перспективной за счет дешевизны и простоты производства и транспортировки препаратов, по сравнению с традиционными вакцинами. Кроме того, ДНК-иммуноген относи-
тельно просто может быть изменен методами генной инженерии, что дает возможность создания антигена с новыми свойствами, сконструированными т silico. При использовании ДНК-вакцин могут возникать опасения относительно возможности встраивания вносимого генетического материала в геном хозяина (инсерционного мутагенеза). Однако вероятность такого события чрезвычайно низка. Она составляет от 1-7 событий на 150 000 ядер, что на три порядка меньше, чем частота естественных спонтанных мутаций в организме [1].
ДНК-вакцины применяются для индукции протек-тивного иммунного ответа против различных инфекций как на мелких животных, например грызунах, так и на животных более крупных видов [2-4]. Проводятся серии испытаний профилактических и терапевтических ДНК-вакцин против патогенов человека, таких как НГУ-1 и HCV [5-7]. Однако иммуногенность генетических вакцин требует улучшения, в особенности для применения на людях [8-10]. Для увеличения эффективности ДНК-вакцин ис-
плазмида
клонирование гена целевого белка
► >0000. -
промотор
¡р
сигнал полиаденилирирования
ДНК-иммунизация
- С
антиген-презентирующая клетка
В-клетка
Рис. 1. ДНК-иммунизация
пользуют различные подходы [11 — 13]. Они включают в себя разработку новых методов доставки ДНК-вакцин (особо популярной в последнее время стала электропорация), добавление в состав препаратов цитокинов и химокинов [14], оптимизируют основу векторной молекулы: подбирают эффективные промоторы генов и регуляторные элементы плазмиды [15], регулируют CpG состав молекулы [14]. Сам ДНК-антиген также подвергается модификации, в частности осуществляют оптимизацию последовательностей генов целевых белков для улучшения их экспрессии [16]. Одним из перспективных подходов модификации имму-ногена является изменение природного пути его процес-синга и презентации [17]. Такое перенаправление может быть достигнуто за счет добавления специализированных сигнальных последовательностей белков. В данном обзоре рассматриваются сигналы направления белков в различные клеточные компартменты и их применение для конструирования ДНК-вакцин.
Для узнавания иммунной системой антиген должен быть процессирован и представлен на поверхности клетки мо-
лекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Различают два наиболее значимых класса этих молекул: МНС класса I (МНС-1) и МНС класса II (МНС-П). Для связывания с молекулами каждого класса антиген проходит подготовку в специализированных компартментах клетки (табл. 1). Так, эндогенные белки направляются на деградацию на протеасоме и представляются в комплексе с МНС-1 на поверхности клетки для распознавания рецепторами цитотоксических СD8+ Т-клеток (С^), которые осуществляют цитотоксический иммунный ответ [18]. Экзогенный белок расщепляется лизосомными протеазами, включается в состав МНС-П молекул и распознается рецепторами хелперных СD4+ Т-клеток, которые способствуют как клеточному, так и гуморальному ответам [19]. Таким образом, путь процессинга антигена определяет тип иммунного ответа на него.
ПРЕЗЕНТАЦИЯ ДНК-КОДИРУЕМОГО АНТИГЕНА ПО ПУТИ МНС-1
Как уже было сказано, процессинг антигена по пути МНС-1 приводит к развитию СТL-ответа. Этот процесс проходит в несколько этапов (рис. 2). Белок, синтезированный в клетке, расщепляется протеасомой на короткие пептиды, которые переносятся белками-транспортерами, ассоциированными с процессингом антигенов (ТАР), в эндоплазмати-ческий ретикулум (ЕЙ), где они связываются с МНС-1 [18]. Затем комплекс пептид-МНС-1 транспортируется на поверхность клетки для распознавания рецепторами цито-токсических СD8+ Т-клеток (С^), которые осуществляют клеточный ответ. Поэтому усиление направления белков в протеасому или ЕЙ должно способствовать их большей доступности для представления по МНС-1 пути и, следовательно, усилению клеточного ответа.
