CC BY
68
РЕГУЛЯЦИЯ АПОПТОЗА В ХОРИОНЕ ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕРЕМЕННОСТИ И САМОПРОИЗВОЛЬНОМ ВЫКИДЫШЕ В I ТРИМЕСТРЕ
З.М. СОХОВА, М.Г. ЛЕБЕДЕВА, Н.П. ЕРМОЛОВА, Т.П. ГОЛИКОВА
Кафедра акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Российского университета дружбы народов
ул. Миклухо- Маклая, 8, Медицинский факультет, 117198 Москва, Россия
Цель исследования: определить физиологические изменения процессов апоптоза при неосложненной беременности и его нарушений при самопроизвольном выкидыше.
Обследовано 45 беременных в сроки гестации от 6 до 12 недель, разделенных на две группы: 20 здоровых, пожелавших прервать беременность методом хирургического аборта (I), 25 - с самопроизвольным абортом (II). Методы исследования: иммуноферментный анализ ELIZA (ФНО-а, ИЛ-6), метод проточной цитофлуори-метрии с использованием моноклональных антител, меченных ФИТЦ к CD-95 и аннексин - V.
Результаты исследования показали, что латентно существующий до беременности воспалительный процесс в эндометрии приводит к увеличению ИЛ-6 - вероятного маркера внутриутробной инфекции в отделяемом и клетках слизистой цервикального канала с ранних сроков беременности, индукции апоптоза и последующему прерыванию беременности.
Ключевые слова: апоптоз, цитокины, самопроизвольный выкидыш, хорион.
Гибель клеток играет важную роль в эмбриогенезе, морфогенезе, дифференцировке, поддержании клеточного и тканевого гомеостаза. Апоптоз, или запрограммированная смерть клетки, представляет собой процесс, посредством которого внутренние или внешние факторы, активируя генетическую программу, приводят к гибели клетки и ее эффективному удалению из ткани - единственный механизм уничтожения клеток, ненужных для дальнейшего развития организма [3], - является одной из форм гибели клеток, характеризующейся специфической фрагментацией ДНК, конденсацией цитоплазмы, блеббингом цитоплазматической мембраны и митохондриальной дисфункцией.
Несмотря на большое количество экспериментальных данных, до сих пор остаются не исследованными механизмы этого явления, не до конца выяснена регуляция апоптоза отдельных клеток в целостном многоклеточном организме. Актуальность этой проблемы определяется взаимосвязью нарушения регуляции процесса запрограммированной гибели клеток с большинством заболеваний. Выявление конкретных механизмов нарушения регуляции апоптоза позволяет уточнить этиологию, патогенез заболеваний и впоследствии определить возможность коррекции нарушений регуляции запрограммированной гибели клетки.
При изучении процессов апоптоза было выявлено, что подавление материнской иммунной реакции натуральных киллеров на фетальные антигены начинается в преим-плантационном периоде, когда преимплантационные эмбрионы вплоть до стадии бластоцисты секретируют фактор некроза опухоли альфа (ФНОа, TNFa), который, не участвуя в эмбриогенезе, обеспечивает выживание эмбриона. Сами эмбрионы состоят из клеток, не имеющих к нему рецепторов [14]. Эмбрионы благополучно развиваются до 6-8-клеточной стадии лишь при достаточном количестве белков материнского происхождения с антиапоптотической активностью для подавления активности апоптотического агониста, кодированного геном Ьах семейства bcl-2 генов (англ. “В-cell lymphoma/leukemia-2”) - Вах и рецептора семейства фактора некроза опухоли Fas/APO-1 (FasR, CD95), в дальнейшем у них инициируется транскрипция собственных генов, су-прессирующих программу апоптоза.
