CC BY
116
УДК 579.61
Карташова О.Л., Уткина Т.М., Попова Л.П.
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, Оренбург Е-mail:[email protected]
РЕГУЛЯЦИЯ АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ И ИХ СПОСОБНОСТИ ОБРАЗОВЫВАТЬ БИОПЛЕНКИ ЭФИРНЫМИ МАСЛАМИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ
Изучено действие эфирных масел лекарственных растений на рост, антилизоцимную активность и образование биопленок Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Bacillus subtilis. Установлена способность эфирных масел багульника, воло-душки, котовника, мелколепестника подавлять рост S. aureus, эфирных масел поручейника, тимьяна, котовника и мелколепестника - рост E. coli, володушки - K. pneumoniae. Показано преимущественно ингибирующее действие изученных эфирных масел в отношении антилизо-цимного признака условно-патогенных микроорганизмов и их способности образовывать биопленки. При этом, наиболее эффективно антилизоцимную активность микроорганизмов подавляло эфирное масло дягиля, а способность образовывать биопленки - эфирное масло китага-вии байкальской. Проведенные исследования позволили отобрать перспективные для дальнейшего исследования эфирные масла, обладающие как бактерицидным действием, так и ингиби-рующим влиянием на факторы персистенции микроорганизмов.
Ключевые слова: антилизоцимная активность, биопленки, микроорганизмы, эфирные масла лекарственных растений.
Введение
Расширение спектра возбудителей внут-рибольничных инфекций, изменение их биологических свойств, устойчивость к антибиотикам и высокий уровень заболеваемости населения делают актуальным поиск альтернативных средств, обладающих широким спектром антимикробного действия [6]. В связи с этим ведется поиск новых препаратов, обладающих, с одной стороны, противомикробной активностью с отличным от привычных антибиотиков механизмом, и с другой - лишенных побочных эффектов. Перспективными являются биологически активные вещества растительного происхождения - растительные ароматические биорегуляторы, к которым относятся эфирные масла [5]. В последние годы множество работ посвящено изучению их антимикробной активности [2, 10, 11, 12, 15]. В то же время внимание исследователей направлено на поиск эфирных масел, подавляющих персистентный потенциал патогена [8, 13], что затрудняет его паразитиро-вание в организме хозяина и способствует быстрой элиминации из очага воспаления [3].
В связи с этим, целью данной работы явилось изучение влияния эфирных масел лекарственных растений Южной Сибири на рост, антилизоцимную активность условно-патогенных микроорганизмов и их способность образовывать биопленки.
Материалы и методы
Материалом для исследования послужили: эфирные масла (ЭМ) лекарственных растений: горичника Моррисона (Peucedanum mo-rissonii), циперуса (Zontik), китагавии байкальской (Kitagawia baikalensis), багульника болотного (Ledum palustre), володушки (Buplerum sp.), котовника (Nepeta sp.), поручейника (Sium sp.), мелколепестника канадского (Coniza Canadensis), дягиля (Angelica sp.), тимьяна (Thymus sp.), жабрицы (Seseli sp.), шизонепеты многонадре-занной (Schizonepeta multifida), полученных из свежесобранного растительного сырья методом пародистилляции в ходе экспедиционных исследований в различных регионах Южной Сибири (Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН);
микроорганизмы Klebsiella pneumoniae (n=6), Escherichia coli (n=6), Staphylococcus aureus (n=6), Candida albicans (n=6), Bacillus subtilis (n=6) из коллекции ИКВС УрО РАН.
Антибактериальную активность эфирных масел определяли по М.О. Биргеру [1]. Антилизоцимную активность (АЛА) определяли фотометрическим методом по О.В. Бухарину с соавт. [3]. Образование биопленок (ОБ) микроорганизмами оценивали по степени связывания ими кристаллического фиолетового в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах [16]. Коэффициент биопленкообразова-ния (КБ) рассчитывали как отношение опти-
ческой плотности раствора кристаллического фиолетового, связавшегося с клетками микроорганизмов, к оптической плотности раствора в контроле. Положительными считали значения коэффициента более 1,1.
Изучение регуляции факторов персистен-ции исследуемыми эфирными маслами осуществляли по Д.А. Кириллову [9].
Результаты
На первом этапе исследования была определена антимикробная активность эфирных масел лекарственных растений. Установлено, что все они не имели фунгицидной активности, а также не оказывали бактерицидного влияния на спорообразующие палочки (B. subtilis). Бактерицидной активностью в отношении K. pneumoniae и S. aureus обладало ЭМ володушки. Выявлена антимикробная активность эфирных масел котовника и мелколепестника канадского в отношении E. coli и S. aureus. ЭМ багульника болотного обладало бактерицидным эффектом в отношении S. aureus, а ЭМ поручейника и тимьяна - E. coli.
Далее было изучено влияние ЭМ лекарственных растений, не обладающих бактерицидным действием, на АЛА микроорганизмов (таблица 1).
Из таблицы 1 видно, что изученные ЭМ однонаправлено подавляли АЛА K. pneumoniae на 60% и более (исключение - ЭМ тимьяна, ин-гибирующее признак на 40-60%).
ЭМ тимьяна ингибировало АЛА S. aureus на 40-60%, на 60% и более - ЭМ горичника Мо-риссона, циперуса, китагавии байкальской, поручейника, дягиля и шизонепеты многонадре-занной. ЭМ жабрицы не изменяло способность золотистого стафилококка к инактивации ли-зоцима хозяина.
ЭМ горичника Мориссона и китагавии байкальской подавляли способность B. subtilis инактивировать лизоцим хозяина на 20-40%, на 40-60% -тимьяна и шизонепеты многонадрезан-ной, на 60% и более - володушки, котовника, поручейника, мелколепестника канадского, дягиля и жабрицы. ЭМ багульника болотного и циперуса не оказывали влияния на изученный признак у бацилл.