протеасом-опосредованный механизм
Для деградации на протеасоме белок должен нести специальную метку - цепь молекул убиквитина (иЬ), который представляет собой небольшой полипептид, состоящий из 76 аминокислотных остатков. В эукариотической клетке существует специализированный комплекс ферментов, осуществляющих узнавание белковых субстратов и ковалентное присоединение к ним полиубиквитина, - убиквитин-конъюгирующая система [20]. Распознаваемые этой системой сигналы направления на деградацию в протеасому разнообразны. Такими деградационными сигналами могут служить аминокислотные последовательности, определенный характер фосфорилирования белка, а также изменения пространственной укладки его молекулы. Идентифицировано несколько деградационных сигналов с характерной аминокислотной последователь-
антиген
Таблица 1. Пути процессинга антигенов и формы иммунного ответа
Локализация антигена Основной инструмент процессинга Антиген-презентирующий комплекс Узнающие клетки иммунной системы Стимулируемый иммунный ответ
Внутри клетки Протеасома МНС-1 СD8 + Цитотоксический
Вне клетки Лизосома МНС-11 СD4+ Клеточный, гуморальный
60 | АСТА ПАТиИАЕ | ТОМ 2 № 1 (4) 2010
эндогенный белок
/
Kl Р
полиубиквитинированный белок
протеасома
пептиды
МНС класса I
чх>
ТАР
ЭПР
МНС класса I
CD8+
Т-лимфоцит
Рис. 2. Процессинг антигена при презентации в комплексе с МНС-I
ностью. Первым выявленным сигналом, который регулирует накопление белка в клетке, является N-дегрон [21]. Он представлен N-концевой аминокислотой белка, которая является субстратом действия специализированных клеточных ферментов. Также установлены сигналы деградации: PEST-последовательность [22] и Destruction Box [23], которые характерны для короткоживущих клеточных белков (табл. 2).
УБИКВИТИН-ЗАВИСИМЫЙ МЕХАНИЗМ
Серьезное внимание исследователей было сфокусировано на направлении антигена на деградацию на протеасоме по убиквитин-зависимому механизму, которое позволило
изменить процессинг и презентацию антигена в составе MHC-I и усилить CTL-ответ [25-28]. Такое направление осуществляли путем клонирования Ub-кодирующей последовательности на 5 '-конец целевого гена в сочетании с введением после Ub дестабилизирующего N-концевого остатка, что делало антиген еще более подходящим субстратом для протеасомы. В данной конструкции Ub посттрансляционно отщепляется клеточной С-концевой убиквитин-гидролазой и открывается доступ к N-дегрону. С использованием этого подхода был модифицирован ген белка nef HIV-1 (Ub-Arg-Nef), что привело к его более высокой иммуногенности в экспериментах на мышах [29]. Слияние с убиквитином было использовано при иммунизации экспрессионными библиотеками генов HIV-1. Во все открытые рамки считывания HIV-1, закодированные на 32 плазмидах, была добавлена кодирующая последовательность убиквитина. После однократной иммунизации генной пушкой такая библиотека стимулировала сильный T-клеточный ответ против всех 32 антигенов. Ответ детектировали по CTL-активности, IFN-Y+/CD8+ T-клеточной активации и связыванию тетрамеров HLA [30]. Добавление убиквитина на N-конец синтетического белка, состоящего из CTL-эпитопов HIV, также привело к усилению иммуно-генности конструкта на клеточном уровне [31].
Сигналом протеасомной деградации может служить также неправильная укладка белка. Этот вариант был применен к белкам вируса гриппа. Были сконструированы нестабильные варианты белков M1 и NS1, в которых трехмерная структура белков была разрушена введением коротких последовательностей в альфа-спиральные участки. Иммунизация генами «деструктурированных» белков приводила к значительно более сильному CTL-ответу, чем иммунизация исходными генами [32].
Однако на некоторых вирусных белках слияние с протеасом-направляющими сигналами не привело к ускорению их деградации [27, 33]. Белок HIV-1 Gag, модифицированный убиквитином и дестабилизирующим остатком аргинина (Ub-Arg-Gag), лишь незначительно изменил скорость деградации. Для значительной дестабилизации белка потребовалось введение дополнительной последовательности, содержащей экспонированный остаток лизина eK (Ub-R-eK-Gag). Химера Ub-R-eK-Gag активно направлялась в протеасому, что повысило презентацию антигенных пептидов в комплексе с MHc-I на поверхности клеток, однако это не привело к значительному усилению анти-Gag CTL-ответа при иммунизации мышей [34]. Аналогичный результат был получен для нескольких химер белка нуклеокапсида вируса гепатита человека (HcV), которые содержали как ковалентно связанный убиквитин, так и отщепляемый Ub в сочетании с N-стабилизирующим или N-дестабилизирующим аминокислотным остатком [35]. В ряде других случаев, особенно на вирусных моделях, усиление протеасомной деградации также не привело к повышению протективного иммунитета [34].