При определении степени апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови женщин в различные сроки беременности и вне беременности методом TUNEL (TdT-mediated dUTR-biotin nick end-labeling) выявлено увеличение степени апоптоза в течение беременности соответственно гестационному сроку при физиологической беременности, тогда как при беременности плодом с хромосомными аномалиями апоптоз был в 2,5 раза
выше, что, возможно, связано с присутствием свободной фетальной ДНК в материнской сыворотке крови [13]. В то же время не было различий в уровне апоптоза в образцах хориона при беременности плодом с хромосомными аномалиями и физиологической беременности [10, 17].
Исследуя экспрессию Fas и его лиганда - Fas - ligand (Fas-L) в децидуальной оболочке и трофобласте, выявили выраженную экспрессию Fas - ligand на трофобластиче-ских клетках со стороны децидуальной оболочки, что может играть важную роль в поддержании иммунопривилегии в беременной матке, обеспечивая трофобластические клетки защитным механизмом против активированных материнских лейкоцитов [11, 12], и наоборот, апоптоз, опосредованный Fas - Fas-L- системой, может быть ассоциирован с материнской иммунотолерантностью к плоду [5, 9].
Исследование Fas и Fas-ligand в децидуальной оболочке при физиологической беременности и самопроизвольном выкидыше выявило аномальный апоптоз в децидуальной оболочке в течение первого триместра, что может быть одним из механизмов самопроизвольного аборта, и Fas может играть важную роль в индукции апоптоза [7, 16]. Таким образом, можно отметить, что многие патогенетические механизмы развития осложнений в первом триместре беременности, возможно, связаны с нарушениями апоптоза.
Целью исследования стало определение физиологических изменений процессов апоптоза при неосложненной беременности и его нарушений при самопроизвольном аборте.
Материалы и методы исследования. В основу работы положены данные клинических наблюдений 45 пациенток в возрасте от 19 до 40 лет с физиологической и осложненной беременностью в сроки гестации от 6 до 12 недель. Пациентки были распределены на группы в зависимости от течения данной беременности: I группу составили 20 беременных с течением гестационного периода без осложнений (контрольная группа), обратившиеся в клинику для производства артифициального аборта; II - 25 женщин с самопроизвольным выкидышем.
Определение клеточных маркеров апоптоза (Fas-позитивных клеток и аннексин-V-связывающих клеток) проводили методом проточной цитофлуориметрии на приборе «Bryte HS» (США) с использованием моноклональных антител к CD-95, меченному FITC («Becton Dickinson», США) и с помощью двойного окрашивания клеток антителами к аннексии-V, конъюгированному с FITC (“Caltag”, США) и пропидием йодида (PI).
Уровни цитокинов в сыворотке крови, слизи и клетках цервикального канала определяли методом иммуноферментного анализа ELIZA с использованием наборов “Cytim-mune” (США). Регистрацию результатов осуществляли с помощью автоматического фотометра “Microplate rider Model 550” (Bio-rad, США) при длине волны 492 нм.
Полученные показатели у обследованных пациенток обработаны методом вариационной математической статистики.
Результаты и обсуждение.
При определении основных клеточных маркеров апоптоза в децидуальной ткани и хорионе при физиологическом течении беременности уровень экспрессии Fas-R в децидуальной ткани в среднем составил 4,6±1,2%, в хорионе - 9,2±1,2%. Уровень аннексин-V-связывающих клеток в хорионе составил 6,5±1,4%, в децидуальной ткани - 4,6±1,2% (рис. 1,2).
Представив полученные данные в предложенном нами соотношении Fas-R/ аннек-син-У-связывающих клеток, можно отметить, что при физиологическом течении беременности этот коэффициент равен ~ 1,4 в хорионе и ~ 1 в децидуальной ткани, то есть сохраняется гомеостаз между рецепцией и элиминацией клеток с помощью Fas-индуцированного апоптоза (табл.1).
Таблица 1
Процентное содержание С095+ и аннекснн-У-связываюших клеток в хорионе
и децидуальной ткани
Г руппы п Хорион Децидуальная ткань
CD95 аннексин-У CD95 аннексин-У
I 20 9,2±1,2 6,5±1,4 4,6± 1,2 4,6±1,2
II 25 7,8±1,5 9,8±2,0* 5,7±1,9 11,2±2,9*
Примечание: *- р<0,05 по сравнению с I группой.
