CC BY
50
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2012 БИОЛОГИЯ Вып. 3
УДК 612.018:612.017.1:611.018.53
РЕГУЛЯЦИЯ ЛЕПТИНОМ И ГРЕЛИНОМ ПРОДУКЦИИ ИНТЕРФЕРОНА- °И ИНТЕРЛЕЙКИНА-4 В СИСТЕМЕ IN VITRO
Е. Г. Орлова3, С. В. Ширшев3 ь
11 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13;
orlova_katy@mail.ru; (342)2808431 ь Пермский государственный национальный исследовательский университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; shirshev@iegm.ru
Изучены эффекты лептина и грелина в концентрациях, сопоставимых с содержанием гормонов в периферической крови при беременности, на синтез интерферона- ° и интерлейкина-4 в культуре мононуклеарных лейкоцитов и Т-лимфоцитами периферической крови in vitro.
Ключевые слова:: лептин, грелин, продукция цитокинов.
Введение
Лептин и грелин являются пептидными гормонами, которые играют важную роль в регуляции репродуктивных процессов и иммунных реакций при беременности. Нарушение баланса этих гормонов сопряжено с дефектами репродуктивной функции вследствие срыва механизмов иммунологической толерантности [Tena-Sempere, 2007]. IFN- ° и IL-4 являются ключевыми цитокинами, продуцируемыми Т-хелперами (Th), и определяющими девиацию иммунного ответа по Thl или ТЪ2-типу [Ширшев, 2009]. Одним из наиболее важных механизмов формирования иммунологической толерантности при беременности является смещение акцента иммунных реакций по ТЬ2-типу [Ширшев, 2009]. Поэтому изучение влияния лептина и грелина на продукцию IFN- °и IL-4 Т-лимфоцитами важно для понимания роли гормонов в Th-девиации при беременности.
Цель работы - изучить влияние лептина и грелина, а также их совместные эффекты в концентрациях, отражающих уровень гормонов в периферической крови при беременности, на синтез IFN- °и IL-4 в культуре мононуклеарных лейкоцитов, а также внутриклеточную продукцию вышеупомянутых цитокинов Т-лимфоцитами в системе in vitro.
Материалы и методы
Суспензию мононуклеарных лейкоцитов (MHJ1) периферической крови здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста выделяли путем центрифугирования на градиенте плотности фикол-л-верографина. Полученную суспензию культивиро-
вали в полной питательной среде (среда 199 с добавлением 10 mM HEPES; 2 тМ L-глутамина; 100 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки) с гормонами при Ъ1гШ в условиях 5% СО- в течение суток. Лептин («Sigma», США) в культуры вносили в дозах 10 и 35 нг/мл, отражающих его содержание в периферической крови в I и во ІІ-ПІ триместрах беременности соответственно [Hardie, Trayhum, 1997]. Грелин («Sigma», Израиль) использовали в концентрациях 1.25 и 0.83 нг/мл, соответствующих уровню гормона в периферической крови в I-II и III триместрах беременности [Fuglsang et al., 2005]. Для изучения совместных эффектов лептин и грелин вносили в культуры одномоментно в сочетаниях, характерных для I-II (лептин 10 нг/мл + грелин 1.2 нг/мл) и II-III (лептин 35 нг/мл + грелин 0.87 нг/мл) триместров беременности. Помимо гормонов в ряд культур вносили также липополиса-харид (ЛПС, 100 нг/мл, «Sigma», США) и/или интерлейкин 2 (IL-2, 100 МЕ/мл, Россия). В контрольные пробы вместо гормонов добавляли равное количество их растворителя (изотонического хлорида натрия). После суточной инкубации в супернатантах культур оценивали концентрацию IFN- °и IL-4 методом ИФА с использованием коммерческих наборов «Вектор-Бест», согласно инструкции производителя.
Для активации внутриклеточного синтеза цитокинов в культуры добавляли форболмиристатацетат и иономицин, а также блокаторы внутриклеточного транспорта брефелдин А и моненсин (Cell Stimulation Cockteil and Protein Transport Inhibitors,
О Орлова E. Г., Ширшев С. В., 2012
«eBioscience», США) в соответствии с методикой производителя.
Детекцию внутриклеточной выработки цитоки-нов Т-лимфоцитами проводили методом проточной цитометрии с использованием соответствующих моноклональных антител («eBioscience», США) к поверхностным (CD3) и внутриклеточным молекулам (IFN- ° IL-4) согласно методике производителя.
