CC BY
81
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2013 БИОЛОГИЯ Вып. 3
УДК 612.018:612.017.1:611.018.53
РЕГУЛЯЦИЯ ЛЕПТИНОМ И ГРЕЛИНОМ АПОПТОЗА CD4+-ЛИМФОЦИТОВ IN VITRO
Е. Г. Орловаa, С. В. Ширшевa b
a Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13; orlova_katy@mail.ru
b Пермский государственный национальный исследовательский университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; shirshev@iegm.ru; (342)2808431
Изучены эффекты лептина и грелина в концентрациях, сопоставимых с содержанием гормонов в периферической крови при беременности, в регуляции апоптоза CD4+-лимфоцитов периферической крови в системе in vitro.
Ключевые слова: лептин; грелин; CD4+-лимфоциты; апоптоз.
Введение
Пептидные гормоны - лептин и грелин, являются реципрокными регуляторами метаболизма жировой ткани, энергетического обмена и пищевого поведения организма человека [Tena-Sempere, 2007]. При беременности жировой обмен претерпевает существенные изменения, а уровень лептина и грелина в периферической крови меняется в зависимости от срока беременности [Hardie, Trayhurn, 1997; Fuglsang et al., 2005]. Оба гормона активно вырабатываются плацентой, тканями эмбриона и играют важную роль на всех этапах гестации, контролируя процессы имплантации, а также рост и развитие плода [Tena-Sempere, 2007]. Лептин является провоспалительным гормоном и способствует преобладанию клеточно-опосредованного иммунного ответа [Liu et al., 2011]. Грелин обладает противовоспалительными эффектами и оказывает антагонистическое действие по отношению к эффектам лептина [Annunziato et al., 2008]. Поэтому изучение роли этих гормонов в контроле иммунных реакций при беременности является актуальным.
Беременность сопровождается формированием состоянием толерантности иммунной системы матери к генетически чужеродному плоду [Ширшев, 2009]. Согласно современным представлениям одним из значимых механизмов поддержания иммунологической толерантности при беременности является сдвиг баланса регуляторных субпопуляций IL-17-продуцирующих лимфоцитов (ТЫ7)/Т-регу-ляторных лимфоцитов (Treg) в сторону увеличения Treg, обладающих иммуносупрессорной активностью [Heikkinen et al., 2004]. В наших исследованиях было показано, что лептин и грелин в концен-
трациях, характерных для беременности, разно-направлено регулируют баланс Treg/Th17 [Орлова,
2011, 2012]. Известно, что апоптоз является ведущим факторов контроля активации и регуляции числа клеток. Ранее в наших исследованиях показано, что лептин и грелин оппозитно контролируют апоптоз лимфоцитов периферической крови при беременности [Орлова, Ширшев, 2010]. Наивные CD4+-лимфоциты периферической крови, из которых дифференцируются Treg и Th17, экспрессируют рецепторы как к лептину [Liu et al . , 2011], так и к грелину [Fuglsang et al., 2005]. Поэтому важно оценить влияние этих гормонов на апоптоз CD4+-лимфоцитов периферической крови как на возможный механизм регуляции лептином и гре-лином баланса Treg/Th17.
Цель работы - изучить влияние лептина и гре-лина, а также их совместные эффекты в концентрациях, отражающих уровень гормонов в периферической крови при беременности, на апоптоз CD4+-лимфоцитов в системе in vitro.
Материалы и методы
В работе использовали фракционированную суспензию мононуклеарных клеток периферической крови здоровых женщин репродуктивного возраста, находящихся в ранней фолликулярной фазе менструального цикла (4-7 день). Суспензию монону-клеаров получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1.077 г/см3). Далее методом иммуномагнитной сепарации (Dynabeads Regulatory CD4+CD25+ T cell Kit; Invitrogen) из суспензии мононуклеаров выделяли CD4+-лимфоциты, CD4+CD25blight (Т-регуляторные клетки) и неактиви-
© Орлова Е.Г., Ширшев С.В., 2013
рованные Т-хелперы (CD4+CD25—лимфоциты). Чистота выделения оценивалась методом проточной цитометрии и была 90% и более.