УБИКВИТИН-НЕЗАВИСИМЫ1Й МЕХАНИЗМ
Интересно отметить, что для деградации некоторых белков не требуется убиквитинирование [36]. Первым найденным белком такого типа была орнитиндекарбоксилаза (ODC) [37]. Ее деградация зависит от АТР и белка-антизима.
С-конец антизима осуществляет связывание с N-концевой частью орнитиндекарбоксилазы, при этом ODC направляется в протеасому, а сам антизим высвобождается. Помимо сайта связывания антизима, находящегося на N-конце ODC, в С-концевой части находится PEST-сигнал [38]. В экспериментах на делеционных мутантах ODC было установлено, что минимальным необходимым сигналом для быстрой деградации ODC на протеасоме являются 37 концевых аминокислот [39]. Показано, что этот участок отвечает за связывание ODC с протеасомой. Убиквитин-конъюгирующая система является многоступенчатым, сложно регулируемым механизмом. Использование сигналов деградации белков, направляемых в протеасому по убиквитин-независимому механизму, позволяет избежать влияния на эффективность направления в протеасому большого числа факторов. Слияние обратной транскриптазы HIV-1 с двумя короткими сигналами, содержащимися на С-конце ODC и представляющими собой минимальный протеасом-направляющий мотив, приводит к ускорению деградации и улучшению иммунного ответа у мышей по сравнению с исходным немодифицированным геном [40]. Эта модификация успешно сработала для низ-коиммуногенной [41] лекарственно-устойчивой обратной транскриптазы HIV-1 и позволила индуцировать как клеточный, так и антительный иммунный ответ [42].
er-опосредованный механизм
При процессинге по МНС-1-пути антиген проходит ER. Поэтому повышение сродства антигена к ER может улучшить иммуногенные свойства антигена. В ER широко представлен Са2+-связывающий белок калретикулин (CRT) [43], который ассоциирован с компонентами, осуществляющими представление антигена по МНС-1-пути [44, 45]. Присоединение калретикулина к кодируемому антигену было использовано для усиления Т-клеточного иммунного ответа на опухолевые клетки. Была создана ДНК-вакцина, кодирующая химеру CRT с белком Е7 вируса папилломы человека-16 (HPV-16) E7. У мышей, иммунизированных этим препаратом, наблюдалось значительное увеличение популяции Е7-специфических CD8+ T-клеток и их ли-тическая активность в отношении Е7-экспрессирующих опухолей [46, 47]. Слияние CRT с другим белком HPV-16 -Е6 также привело к усилению Е6-специфического CD8 + T-клеточного иммунного ответа у иммунизированных мышей [48].
Изменение локализации белка Е7 HPV-16, связанное с повышением его ассоциации с ER, было достигнуто и другим путем при его слиянии с внеклеточным доменом лиганда Fms-подобной тирозинкиназы 3 (FL) [49]. Данный ДНК-иммуноген, введенный подкожно с помощью генной пушки, значительно повышал частоту активации Е7-специфических CD8+ T-клеток по сравнению с вакциной, несущей немодифицированный вариант гена Е7. В ходе in vitro исследований было выявлено, что клетки линии 293, трансфицированные FL-E7 ДНК, представляют Е7 антиген в составе MHC-I более эффективно, чем при трансфекции ДНК исходным геном Е7. Химера FL-E7 активировала в основном CD8+ T-клетки, и противоопухолевый эффект был полностью независимым от CD4+ Т-клеток [49].
экзогенный
белок
эндогенный белок
/
эндоцитоз
аутофагия
I
\
/
/
пептиды > о
лизосома
МНС класса II
\
€0=
CD4+ Т-лимфоцит
Рис. 3. Процессинг антигена при презентации в комплексе с МНС-II
Успешный опыт по усилению иммунного ответа к оболо-чечному белку Е2 HCV был получен при удвоении сигнала локализации в ЕЙ, что привело к облегчению освобождения Е2 из эндоплазматического ретикулума [50].