Достоверность полученных результатов оценивали по парному /-критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Показано, что лептин в исследуемых дозах усиливал продукцию IFN- ° но не влиял на выработку IL-4 интактными MHJ1, а также при добавлении ЛПС (табл. 1). Грелин, напротив, не оказывал статистически значимых эффектов на выработку ШМ-° а в концентрации, сопоставимой с уровнем гор-
Влияние лептина и грелина на синтез IFN- “и IL-
мона в 1-П триместрах беременности, повышал уровень 1Ь-4 только в культурах без ЛПС. При совместном внесении гормонов в дозах, характерных для 1-П триместров беременности, выявлено снижение продукции ШМ- °в культурах без внесения ЛПС. Таким образом, можно полагать, что лептин при беременности проявляет провоспалительную активность, стимулируя выработку ШМ- ° как на фоне исходного уровня активации клеток, так и при дополнительной активации ЛПС, что некоторым образом имитирует условия развития воспаления. Грелин, повышая выработку 1Ь-4. оказывает противовоспалительное действие, которое, однако, отсутствует на фоне внесения ЛПС, что важно для понимания возможности использования гормона в терапевтических целях. Сочетанное действие лептина и грелина приводит к формированию новых кооперативных эффектов гормонов, отличных от их самостоятельных эффектов.
Таблица 1
4 в культуре МНЛ периферической крови (п = 5)
Концентрация цитокинов в супернатантах культур МНЛ, пг/мл
Экспериментальное воздействие без ЛПС с ЛПС
IFN- ° IF-4 IFN- ° IF-4
Контроль 44.2 ±21.8 5.14 ±0.78 24.4 ± 8.7 5.18 ±0.84
Лептин (10 нг/мл) 89.14 ± 18.18 4.15 ±0.99 95.4 ±28.7* 6.12 ± 1.22
Лептин (35 нг/мл) 99.04 ± 15.35* 5.78 ±0.69 110.18 ±36.7* 6.78 ± 1.01
Грелин (1.2 нг/мл) 50.14 ±28.18 7.09 ±0.92* 15.1 ±7.26 5.8 ± 0.31
Грелин (0.87 нг/мл) 20.21 ± 14.0 5.68 ± 1.05 13.8 ±5.52 5.35 ±0.96
Лептин + Грелин (10 нг/мл +1.2 нг/мл) 8.9 ± 0.83* 5.42 ± 1.04 10.65 ±8.06 4.94 ± 1.15
Лептин + Грелин (35 нг/мл + 0.87 нг/мл) 17.6 ±5.08 5.31 ±0.68 29.2 ±22.9 4.98 ± 1.2
Примечание. * - различия достоверны (р < 0.05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю.
При культивировании клеток совместно с 1Ь-2 лептин вне зависимости от дозы стимулирует выработку ШМ- ° однако эти эффекты отсутствуют при внесении в культуру ЛПС (табл. 2). Возможно, это объясняется избыточной активацией клеток при совместном культивировании с 1Ь-2 и ЛПС, так что на этом фоне лептин не оказывает значимых эффектов на продукцию ШМ- ? Грелин, в концентрации,
сопоставимой с уровнем гормона в 1-П триместрах беременности, снижает продукцию ШМ- °и не влияет на выработку 1Ь-4. Тогда как при совместном внесении лептина и грелина на фоне 1Ь-2 модулирующих эффектов гормонов на синтез ШМ- °и 1Ь-4 в культурах МНЛ не выявлено. Таким образом, активация клеток 1Ь-2 меняет направленность эффектов гормонов на продукцию исследуемых цитокинов.
Таблица 2
Влияние лептина и грелина на синтез ПЭД- °и 1Ь-4 в культуре МНЛ периферической крови
на фоне активации 1Ь-2 (п = 5)
Концентрация цитокинов в супернатантах культур МНЛ, пг/мл
Экспериментальное воздействие без ЛПС с ЛПС
IFN- ° IF-4 IFN- ° IF-4
Контроль 51.28±9.02 4.93±0.96 195.65±91.43 4.7 ±1.03
Лептин (10 нг/мл) 134.12±59.11 * 7.85±1.84 358.Ш25.2 5.58±1.15
Лептин (35 нг/мл) 151.32±44.02* 5.44±1.78 428.8±161.2 3.8 ±1.25
Грелин (1.2 нг/мл) 34.9±8.26* 4.8±0.86 252.1±116.39 5.28±0.98
Грелин (0.87 нг/мл) 59.32±13.04 4.6±1.05 120.5±51.2 5.75±1.28
Лептин + Грелин (10 нг/мл + 1.2 нг/мл) 60.04±13.27 5.96±0.71 401.8 ±262.2 5.87±0.74
Лептин + Грелин (35 нг/мл + 0.87 нг/мл) 46.56±11.68 5.56±0.78 209.7 ±140.3 6.03±0.66
Примечание. * - различия достоверны (р < 0.05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю.
Поскольку основными продуцентами ШМ- °и 1Ь- оценить влияние гормонов на внутриклеточный
4 являются Т-лимфоциты, представлялось важным синтез этих цитокинов СЭЗ - лимфоцитами.
Установлено, что грелин не влиял на процессы трансляции П'Ы- ? но стимулировал внутриклеточный синтез 1Ь-4 СОЗ - лимфоцитами (табл. 3). Лептин в исследуемых дозах не оказывал влияния на
синтез изучаемых цитокинов Т-лимфоцитами. При совместном внесении гормонов выявлялся только стимулирующий эффект грелина в отношении синтеза 1Ь-4 СОЗ -лимфоцитами.