Далее полученные субпопуляции клеток инкубировали в плоскодонном 96-луночном планшете (105кл/мл - 5 2106/мл) в полной питательной среде (среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глютамина, 5210-5М2-меркаптоэтанола, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) в течение суток при 372 в условиях 5% СО2 с гормонами. Лептин («Sigma», США) в культуры вносили в концентрации 35 нг/мл, что отражает его концентрацию в периферической крови при беременности [Hardie, Trayhurn, 1997]. Грелин («Sigma», Израиль) использовали в концентрации 0.83 нг/мл, сопоставимой с уровнем гормона в периферической крови при беременности [Fuglsang et al., 2005]. Для исследования совместных эффектов лептин и грелин в культуры вносили одномоментно. В контрольные пробы вместо гормона добавляли физиологический раствор, используемый для растворения гормонов.
Для индукции апоптоза в культуры добавляли магнитные частицы с нанесенными анти-CD3/CD28 моноклональными антителами (Dynabeads Human T-activator CD3/CD28, «Invitrogen»), имитирующими активацию лимфоцитов при контакте с антиген-презентирующими клетками.
После 24 ч. инкубации с гормонами снимали супернатант, удаляли магнитные частицы и оценивали апоптоз путем окрашивания аннексином-V (AnV-FITC) с использованием набора Annexin V -FITC Kit (IMMUNOTECH, France) методом проточной цитометрии («Becton Dickinson», США).
При учете результатов подсчитывали не менее 100000 клеток. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «Excell». При этом вычисляли среднюю арифметическую величину и ее стандартную ошибку. Поскольку выборочное распределение данных, оцениваемое по критерию Фишера, было нормальным, достоверность различий между средними величинами оценивали по парному t-критерию Стьюдента при р < 0.05.
Результаты и их обсуждение
Установлено, что лептин и грелин в дозах, характерных для беременности, не оказывают значимых эффектов на апоптоз общей популяции CD4+-лимфоцитов периферической крови, активированных через Т-клеточный рецептор и CD28 (табл. 1).
Субпопуляция CD4+-лимфоцитов периферической крови помимо остальных типов клеток включает предшественников индуцибельных Treg, а
также натуральные Treg (CD4+25bnght), формирование которых происходит в тимусе [Dons et al., 2012]. Поэтому далее оценили влияние гормонов на апоптоз натуральных Treg (CD4+25bnght) и неактивированных Т-хелперов (CD4+25"лимфоциты), которые способны трансформироваться в индуци-бельные (адаптивные) Treg [Dons et al., 2012].
Таблица 1
Влияние лептина и грелина на апоптоз CD4+-лимфоцитов in vitro (n=5)
Гормональное воздей- CD4+AnV+- лимфоциты, %
ствие
Контроль 38.77±7.8
Лептин (35 нг/мл) 55.15±9.5
Грелин (0.83 нг/мл) 55.21±17.13
Лептин (35 нг/мл) + Грелин (0.83 нг/мл) 49.45±18.24
Показано, что лептин в дозе, характерной для беременности, угнетает, а грелин не влияет на апоптоз CD4+25"лимфоцигов периферической крови (табл. 2). Однако при совместном внесении лептин и грелин снижают количество Т-хелперов (CD4+25" лимфоциты), вступивших в апоптоз, т.е. реализуются, главным образом, эффекты лептина. Учитывая результаты ранее проведенных исследований, где показано, что лептин усиливает генерацию ТЫ7 из наивных CD4+-позитивных лимфоцитов периферической крови и угнетает формирование индуцибельных Тге8, можно полагать, что ан-тиапоптотический эффект лептина в отношении как CD4+25-- лимфоцитов, так и общей популяции лимфоцитов периферической крови объясняется общей провоспалительной направленностью эффектов гормона. Однако, препятствуя апоптозу CD4+25--лимфоцитов, лептин, способствует сохранению предшественников индуцибельных Treg, что важно для поддержания беременности. Причем этот эффект преобладает и при совместном внесении лептина и грелина.
Таблица 2
Влияние лептина и грелина на апоптоз CD4+25--лимфоцитов in vitro (n=11)
Гормональное воздействие CD4+25"AnV+ - лимфоциты, %
Контроль 12.19±3.25
Лептин (35 нг/мл) 8.54±2.47*
Грелин (0.83 нг/мл) 11.88±2.44
Лептин (35 нг/мл) + 8.78±1.51*
Грелин (0.83 нг/мл)
Примечание. Здесь и в табл. 3 -* - различия достоверны (р < 0.05) по парному ^критерию Стьюдента по отношению к контролю.
При анализе влияния лептина и грелина на апоптоз натуральных Тге8 периферической крови, установлено, что лептин и грелин в дозах, характерных для беременности, не оказывают значимых самостоятельных эффектов на апоптоз CD4+25bгl8ht
-лимфоцитов (табл. 3). Результатом совместного действия лептина и грелина в сочетаниях, характерных для беременности, является снижение числа натуральных Treg, вступивших в апоптоз.