презентация днк-кодируемого антигена по пути mhc-ii
Основным источником пептидов для связывания с МНС-II являются экзогенные белки, которые с помощью эндо-
Таблица 2. Сигналы деградации на протеасоме со специфическими аминокислотными последовательностями
Название сигнала Аминокислотная последовательность
N-дегрон П-концевая кислота (узнающий фермент): Дестабилизирующие — F, L, W, Y, I, И, К, Н, А, S, Т, G (Е3 -лигаза); (П-концевая аминогидролаза); D,Е,C (А^-т-РНК-трансфераза) Стабилизирующие — М, S, G, V (нет распознающих ферментов)
PEST-последовательность Последовательность, обогащенная пролином (Р), глутаминовой кислотой (Е), серином и треонином (Т)
Destruction box И-А/Т-А^^-Х-1/У^/Т-П
цитоза и далее направляются в лизосомы (рис. 3). Однако обнаружено, что пептиды некоторых внутриклеточных белков также могут быть представлены МНС-11 посредством аутофагии [51]. При этом белки попадают в лизосо-мы при шаперон-опосредованном переносе из цитоплазмы белком-транспортером, при окружении части цитоплазмы мембраной лизосом, а также при формировании двумем-бранных аутофогосом в цитоплазме [51-55][49-53]. В лизо-сомах антиген расщепляется кислыми протеазами, и образованные пептиды включаются в состав МНС-П-молекул. На поверхности клеток эти комплексы распознаются рецепторами CD4+ Т-клеток [56]. В результате происходит активация CD4+ Т-клеток, которые стимулируют как клеточный иммунитет (ТЫ-тип CD4+ Т-клеток), так и гуморальный иммунитет (^2-тип).
Традиционно терапевтические стратегии вакцинации растворимыми белковыми антигенами нацелены на мобилизацию CD4+ Т-клеток. Сравнительно низкий ответ CD4+ Т-клеток является одним из недостатков ДНК-вакцин. Текущие клинические испытания также показали, что нынешнее поколение ДНК-вакцин не способно индуцировать выработку высоких титров антител [57]. Поэтому направление антигенов по пути презентации МНС-11 с целью повышения способности активировать CD4+ Т-клетки представляется особо выигрышным. Такое направление может задаваться искусственно путем добавления к ДНК-антигену сигналов лизосомной локализации.
Иммуноген, кодируемый ДНК, может быть специфически перенаправлен в лизосомы клетки с помощью сигналов белкового сортинга. Внутриклеточные сигналы сортинга содержатся в цитоплазматических концевых фрагментах трансмембранных и лизосомоассоциирован-ных белков [24, 58, 59]. Большинство из них представляет собой короткие аминокислотные последовательности, которые можно подразделить на тирозин- и дилейцинсо-держащие [24, 60]. Тирозинсодержащие сигналы представляют собой консенсусный мотив: NPXY или YXX0 (где X - любая аминокислота, а 0 - аминокислота с объемной гидрофобной боковой цепью). Консенусная последовательность дилейциновых сигналов: (DЕ)XXXL(LI) или DXXLL. Эти сигналы распознаются адапторным белком АР или родственными комплексами и затем направляются в транс-Гольджи, плазматическую мембрану или эндосомы. Существуют и другие мотивы, напри-
мер кластер кислых аминокислот и последовательность NPFSD [58]. Ряд клеточных белков направляется в лизосомы за счет наличия фосфорилированного остатка ман-нозы, находящегося на консенсусной последовательности NX(ST) [61-63]. Предполагается также наличие сигналов направления цитоплазматических белков в лизосому по аутофагосомному механизму [64].
лизосом-опосредовднный механизм
Показано, что тирозин- и дилейцинсодержащие сигналы способны эффективно направлять в лизосому гетероло-гичные белки [19, 65, 66]. Наиболее активно применялось направление на презентацию по MHC-II-пути с помощью сигналов сортинга белков LAMP-1 [67], Ii [65] и AP3-связывающего мотива LIMP II [66].
СИГНАЛ LAMP-1
Сигнал сортинга лизосомоассоциированного белка 1 (LAMP-1) направляет антиген по пути процессинга MHC-II и усиливает его презентацию CD4+ Т-клеткам, что показано в опытах in vitro. Эксперименты по иммунизации мышей продемонстрировали, что химеры с геном LAMP-1 стимулируют повышение лимфопролиферативной активности, титров антител и CTL-активности по сравнению с ДНК-вакцинами на основе немодифицированных вариантов генов.