При самопроизвольном выкидыше экспрессия маркера СБ95 на клетках, как хориона, так и децидуальной ткани приближалась к физиологическим значениям, в то время как количество аннексин-У-связывающих клеток достоверно (р<0,05) больше, чем при физиологическом течении беременности, что может свидетельствовать о повышении уровня апоптоза.
Данное наблюдение согласуется с исследованиями зарубежных авторов об увеличении числа апоптотических клеток в децидуальной ткани при самопроизвольном выкидыше [7, 16], что может являться одним из механизмов самопроизвольного аборта. Отношение Рэб-КУ аннексин-У-связывающих клеток составило ~ 0,8 в хорионе и ~ 0,5 в децидуальной ткани. Уменьшение данного коэффициента показывает увеличение числа апоптотических клеток.
Рис. 1. Экспрессия CD95 (Fas) и количество аннексин-У-связывающих клеток в хорионе
Примечание: *- р<0,05.
Провоспалительные цитокины (ФНО-а, ИЛ-6) принимают участие в росте и дифференцировке клеток цитотрофобласта, который ведет к их инвазии в стенку матки и ее сосудистую сеть, способствуя имплантации плодного яйца и развитию маточноплацентарного кровотока. Данное утверждение подкрепляется нашими исследованиями,
12
10
8
% 6
4
2
0
Рис. 2. Экспрессия CD95 (Fas) и количество аннексин-У-связывающих клеток
в децидуальной ткани
Примечание: * -р< 0,05.
которые показывают, что при неосложненном течении беременности сохраняется определенный уровень данных цитокинов в сыворотке крови и отделяемом цервикального канала, соответственно, ФНО-а - 46,2±4,7 пг/мл и 60,0±10,2 пг/мл; ИЛ-6 - 51,2± 12,0 пг/мл и 50,0±11,2 пг/мл (рис.З, 4, 5).
Исследование ИЛ-6 и ФНО-а в сыворотке крови и клетках слизистой цервикального канала обнаружило, что при самопроизвольном выкидыше происходит резкое повышение уровня ИЛ-6 в цервикальном канале, более чем в десять раз превышающее данный показатель при физиологической беременности (табл. 2). В то же время нами было установлено, что содержание ИЛ-6 в сыворотке крови также достоверно (р<0,05) повышалось, хотя указанное повышение было значительно менее выраженным. По-видимому, повышение уровня ИЛ-6 происходит вследствие длительной персистенции инфекции у женщин с самопроизвольными абортами и свидетельствует о наличии воспалительных процессов в децидуальной ткани, что, по данным зарубежных авторов, приводит к нарастанию синтеза простагландинов, провоцируя сокращения гладкой мускулатуры матки и, как следствие, самопроизвольному выкидышу [15].
Таблица 2
Уровни цитокинов в сыворотке крови и цервикальном канале
Г руппы п Сыворотка крови (Пг/мл) Цервикальный канал (Пг/мл)
ИЛ-6 ТНФ-а ИЛ-6 ТНФ-а
I 20 51,2±12,0 46,2±4,7 5 ОДЫ 1,2 60,0±10,2
11 25 131,2±32,0* 37,0±9,0 673,3±120,9* 86,6±12,5
Примечание: *- р<0,05 по сравнению с I группой.