Таблица 3
Влияние леитина и грелина на аиоитоз CD4+25bгight-лимфоцитов in vitro (n=6)
Гормональное воздей- CD4+25brightAnV+- лимфо-
ствие циты, %
Контроль 34.83i7.08
Лептин (35 нг/мл) 33.42i12.28
Грелин (0.83 нг/мл) 31.55i12.26
Лептин (35 нг/мл) + Грелин (0.83 нг/мл) 20.46i4.77*
Суммируя полученные результаты, можно полагать, что при беременности, регуляция лептином и грелином апоптоза CD4+-лимфоцитов периферической крови является важным механизмом гормонального контроля баланса ТЫ7/ Tгeg. Так, хотя при беременности лептин и угнетает формирование индуцибельных [Орлова, 2011], но регулируя апоптоз, гормон способствует сохранению их предшественников, не влияя на уровень натуральных периферической крови. Грелин,
напротив, усиливает формирование адаптивных Tгeg [Орлова, 2011], но при этом не влияет на апоптоз CD4+25--лимфоцитов и натуральных в периферической крови. Тогда как, действуя совместно, что ближе отражает физиологические условия беременности, лептин и грелин способствуют сохранению пула как адаптивных, так и натуральных Tгeg периферической крови. Таким образом, исследуемые гормоны играют значимую роль в поддержании периферической толерантности и сохранении беременности.
Работа поддержана программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» 12-П-4-1017.
Библиографический список
Орлова Е.Г., Ширшев С.В. Регуляция лептином и
грелином экспрессии мембранных молекул и апоптоза лимфоцитов человека при беременности // Проблемы эндокринологии. 2010. Т. 56, № 3. С. 26-30.
Орлова Е.Г. Регуляция лептином и грелином индукции Т-регуляторных лимфоцитов // Вестник Уральской медицинской академической науки.
2011. Т. 35, № 2/1. С. 55-56.
Орлова Е.Г. Роль лептина и грелина в индукции дифференцировки ^П-лимфоцитов // Вестник Уральской медицинской академической науки.
2012. № 4/(41). С. 56-57.
Ширшев С.В. Иммунология материнско-фетальных взаимодействий: монография. Екатеринбург, 2009. 582 с.
Annunziato F. et al The phenotype of human Th17 cells and their precursors, the cytokines that mediate their differentiation and the role of Th17 cells in inflammation // Int. Immunol. 2008. Vol. 20, № 11. P. 1361-1368.
Dons E.M. et al. Induced regulatory T cells: mechanisms of conversion and suppressive potential // Human Immunol. 2012. № 4. P. 328334.
Fuglsang J. et al. Ghrelin and its relationship to growth hormones during normal pregnancy // Clin. Endocrinol. 2005. Vol. 62. P. 554-559.
Hardie L., Trayhurn P. Circulating leptin in women: longitudinal study in menstrual cycle and during pregnancy // Clin. Endocrinol. 1997. Vol. 47. P. 101-106.
Heikkinen J. et al. Phenotypic characterization of regulatory T cells in the human decidua // Clin. Exp. Immunol. 2004. Vol. 136. P. 373-378.
Liu Y.S. et al. Study on the relationship between Th17 cells and unexplained recurrent spontaneous abortion // Am. J. Reprod. Immunol. 2011. Vol. 65, № 5. P. 503-511.
Tena-Sempere M. Roles of ghrelin and leptin in the control of reproductive function // Neuroendocrinology. 2007. Vol. 86. P. 229-241.
Поступила в редакцию 17.10.2013
Leptin and ghrelin regulation of CD4+-lymphocytes apoptosis in vitro E. G. Orlova, candidate of biology, senior researcher
Institute of ecology and genetics of microorganisms, Ural Branch of the RAS. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; orlova_katy@mail.ru S. V. Shirshev, doctor of medicine, professor
Institute of ecology and genetics of microorganisms, Ural Branch of the RAS. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; shirshev@iegm.ru; (342)2808431 Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990
Effects of leptin and ghrelin in concentrations comparable to hormone content in peripheral blood at pregnancy on apoptosis of CD4+-lymphocytes were analyzed in vitro.
Key words: leptin; ghrelin; CD4+-lymphocytes; apoptosis.
Орлова Екатерина Г ригорьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН
Ширшев Сергей Викторович, доктор медицинских наук, профессор
ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН
ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»
