CC BY
31
УДК 618.3-07:616-092.19:576.36
НАРУШЕНИЕ ПРОЦЕССОВ АПОПТОЗА В ФОРМИРОВАНИИ ЗАДЕРЖКИ РАЗВИТИЯ ПЛОДА ПРИ ПРЕЖДЕВРЕМЕННЫХ РОДАХ
В.Е. РАДЗИНСКИЙ, А.А.ОРАЗМУРАДОВ, Л.М. САПАРОВА
Кафедра акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, Медицинский факультет, 117198 Москва, Россия.
Т.В. ЗЛАТОВРАТСКАЯ, Н.М. СТАРЦЕВА, В.И. ДРАГАНОВ
Городская клиническая больница № 29 Госпитальная площадь, 2, 111020 Москва, Россия.
Проведено исследование цитокинов 1Ь-6 и ТОТ-а в амниотической жидкости, а также изучеио состояние апоптоза в плаценте путем определения уровня С095+ и аннексин-У-связывающих клеток при преждевременных родах и доношенной беременности. Установлено, что формирование задержки развития плода происходит в условиях персистенции латентно существующего инфекционного процесса. Увеличение апоптотиче-ских клеток в плаценте при преждевременных родах свидетельствует об усилении процессов апоптоза в плаценте, сопоставимое с таковым показателем при доношенной беременности, что, очевидно, и является одним из ключевых механизмов преждевременных родов.
В структуре патологии перинатального периода, заболеваемости и смертности новорожденных в настоящее время наиболее высокий удельный вес имеет симптомоком-плекс плацентарной недостаточности (ПН), наиболее значимым клиническим проявлением является задержка развития плода (ЗРП), частота которой колеблется от 3 до 17,6% всех от беременностей [3, 5]. По данным В.И.Кулакова и соавт. (2002), дети, рожденные в сроки гестации 28-33 недели, в 64% имеют ЗРП и нередко имеют массу до 1000г. Несмотря на определенные успехи в реанимации и выхаживании таких маловесных детей, имеет место и обратная сторона - отдаленные результаты выхаживания маловесных детей.
Апоптоз является механизмом, который обуславливает элиминацию клеток с определенной специфичностью рецепторов. Наличие в организме физиологических факторов -индукторов и ингибиторов апоптоза свидетельствует о том, что программированная гибель клетки зависит от соотношения факторов, вызывающих апоптоз и предотвращающих его, а также от регуляторных внутриклеточных механизмов. Одним из ранних событий апоптоза является окислительное нарушение взаимосвязи цитоскелета с мембранным бислоем, за которую ответственны белки цитоскелета - аннексины. Результатом этого становится увеличение подвижности фосфатидилсерина, практически все молекулы которого в норме экспонированы в цитоплазму, но после нарушений связи мембраны и цитоскелета претерпевают «флип - флоп» - переход и частично появляются на внешней стороне бислоя, если на этой стадии будет наблюдаться нехватка энергии, то мембранные изменения не будут завершены. Целостность мембраны утрачивается, и клетка утилизируется по некротическому пути. Важными физиологическими регуляторами апоптоза являются цитокины - обширная группа белков, регулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток при связывании со специфическими рецепторами на клетках - мишенях, действующие, в отличие от гормонов, в основном, на пара - и аутокринном уровне. Цитокины разделяются на 3 основные группы в зависимости от структуры и функции: ростовые факторы (колониестимулирующие факторы, эпидермальный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста и т.д.), семейство фактора некроза опухоли (ФНО) и спиральные цитокины (интерлейкины, интерфероны). Эффект цитокинов на клетки также неоднозначен: для одних клеток они выступают в роли индуктора, а для других - ингибитора апоптоза. Это зависит от типа клетки, стадии ее дифференцировки, функционального состояния клетки [1].