Усиление ^2-типа иммунного ответа CD4+ Т-клеток при слиянии с белком LAMP-1 было продемонстрировано для ДНК-иммуногенов на основе генов белков HIV-1 gp160- и p55gag [68, 69]. LAMP/gag DNA-вакцина стимулировала длительный B-, CD4+ и CD8+ T-клеточные ответы, тогда как иммунный ответ на введение ДНК немоди-фицированного гена Gag быстро спадал [70]. Другой пример успешного перенаправления цитоплазматического белка - нуклеокапсидный белок коронавируса SARS (sarsN). Был проанализирован спектр иммунного ответа у мышей в ответ на введение ДНК, кодирующей химеру sarsN с LAMP-1. Иммунизация LAMP-sarsN геном индуцировала сбалансированный IFN-y и IL-4-ответ, а также сильную активацию CTL-ответа [66]. Слияние LAMP-1 с обратной транскриптазой HIV-1 привело к улучшению иммуноген-ности прототипной ДНК-вакцины против лекарственно-устойчивого вируса. Была преодолена толерантность иммунной системы к консервативному ретровирусному
антигену и достигнут сильный иммунный ответ смешанного Th1 /^2-типа против обратной транскриптазы как дикого, так и лекарственно-устойчивого типов [71].
Слияние с LAMP-1 способствовало также повышению иммуногенности белка оболочки флави вируса. В кан-дидатной вакцине против вируса Дэнге типа 2 на основе генов премембранного белка (prM) и белка оболочки (E) трансмембранные и цитоплазматический домены белка Е были заменены аналогичными доменами белка LAMP-1 [72]. Для полученного химерного белка было показано специфическое гранулярное цитоплазматическое окрашивание, свидетельствующее о ко-локализации химеры с эндогенными белками LAMP-1, MHC-II, и H2-M, чего не наблюдали в случае немодифицированного антигена. Мыши, иммунизированные модифицированным конструктом Dengi PrM/E, отвечали значительно более высоким уровнем продукции нейтрализующих антител по сравнению с мышами, иммунизированными немодифицирован-ным вариантом. Аналогично, для вируса Западного Нила последовательность гена премембранного и оболочечного белков (preM-E) была слита с трансмембранным и цито-плазматическим доменами LAMP [73]. В мышах, иммунизированных ДНК-конструктом, экспрессирующим химеру WN preM-E/LAMP, наблюдалась значительная выработка антител с длительной нейтрализующей активностью в отличие от иммунизации плазмидами с исходным вариантом антигена, приводящей к образованию короткоживу-щих антител в низком титре. Эти результаты могут стать основой для создания эффективной ДНК-вакцины против флавивирусов.
Введение гена белка Е7 HPV-16, слитого с LAMP, также позволило усилить ^2-тип иммунного ответа [74]. Введение секреторного варианта ДНК-химеры E7-LAMP-1 в форме рекомбинантного вируса привело к выработке сильного противоопухолевого иммунитета, способного как предотвращать развитие опухолей, так и уменьшать уже имеющиеся [75].
Есть и несколько примеров неудачного применения данной модификации к цитоплазматическим белкам, например белку нуклеокапсида HCV и белку p53 [76]. Была создана плазмида, экспрессирующая химеру белка нуклеокапси-да HcV с сигнальной и С-концевой последовательностью LAMP-1. При иммунизации мышей не было зарегистрировано ни антительного ответа, ни пролиферации клеток, лишь очень слабая CTL-активность [35]. Таким образом, направление в лизосому не путем слияния иммуногена с LAMP не является гарантированно эффективным методом усиления иммунного ответа Th2-TOm.
сигнал инвариантной цепи
Сами молекулы МНС класса II также нуждаются в транспортировке в лизосомный компартмент. За данный процесс ответственна инвариантная цепь молекул MHc класса II (Ii) [77]. Два сигнала сортинга содержатся в цитоплазмати-ческом домене Ii [65, 77, 78].
Показано, что эндогенно синтезированные белки, обычно исключенные из представления по пути MHc-II, могут быть эффективно презентированы молекулами MHc-II при слиянии с Ii [79]. Присоединение Ii к рекомбинантным антигенам может усилить, расширить и продлить протективный иммунный ответ на ДНК-вакцинные антигены, что проде-
монстрировано на животных моделях. Как было установлено в опытах in vitro и in vivo, иммуногены на основе аденовируса, экспрессирующие химеру Ii с гликопротеином вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), имеют повышенную способность стимулировать CD4+ и CD8 + Т-клетки. Кроме того, мыши, однократно вакцинированные данной плазмидой, оказываются защищенными от инфекции летальной дозой вируса хориоменингита [80]. Этот подход также эффективен при ДНК-иммунизации крупных животных. Так, был создан ДНК-конструкт на основе последовательности основного поверхностного белка 1а Anaplasma marginale, который был слит с мотивом бычьего Ii, направляющим его в лизосомы [81]. Однократное введение данной плазмиды эффективно стимулировало иммунный ответ, выраженный в активной пролиферации IFN-y+/ cD4+ Т-клеток и продукции специфических иммуноглобулинов класса G. Однократное введение данной конструкции индуцировало образование иммунологической памяти, которая обеспечила ускоренный ответ при повторной встрече с антигеном [81].