Таблица 3
Влияние лептина и грелина на внутриклеточный синтез ВШ- °и 1Ь-4 Т-лимфоцитами
периферической крови (п = 6)
Экспериментальное воздействие Процентное содержание Т-лимфоцитов, продуцирующих IFN- °или IL-4
CD3+IFN- й CD3TT-4'
Контроль 3.05 э^.07 2.8611.58
Лептин (10 нг/мл) 4.13 э^.65 3.75Ц.97
Лептин (35 нг/мл) 2.77ІІ.76 4.16 9І.86
Грелин (1.2 нг/мл) 4.56 9^.92 5.21 э^.77*
Грелин (0.87 нг/мл) 5.42 9^.56 6.9 э^.94*
Лептин + Грелин (10 нг/мл +1.2 нг/мл) 5.38Ц.48 6.99 І?. 5*
Лептин + Грелин (35 нг/мл + 0.87 нг/мл) 4.51 9^.65 5.68 9^.46*
Примечание. * - различия достоверны (р < 0.05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю.
Анализируя механизмы действия гормонов, можно полагать, что поскольку стимулирующий эффект лептина на продукцию IFN- °выявлен только в культуре МНЛ, возможно, что действие гормона опосредовано через моноциты, взаимодействие лимфоцитов с которыми и приводит к усилению выработки IFN- ? Грелин, напротив, в концентрациях, характерных для беременности, по-видимому, путем непосредственного взаимодействия с Т-лимфоцитами, усиливает процессы трансляции IL-4 CD3+- лимфоцитами периферической крови. Причем этот эффект превалирует при сочетанном внесении гормонов в культуры лимфоцитов, но не мононуклеаров. Из чего следует, что присутствие моноцитов влияет на эффекты грелина на лимфоциты. Возможно, что грелин преимущественно будет связываться с моноцитами, поскольку, по данным литературы, именно моноциты обладают наибольшей плотностью рецепторов к лептину и гре-лину, повышающейся при активации клеток [Dixit etai., 2003; 2004].
Суммируя полученные результаты, можно полагать, что лептин и грелин, которые являются разнонаправленными регуляторами энергетического обмена и оказывают оппозитные эффекты на направленность иммунных реакций, в концентрациях, характерных для беременности, при сочетанном внесении высту пают факторами, способствующими смещению иммунных реакций по Т112-типу и поддержанию иммунологической толерантности.
Впервые показано, что при совместном внесении гормонов реализуются только эффекты грели-
на, стимулирующий синтез ИЛ-4, и оказывающий фетопротективный эффект.
Работа поддержана программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» 12-П-4-1017
Библиографический список
Ширшев С.В. Иммунология материнско-фетальных взаимодействий: монография. Екатеринбург, 2009. 582 с.
Dixit I './>. et al. Leptin induces growth hormone secretion from peripheral blood mononuclear cells via a protein kinase C- and nitric oxide-dependent mechanism//Endocrinol. 2003. Vol. 144. P. 5595. Dixit V.D. et al. Glirelin inhibits leptin- and activation-induced proinflammatory cytokine expression by human monocytes and T cells // J. Clin. Invest. 2004. Vol. 1. P. 57-66.
Fuglsang J. et al. Ghrelin and its relationship to growth hormones during normal pregnancy 11 Clin. Endocrinol. 2005. Vol. 62. P. 554-559.
Hardie L., Travhurn P. Circulating leptin in women: longitudinal study in menstrual cycle and during pregnancy // Clin. Endocrinol. 1997. Vol. 47. P. 101-106.’
Tena-Sempere M. Roles of ghrelin and leptin in the control of reproductive function // Neuroendocrinology. 2007. Vol. 86. P. 229-241.
Поступила в редакцию 02.11.2012
Regulation of leptin and ghrelin of interferon- °and interleukin-4 production in vitro E. G. Orlova, candidate of biology, senior researcher
Institute of ecology and genetics of microorganisms, Ural Branch of the RAS, 13, Golev Str., Perm, Russia, 614081; orlova_katy@mail.ru, (342)2808431 S. V. Shirshev, doctor of medicin, professor
Institute of ecology and genetics of microorganisms, Ural Branch of the RAS, 13, Golev Str., Perm, Russia, 614081 Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; shirshev@iegm.ru
Effects of leptin and ghrelin in concentrations comparable to hormone content in peripheral blood at pregnancy on interferon- °and interleukin-4 production by T-lymphocytes and in mononuclear leukocyte culture were analyzed in vitro.
Key words: leptin; ghrelin; cytokine production.
Орлова Екатерина Григорьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» Уральского отделения РАН
Ширшев Сергей Викторович, доктор медицинских наук, профессор
ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» Уральского отделения РАН
ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»