Цитокины являются медиаторами сигналов, которыми обмениваются клетки трофобласта с клетками эндометрия во время имплантации. IL-6 относится к провоспалительным цито-кинам, как и IL-1, IL-8, IL-12, ФНО, которые секретируются моноцитами/ макрофагами после контакта с возбудителем. Аутокринная стимуляция макрофагов этими цитокинами сопровождается продукцией и секрецией и других биологически активных молекул: су-пероксидных и нитроксидных радикалов, простагландинов, лейкотриенов, а также индукцией экспрессии адгезивных молекул на поверхности фагоцитов. Мишенями пара-кринного действия тех же провоспалительных цитокинов становятся эндотелиальные клетки кровеносных сосудов, на которых индуцируется экспрессия адгезивных молекул, связывающих циркулирующие нейтрофилы и моноциты. Этим обеспечивается приток циркулирующих нейтрофилов, а затем и моноцитов в очаг инфекции [4}.
Отсутствие данных о взаимосвязи нарушений регуляции процессов апоптоза в формировании такой акушерской патологии как преждевременные роды и ЗРП делает необходимым дальнейшее изучение этой проблемы.
Целью настоящего исследования явилось определение физиологических изменений процессов апоптоза при неосложненной беременности в третьем триместре и возможную связь в формировании ЗРП при преждевременных родах.
Материал и методы исследования. Нами на базе отделения патологии беременных ГКБ № 29 проведен ретроспективный анализ течения беременности, родов и перинатальные исходы при ЗРП у 46 пациенток с преждевременными родами, в возрасте от 19 до 35 лет с физиологической и осложненной беременностью в третьем триместре. Все беременные были разделены на 4 группы, сопоставимые по основным характеристикам. Первую группу (контроль) составили 8 женщин с неосложненной беременностью в III триместре гестации, во вторую группу были включены 12 беременных с преждевременными родами в сроки 25-35 недель гестации, в третью вошли 13 беременных с преждевременными родами и ЗРП и четвертая группа состояла из 13 женщин с доношенной беременностью и ЗРП.
У всех беременных было проведено определение уровней цитокинов TNF-a и IL-6 в амниотической жидкости. Околоплодные воды получали при амниотомии до начала родовой деятельности (при условии отсутствия обязательного развития внутриутробного инфицировании при персистенции в цервикальном канале патогенной флоры) или перед кесаревым сечением при отсутствии безводного промежутка. Цитокины в амниотической жидкости определяли методом иммуноферментного анализа, с использованием наборов “Cytimmune” (США).
В лунки 96-луночных планшетов, сенсибилизированных мышиными моноклональными антителами к соответствующему цитокину человека, вносили по 50 мкл исследуемой амниотической жидкости. В контрольные лунки вносили по 100 мкл стандартного раствора с известным содержанием цитокина. После инкубации планшетов при 37°С в течение 30 минут каждую лунку промывали 5 раз раствором PBS с 0,5% Twin 50 с использованием автоматического прибора для отмывки “Immuno Wash” Model 1575 (Bio-Rad, США). Затем в каждую лунку вносили по 25 мкл кроличьих антител к соответствующему цитокину, конъюгированных с щелочной фосфатазой. После 3-часовой инкубации при 37°С лунки и промывания 5 раз раствором PBS-Twin, добавляли по 50 мкл козлиных антикроличьих антител, коньюгированных с щелочной фосфатазой. Планшет инкубировали при 37°С в течение 45 минут. В каждую ячейку вносили по 200 мкл окрашивающего раствора и инкубировали при 37°С в течение 25 минут.
Величину поглощения (OD) окрашенного содержимого каждой лунки определяли с помощью автоматического фотометра “Microplate rider Model 550” (Bio-rad, США) при длине волны 492 нм. На основании результатов определения окрашивания контрольных образцов строили калибровочную кривую, которая являлась основанием для определения содержания цитокина в каждой опытной лунке. Каждый образец исследовали в двух
параллельных лунках. Результаты исследования содержания цитокинов выражали в пг/мл.