направление в аутофагосомы
На сегодняшний день точные механизмы аутофагии не установлены, ведется их активное изучение. Показано, что слияние с аутофагосом-ассоциированным белком Atg8/LC3 матриксного белка 1 вируса гриппа приводит к значительному усилению презентации в составе MHC-II и узнаванию CD4+ Т-клетками [82]. Это подтверждает, что аутофагия постоянно и эффективно доставляет цитоплазматические белки для представления MHc-II, что в свою очередь может быть использовано для улучшения стимуляции Т-хелперного ответа.
направление на секрецию
Эффективным методом индукции Т-хелперного иммунного ответа может быть нацеливание на выведение иммуногена во внеклеточную среду. Слияние белков HIV-1 Gag и Env с секреторным хемокином MCP3 направляет вирусные белки на секрецию и приводит к эффективной выработке антител у иммунизированных макак. При заражении патогенным вирусом SIVmac251 у вакцинированных животных наблюдалось достоверно более низкое содержание вируса, чем у невакцинированных [83]
Эти результаты свидетельствуют, что направление антигена в лизосомы усиливает его представление в составе комплексов с MHc-II и позволяет существенно улучшить иммуногенность ДНК-вакцин.
заключение
В настоящее время остро стоит вопрос создания вакцин против различных заболеваний человека, таких как иммунодефицит, вызываемый HIV-1, гепатит С, рак и др. ДНК-вакцинная технология предоставляет большие возможности по конструированию эффективных специфических вакцинных препаратов. В данном обзоре мы рассмотрели ряд сигнальных последовательностей, которые вносятся в иммуногены для их направления по выбранному пути процессинга и презентации, как правило, отличающемуся от природного. Направление антигена на презентацию по MHC-I-пути с помощью различных механизмов
позволяет улучшить цитотоксический Т-клеточный ответ, а по МНС-11-пути — активировать Т-хелперы, которые в свою очередь способны стимулировать как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ. В целом, использование сигнальных последовательностей как инструмента регулирования презентации иммуногена позволяет повысить иммуногенный потенциал существующих ДНК-вакцин и приближает к созданию эффективных профилактиче-
ских и терапевтических препаратов, применимых в клинической практике. •
Работа поддержана Федеральным агентством по науке и инновациям (ГК 02.740.11.5134), Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 08-04-01178-а) и Шведским советом по научным исследованиям (Swedish Research Council).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Nichols W.W., Ledwith B.J., Manam S.V., et al. // Ann N Y Acad Sci. 1995. V. 772. P. 30-39.
2. Powell K. // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22. P. 799-801.
3. Breathnach C.C., Clark H.J., Clark R.C., et al. // Vaccine. 2006. V. 24. P. 1180-1190.
4. Bahloul C., Taieb D., Diouani M.F., et al. // Vaccine. 2006. V. 24. P. 1063-1072.
5. Liu M.A., Wahren B. and Karlsson Hedestam G.B. // Hum. Gene Ther. 2006. V. 17. P. 1051-1061.
6. Ulmer J.B., Wahren B. and Liu M.A. // Trends Mol. Med. 2006. V. 12. P. 216-222.
7. Ahlen G., Soderholm J., Tjelle T., et al. // J. Immunol. 2007. V. 179. P. 4741-4753.
8. Cui Z. // Adv. Genet. 2005. V. 54. P. 257-289.
9. Laddy D.J. and Weiner D.B. // Int. Rev. Immunol. 2006. V. 25. P. 99-123.
10. Duerr A., Wasserheit J.N. and Corey L. // Clin. Infect. Dis. 2006. V. 43. P. 500-511.
11. Donnelly J. J., Wahren B. and Liu M.A. // J. Immunol. 2005. V. 175. P. 633-639.
12. Kutzler M.A. and Weiner D.B. // Nat. Rev. Genet. 2008. V. 9. P. 776-788.
13. Barouch D.H. // J. Pathol. 2006. V. 208. P. 283-289.
14. Jechlinger W. // Expert Rev. Vaccines. 2006. V. 5. P. 803-825.
15. Egan M.A., Megati S., Roopchand V., et al. // Vaccine. 2006. V. 24. P. 4510-4523.
16. Megati S., Garcia-Hand D., Cappello S., et al. // Vaccine. 2008. V. 26. P. 5083-5094.
17. Leifert J.A., Rodriguez-Carreno M.P., Rodriguez F., et al. // Immunol. Rev. 2004. V. 199. P. 40-53.
18. Yewdell J.W. // Curr. Opin. Immunol. 2007. V. 19. P. 79-86.
19. van Bergen J., Ossendorp F., Jordens R., et al. // Immunol. Rev. 1999. V. 172. P. 87-96.