В то же время повышенный уровень апоптоза при самопроизвольных выкидышах может быть обусловлен разрушением и изменением проницаемости мембран лизосом, выход ферментов из которых может индуцировать процессы нуклеазного «переваривания» хроматина ядра и его апоптотической деградации на фоне инфекционного генеза [2]. Несмотря на высокие уровни ИЛ-6, ФНО-а оставался в пределах физиологических значений, как в сыворотке, так и в цервикальном канале: 37,0±9,0 пг/мл и 86,6±12,5 пг/мл, соответственно (рис. 3,4). Видимо, это связано с особенностями цитокинового каскада, который заключается с начальным синтезом ФНО-а, который в ответ на низкие концентрации липополисахарида клеточной стенки (ЛПС) бактерий синтезируется активированными мононуклеарными фагоцитами, Т-лимфоцитами, естественными киллерами, а также тучными клетками и вызывает ряд иммуномодулирующих эффектов: индуцирует синтез ИЛ-6, увеличивает продукцию простагландина Е2 и др. В свою очередь, ИЛ-6 подавляет избыточную продукцию ФНО-а, что может иметь место при длительной персистенции инфекционного процесса [6, 8]. Эта особенность ИЛ-6 определяет его двойственную роль в развитии воспаления: являясь по своим эффектам типичным провоспалительным цитокином, он оказывает также противовоспалительное действие, ограничивая выработку других провоспалительных цитокинов (рис.5).
Рис. 3. Содержание ФНО-а в сыворотке крови и цервикальном канале
Примечание: статистически достоверных различий не выявлено.
Рис. 4. Уровни ИЛ-6 в сыворотке крови и цервикальном канале
Примечание: *-р<0,05.
Рис. 5. Уровни ИЛ-6 и ТНФ-альфа в цервикальном канале обследованных пациенток
Примечание: *-р<0,05.
Высокие уровни ИЛ-6 и ФНО-а обнаруживаются как в цервикальном канале, так и в сыворотке крови, что подтверждает данные литературы о повышении сывороточных уровней противоспалительных цитокинов при значительных локальных нарушениях, вследствие чего происходит их проникновение в системную циркуляцию [1, 4]. При этом установлена сильная положительная корреляционная связь между увеличением ФНО-а в сыворотке от повышения его концентраций в цервикальном канале (г=0,78). ФНО-а в сыворотке начинает появляться при концентрациях его в отделяемом цервикального канала 95 пг/мл. Но между показателями ИЛ-6 в сыворотке и цервикальном канале зависимости не выявлено.
Выводы.
1. Процессы апоптоза играют важную роль в иммунной регуляции физиологически протекающего гестационного процесса.
2. Латентно существующий до беременности инфекционный процесс в эндометрии обусловливает с ранних сроков беременности увеличение ИЛ-6 в отделяемом и клетках слизистой цервикального канала более чем в десять раз с последующей индукцией процессов апоптоза и отторжения погибшего плодного яйца.
Литература
1. Белокриницкая Т.К.. Витковский Ю.А. Цитокины в системе мать-плод при синдроме задержки развития плода // Акушерство и г инекология. - 1999. - № 5. - С. 15-17.
2. Ильинских И. Н., Бочаров Е. Ф., Ильинских И. Н Инфекционный мутагенез. - Нб.: Наука, 1982. - 168 с.
3. Лушников Е. Ф., Абросимов А.Ю. Сравнительная морфология апоптоза и некроза клеток опухолей // Тезисы 1 Белорусского съезда патологоанатомов и судебных медиков. Минск. - 1991; - № 2. - С. 292-300.
4. Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии // Иммунология. -1997. - №5. -С. 7-14.
5. Chaouat G„ Zourbas S., Ostojic S. el al. A brief review of recent data on some cytokine expressions at the ma-temo-foetal interface which might challenge the classical Thl/Th2 dichotomy // J. Reprod. Immunol. - 2002. -Vol. 53(1-2).-P. 241-256.
6. Chomarat P., Rissoan М. C., Banchereau J. et al. Interferon gamma inhibits interleukin 10 production by monocytes //J. Exp. Med. - 1993. - 1. - 177. -N2. - P. 523-527.
7. Ding F„ Fu G. Q., Xing F. Q. et al. Effect of abnormal apoptosis in human decidual tissue during early gestation on pregnancy // Di. Yi. Jun. Yi. Da. Xue. Xue. Bao. - 2002. - Vol. 22. - N 2. - P. 145-147.