Данные исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии НЦА-ГиП РАМН (руководитель - член-корр. РАМН, профессор Г. Т. Сухих).
Определение апоптоза в плаценте проводилось методом двойного окрашивания клеток антителами к аннексин-V, конъюгированному с FITC и пропидием йодида. Данный метод позволяет выявить распределение апоптотических клеток на ранней и промежуточной стадиях апоптоза по клеточному циклу (Nagata S., 1994). Для изучения процессов апоптоза готовили суспензию отдельных клеток с помощью механической дезинтеграции ткани. Плаценту измельчали ножницами и продавливали через нейлоновое сито в среду 199. Выделенные клетки многократно ресуспендировали для получения суспензии единичных клеток.
Для выделения мононуклеарных клеток из полученной суспензии и освобождения их от примеси эритроцитов использовали метод центрифугирования (20 мин при 800g) на градиенте плотности фиколла (р=1.077г/см2). Показателем уровня апоптоза являлось наличие на поверхности исследуемых клеток фосфатидилсерина и Fas/APO-1 (CD-95). Определение содержания Fas-позитивных клеток проводили с использованием моноклональных антител к CD-95, меченному FITC («Becton Dickinson», США). Количество клеток, находящихся на разных стадиях апоптоза, определяли с помощью двойного окрашивания клеток антителами к аннексин-V, конъюгированному с FITC (“Caltag”, США) и пропидием йодида (PI) - флуоресцентного красителя ДНК, позволяющего дифференцировать клетки с интактной и проницаемой (поврежденной) мембраной. По окрашивае-мости аннексином-V и PI клетки разделялись на 4 кластера: живые клетки располагались в аннексии V'/РГ кластере, кластеры аннексии V7PI' и аннексии V+/PI+ относились к апоптозным, поврежденные клетки были аннексии V'/РГ. Оценку количества CD-95+ и включающих аннексин-V - клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии на приборе «Bryte HS» (США).
Результаты исследования и обсуждение: Среди 46 беременных, поступивших в стационар, 28 пациенток (60,8%) были первородящими. Средний возраст обследованных составил 28±3,4 лет. Госпитализация проводилась в сроки 25-35 недель беременности.
Родоразрешение путем операции кесарево сечение произведено у 19 женщин (41,3%), в остальных 27 случаях имели место самопроизвольные роды. Материнской смертности не было. Перинатальная смертность в целом составила 97%о.
Определение уровня цитокина 1L-6 в амниотической жидкости обследованных женщин показало, что IL-6, относящийся к провоспалительным цитокинам, достоверно (р<0,05) повышался при ЗРП, причем прослеживалась тенденция к более выраженному его повышению при преждевременных родах (табл.1).
Таблица 1
Содержание цитокинов в амниотической жидкости
~~ Цитокины
1руипы 1L-6 TNFa
Неосложненная беременность 28,6 56,2
Преждевременные роды без ЗРП 26,3 152,4*
Преждевременные роды и ЗРП 82,6* 175*
Доношенная беременность и ЗРП 74,4* 163,3*
Примечание: р<0,05 - достоверность различий по сравнению с неосложненной беременностью.
Так, при преждевременных родах и ЗРП 1Ь-6 был выше в 2,8 раза по сравнению с неосложненной беременностью, а при доношенной беременности и ЗРП в 2,6 раза.
Вероятно, что значительное увеличение 1Ь-6 в амниотической жидкости, более чем в два раза превышающее его концентрации при неосложненной беременности, как при преждевременных, так и при доношенных родах, протекающих с крайним проявлением плацентарной недостаточности - ЗРП, свидетельствует о персистенции латентно существующего инфекционного процесса во время беременности.
Оценка содержания ТЫРа в амниотической жидкости показала достоверное его увеличение во всех основных группах.
С целью определения процессов апопоза в хорионе и децидуальной ткани нами было проведено исследование экспрессии рецептора семейства фактора некроза опухоли -Рав-Я (СЭ95+) и количество аннексин-У-связывающих клеток (табл.2).