20. Hershko A. and Ciechanover A. // Annu. Rev. Biochem. 1998. V. 67. P. 425-479.
21. Bachmair A. and Varshavsky A. // Cell. 1989. V. 56. P. 1019-1032.
22. Rogers S., Wells R. and Rechsteiner M. // Science. 1986. V. 234. P. 364-368.
23. Yamano H., Gannon J. and Hunt T. // Embo J. 1996. V. 15. P. 5268-5279.
24. Bonifacino J.S. and Traub L.M. // Annu Rev. Biochem. 2003. V. 72. P. 395-447.
25. Restifo N.P., Bacik I., Irvine K.R., Yewdell J.W., McCabe B.J., Anderson R.W., Eisenlohr L.C., Rosenberg S.A., Bennink J.R. // J. Immunol. 1995. V. 154. P. 4412-4422.
26. Townsend A., Bastin J., Gould K., Brownlee G., Andrew M., Coupar B., Boyle D., Chan S., Smith G. // J. Exp. Med. 1988. V. 168. P. 1211-1224.
27. Wong S.B.J., Buck CB, Shen X, Siliciano RF. // J. Immunology. 2004. V. 173. P. 3073-3083.
28. Wu Y., Kipps T.J. // J. Immunol. 1997. V. 159. P. 6037-6043.
29. Tobery T. and Siliciano R.F. // J. Immunol. 1999. V. 162. P. 639-642.
30. Singh R.A., Wu L. and Barry M.A. // J. Immunol. 2002. V. 168. P. 379-391.
31. Bazhan S.I., Belavin P.A., Seregin S.V., et al. // Vaccine. 2004. V. 22. P. 1672-1682.
32. Ilyinskii P.O., Meriin A.B., Gabai V.L., et al. // Vaccine. 2008. V. 26. P. 2177-2185.
33. Altstein A.D., Gitelman A.K., Smirnov Y. A., Piskareva L.M., Zakharova L.G., Pashvykina G.V., Shmarov M.M., Zhirnov O.P., Varich N.P., Ilyinskii P.O., Shneider A.M. // Arch. Virol. 2006. V. 151. P. 921-931.