8. Fortunato S. J., Menon R„ Swan K. F. et al. Interleukin-10 inhibition interleukin-6 in human amniochorionic membrane: transcriptional regulation// Am. J Obstet. Gynecol. - 1996. - Vol. 175. -N 4. - P. 1057-1065.
9. Gao F., Fu G., Ding F. et al. Apoptosis during placentation // Sheng Li Xue Bao. - 2001. - Vol. 53. - N 6. - P. 409-413.
10. Halperin R , Peller S., Rotschild M. et al. Placental apoptosis in normal and abnormal pregnancies // Gyne-col.Obstet. Invest. - 2000. - Vol. 50. - N 2. - P. 84-87.
11. Hammer A., Blaschit: A., Daxdock C. et al. Fas and Fas-ligand are expressed in the uteroplacental unit of first-trimester pregnancy// Am. J. Reprod. Immunol. - 1999. - Vol. 41. -N 1. - P.41-51.
12. Jerzak M., Bischof P. Apoptosis in the first trimester human placenta: the role in maintaining immune privilege at the matemal-foetal interface and in the trophoblast remodelling // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. - 2002. -Vol. 100.-N 2.-P. 138-142.
13. Kolialexi A., Tsangaris G.T., Antsaklis A. et at. Apoptosis in maternal peripheral blood during pregnancy // Fetal. Diagn. Ther. - 2001. - Vol. 16. - N 1. - P. 32-37.
14. Lachapelle M. H„ Miron P., Hemming R. et al. Embryonic resistance to tumor necrosis factor-a mediated cytotoxicity: a novel mechanism underlying maternal immunological tolerance to the fetal allograft // Hum. Reprod. -1993. - Vol. 8. -P. 1032-1038.
15. l.echner W., Bergant A.. Klarth C. et al. Effect of interleukin 6 on uterine contractility in the human in vivo // Z. Geburtshilfe Neonatol. - 1998. - Vol. 202. - N 1. - P. 10-13.
16. Ortega V. F., Vergara A. M„ Guerrero H. C. et al. Apoptosis in trophoblast of patients with recurrent spontaneous abortion of unidentified cause // Ginecol. Obstet. Mex. - 2000. - Vol. 68. - P. 122-131.
17. Qumsiyeh M. B., Kim K. R , Ahmed M N. et al. Cytogenetics and mechanisms of spontaneous abortions: increased apoptosis and decreased cell proliferation in chromosomally abnormal villi // Cytogenet. Cell Genet. - 2000. - Vol. 88(3-4). - P. 230-235.
THE REGULATION OF APOPTOSIS IN CHORION IN THE FIRST TRIMESTER OF PHYSIOLOGICAL PREGNANCY AND SPONTANEOUS ABORTION
Z.M. SOKHOVA, M.G. LEBEDEVA, N.P. ERMOLOVA, T.P. GOLIKOVA
Department of Obstetrics and Gynaecology with course of Perinatology Peoples’ Friendship University of Russia 8, Miklukho-Maklaya si., Medical Faculty, 117198 Moscow, Russia
The purpose: to determine the physiological alteration of apoptosis at uncomplicated pregnancy and it disorder at spontaneous abortion.
45 pregnant women in gestational age from 6 to 12 weeks divided into 2 groups were investigated: 20 healthy women, wishing were taken as conforms to interrupt pregnancy by a method of a surgical abortion, 25 - with spontaneous abortion. Methods: immunofermental method ELIZA (TNF-a, 1L-6), flow cytometric analys with FITS-labelled antibodies (CD-95, annexin - V).
The results of research have shown that the latent inflammation in endometrium before pregnancy causes the increasing of IL-6 (probable prenatal infection marker) in the cervical cells from the early term of pregnancy and induces apoptosis with consequent spontaneous abortion.
Key words: apoptosis, cytokines, spontaneous abortion, chorion.