Таблица 2
Содержание С095+ и аннексин-У-связывающих клеток в плаценте (%)
Г руппы CD95+ Аннексин-V-связывающие клетки
Неосложненная беременность 25,6 18,3
Преждевременные роды без ЗРП 32,4 25,3
Преждевременные роды и ЗРП 38,2* 33,2*
Доношенная беременность и ЗРП 34,2 31,6*
Примечание: р<0,05 - достоверность различий по сравнению с неосложненной беременностью.
Как видно из представленных данных, показатель соотношения CD95+/ аннексин-У-связывающих клеток при физиологическом течении беременности равен ~ 1,4 в плаценте, то есть сохраняется гомеостаз между рецепцией и элиминацией клеток с помощью Fas-индуцированного апоптоза.
Отношение С095*/аннексин-V-связывающих клеток в группе преждевременных родов без ЗРП приближается к физиологическим показателям, составляя ~ 1,4, в то время как при ЗРП как при доношенных, так и при преждевременных родах данный показатель снижался до ~ 1,1. Статистически значимое (р<0,05) увеличение числа аннексин-У-связывающих клеток при ЗРП может свидетельствовать о повышении уровня апоптоза.
Полученные нами данные демонстрируют отсутствие статистически значимых различий в содержание IL-6 и TNFa в амниотической жидкости при ЗРП как в случаях с доношенной беременностью, так и при преждевременных родах, что может указывать на их роль не только в формировании ЗРП, но и инициацию родового акта. Кроме того, достоверное увеличение апоптотических клеток в плаценте при преждевременных родах свидетельствует об усиление процессов апоптоза в плаценте, сопоставимое с таковым показателем при доношенной беременности, что, очевидно, и является одним из ключевых механизмов преждевременных родов.
Литература
Белушкина H.H., Хасан Хамад Али. Северин С.Е. Молекулярные основы апоптоза // Вопросы биол. мед. и фарм. химии. -1998.-№4.-С. 15-23.
2. Кулаков В.И., Серов В.Н., Сидельникова В.М. Преждевременные роды - тактика ведения с учетом сроков гестации // Журналъ акушерства и женскихъ болъзней - 2002. - Выпуск 2. -ТомЫ. - С.13- 17.
3. Павлова О.В. Задержка внутриутробного развития: особенности структурно-функциональной организации клеточных мембран. Пути коррекции: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Красноярск, 1997. - 20 с.
4. Тотолян A.A.. Фрейдлин U.C. Клетки иммунной системы. - СПб., 2000.
5. Экстраэмбриональные и околоплодные структуры при нормальной и осложненной беременности // Под ред. В.Е.Радзинского и А.П.Милованова. - М.:МИА, 2004. - 393 с.
THE PROBLEM OF APOPTOSIS IN FORMATION GROWTH OF FETAL INHIBITION FULL-TERM PREGNANCY
Z.M. SOKHOVA, A.A. ORAZMURADOV, L.M. SAPAROVA
Department of Obstetrics and Gynaecology with course of Perinatology Peoples’ Friendship University of Russia 8, Miklukho-Maklaya st., Medical Faculty, 117198 Moscow, Russia
T.V. ZLATOVRATSKAYA, N.M. STARTSEVA, V.I. DRAGANOV
Clinical hospital № 29
2, Gospitalnaya sq., 111020 Moscow, Russia
The investigation of cytokines IL - 6 and TNF - a in the amniotic fluid has been held; the condition of apoptosis in placenta while determining the level of CD 95+ and annexine V connecting cells in premature labor and full - term pregnancy has also been studied. Forming of growth of fetal inhibition develops during the persistence of latent -existing infectious process has been installed. The growth of apoptotic cells in placenta during premature labor tells about the amplification of the process of apoptosis in placenta according to the index of full - term pregnancy which obviously is one of the main mechanisms of premature birth.