34. Wong S.B., Buck C.B., Shen X., et al. // J. Immunol. 2004. V. 173. P. 3073-3083.
35. Vidalin O., Tanaka E., Spengler U., et al. // DNA Cell. Biol. 1999. V. 18. P. 611-621.
36. Orlowski M. and Wilk S. // Arch. Biochem. Biophys. 2003. V. 415. P. 1-5.
37. Murakami Y., Matsufuji S., Kameji T., et al. // Nature. 1992. V. 360. P. 597-599.
38. Hayashi S., Murakami Y. and Matsufuji S. // Trends Biochem. Sci. 1996. V. 21. P. 27-30.
39. Murakami Y., Matsufuji S., Hayashi S., et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 267. P. 1-6.
40. Starodubova E.S., Boberg A., Litvina M., et al. // Vaccine. 2008. V. 26. P. 5170-5176.
41. Isaguliants M.G., Zuber B., Boberg A., et al. // Vaccine. 2004. V. 22. P. 1810-1819.
42. Boberg A. and Isaguliants M. // Expert Rev. Vaccines. 2008. V. 7. P. 131-145.
43. Nash P.D., Opas M. and Michalak M. // Mol. Cell. Biochem. 1994. V. 135. P. 71-78.
44. Spee P. and Neefjes J. // Eur. J. Immunol. 1997. V. 27. P. 2441-2449.
45. Sadasivan B., Lehner P. J., Ortmann B., et al. // Immunity. 1996. V. 5. P. 103-114.
46. Cheng W.F., Hung C.F., Chai C.Y., et al. // J. Clin. Invest. 2001. V. 108. P. 669-678.
47. Cheng W.F., Hung C.F., Chen C.A., et al. // Vaccine. 2005. V. 23. P. 3864-3874.
48. Peng S., Ji H., Trimble C., et al. // J. Virol. 2004. V. 78. P. 8468-8476.
49. Hung C.F., Hsu K.F., Cheng W.F., et al. // Cancer Res. 2001. V. 61. P. 1080-1088.
50. Sominskaya I., Alekseeva E., Skrastina D., et al. // Mol. Immunol. 2006. V. 43. P. 1941-1952.
51. Klionsky D.J. and Emr S.D. // Science. 2000. V. 290. P. 1717-1721.
52. Yorimitsu T. and Klionsky D.J. // Cell. Death Differ. 2005. V. 12 Suppl. 2. P. 1542-1552.
53. Paludan C., Schmid D., Landthaler M., et al. // Science. 2005. V. 307. P. 593-596.
54. Deretic V. // Curr. Opin. Immunol. 2006. V. 18. P. 375-382.
55. Majeski A.E. and Dice J.F. // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2004. V. 36. P. 2435-2444.
56. Prlic M., Williams M.A., Bevan M.J. // Curr. Opin. Immunol. 2007. V. 19. P. 315-319.
57. Epstein J.E., Gorak E.J., Charoenvit Y., et al. // Hum. Gene. Ther. 2002. V. 13. P. 1551-1560.
58. Bonifacino J.S. and Glick B.S. // Cell. 2004. V. 116. P. 153-166.
59. Bonifacino J.S. and Dell'Angelica E.C. // J. Cell. Biol. 1999. V. 145. P. 923-926.
60. Letourneur F. and Klausner R.D. // Cell. 1992. V. 69. P. 1143-1157.
61. Helenius A. and Aebi M. // Annu. Rev. Biochem. 2004. V. 73. P. 1019 -1049.
62. Baranski T.J., Faust P.L. and Kornfeld S. // Cell. 1990. V. 63. P. 281-291.
63. Steet R., Lee W.S. and Kornfeld S. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 33318-33323.
64. Munz C. // Cell. Microbiol. 2006. V. 8. P. 891-898.
65. Odorizzi C.G., Trowbridge I.S., Xue L., et al. // J. Cell. Biol. 1994. V. 126. P. 317-330.
66. Gupta S.N., Kloster M.M., Rodionov D.G., et al. // Eur. J. Cell. Biol. 2006. V. 85. P. 457-467.
67. Wu T.C., Guarnieri F.G., Staveley-O'Carroll K.F., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1995. V. 92. P. 11671-11675.
68. Marques E.T., Jr., Chikhlikar P., de Arruda L.B., et al. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 37926-37936.
69. Ruff A.L., Guarnieri F.G., Staveley-O'Carroll K., et al. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 8671-8678.
70. de Arruda L.B., Chikhlikar P.R., August J.T., et al. // Immunology 2004. V. 112. P. 126-133.
71. Starodubova E., Boberg A., Ivanov A., et al. // Vaccine. 2010. V. 28. P. 1975-1986.
72. Raviprakash K., Marques E., Ewing D., et al. // Virology. 2001. V. 290. P. 74-82.
73. Anwar A., Chandrasekaran A., Ng M.L., et al. // Virology. 2005. V. 332. P. 66-77.
74. Chen C.H., Wang T.L., Hung C.F., et al. // Vaccine. 2000. V. 18. P. 2015-2022.
75. Ji H., Wang T.L., Chen C.H., et al. // Hum. Gene. Ther. 1999. V. 10. P. 2727-2740.
76. Deng H., Kowalczyk D., O I., et al. // Cell. Immunol. 2002. V. 215. P. 20-31.
77. Bakke O. and Dobberstein B. // Cell. 1990. V. 63. P. 707-716.
78. Lotteau V., Teyton L., Peleraux A., et al. // Nature. 1990. V. 348. P. 600-605.
79. Sanderson S., Frauwirth K. and Shastri N. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1995. V. 92. P. 7217-7221.
80. Holst P. J., Sorensen M.R., Mandrup Jensen C.M., et al. // J. Immunol. 2008. V. 180. P. 3339-3346.
81. Mwangi W., Brown W.C., Splitter G. A., et al. // Clin. Vaccine Immunol. 2007. V. 14. P. 304-311.
82. Schmid D., Pypaert M. and Munz C. // Immunity. 2007. V. 26. P. 79-92.
83. Rosati M., von Gegerfelt A., Roth P., et al. // J. Virol. 2005. V. 79. P. 8480-8492.