Изученные ЭМ характеризовались также разнонаправленным действием в отношении АЛА E. coli и C. albicans: ингибирующим, стиму-
лирующим и индифферентным. Так, ЭМ горичника Мориссона, володушки и жабрицы инги-бировали признак на 20-40%, багульника болотного - на 40-60%, дягиля - на 60% и более. ЭМ циперуса стимулировало АЛА E. coli на 20-40%, шизонепеты многонадрезанной - на 40-60%, ЭМ китагавии байкальской не оказывало влияния на данный признак.
ЭМ мелколепестника канадского, котовника и поручейника подавляли АЛА C. albicans на 20-40%, жабрицы и шизонепеты многонадрезан-ной - на 40-60%, дягиля и володушки - на 60% и более. ЭМ багульника болотного стимулировало АЛА C. albicans на 20-40%, горичника Мориссона и циперуса - на 60% и более. ЭМ тимьяна и китагавии байкальской не оказывали влияния на способность грибов к инактивации ли-зоцима.
Далее было изучено влияние ЭМ, не обладающих бактерицидной активностью, на способность условно-патогенных микроорганизмов образовывать биопленки (таблица 2).
При изучении влияния ЭМ на ОБ K. pneumoniae и B. subtilis установлено их разнонаправленное действие.
Так, ЭМ багульника болотного, поручейника, мелколепестника канадского, дягиля и жабрицы не оказывали влияния на данный признак; под влиянием ЭМ котовника КБ K. pneu-moniae повышался на 40-60%. Под действием эфирного масла шизонепеты многонадрезанной КБ снижался на 20-40%. Действие ЭМ горичника Мориссона, циперуса, китагавии байкальской и тимьяна приводило к потере изученного признака.
ЭМ поручейника и мелколепестника канадского не оказывали влияния на биопленко-образование бацилл. Эфирное масло котовника стимулировало способность B. subtilis образовывать биопленки на 20-40%; володушки и дягиля - на 40-60%; багульника болотного, тимьяна, жабрицы и шизонепеты многонадрезан-ной - на 60% и более. Под действием ЭМ циперуса и китагавии байкальской бациллы утрачивали способность к ОБ.
Вместе с тем, ЭМ либо подавляли, либо не оказывали влияние на способность к ОБ у S. aureus, E. coli и C. albicans.
Под действием ЭМ горичника Мориссона и поручейника КБ у S. aureus снижался на 2040%. ЭМ циперуса и китагавии байкальской
Регуляция антилизоцимной активности микроорганизмов...
Карташова О.Л. и др.
подавляли способность S. aureus образовывать биопленки на 60% и более. ЭМ дягиля, тимьяна, жабрицы и шизонепеты многонадрезанной оказывали индифферентное действие на данный признак.
ЭМ циперуса, багульника болотного, дягиля, жабрицы и шизонепеты многонадрезанной
не оказывали влияния на способность E. coli образовывать биопленки. Под влиянием ЭМ горичника Мориссона, китагавии байкальской и володушки способность кишечной палочки формировать биопленки исчезала.
Влияние всех изученных эфирных масел на ОБ C. albicans приводило к утрате признака, за
Таблица 1. Влияние эфирных масел на антилизоцимную активность условно-патогенных микроорганизмов
Эфирные масла Виды микроорганизмов
K. pneumoniae E. coli C. albicans S. aureus B. subtilis
Контроль АЛА (мкг/мл*ОП) 1,2±0,001 0,62±0,02 0,45±0,01 1±0,1 0,89±0,01
Горичник Мориссона -3 -1 +3 -3 -1
Циперус -3 +1 +3 -3 0
Китагавия байкальская -3 0 0 -3 -1
Багульник болотный -3 -2 +1 Роста нет 0
Володушка Роста нет -1 -3 Роста нет -3
Котовник -3 Роста нет -1 Роста нет -3
Поручейник -3 Роста нет -1 -3 -3
Мелколепестник канадский -3 Роста нет -1 Роста нет -3
Дягиль -3 -3 -3 -3 -3
Тимьян -2 Роста нет 0 -2 -2
Жабрица -3 -1 -2 0 -3
Шизонепета многонадрезанная -3 +2 -2 -3 -2
Примечание: «0» - изменение признака на 0-20%; «1» - на 20-40%; «2» - на 40-60%; «3» - на 60% и более; «-» - подавляющее действие; «+» - стимулирующее действие
Таблица 2. Влияние эфирных масел на способность образовывать биопленки условно-патогенными
микроорганизмами
Эфирные масла Виды микроорганизмов
K. pneumoniae E. coli C. albicans S. aureus B. subtilis
Контроль КБ (усл. ед.) 2,9±0,07 1,1±0,03 1,1±0,02 1,4±0,1 1,6±0,4
Горичник Мориссона -3 -3 -3 -1 -1
Циперус -3 0 -3 -3 -3
Китагавия байкальская -3 -3 -3 -3 -3
Багульник болотный 0 0 0 Роста нет +3
Володушка Роста нет -3 -3 Роста нет +2
Котовник +2 Роста нет -3 Роста нет +1
Поручейник 0 Роста нет -3 -1 0
Мелколепестник канадский 0 Роста нет -3 Роста нет 0
Ангелика, дягиль, дудник 0 0 -3 0 +2
Тимьян -3 Роста нет -3 0 +3
Жабрица 0 0 -3 0 +3
Шизонепета многонадрезанная -1 0 -3 0 +3
Примечание: «0» - изменение признака на 0-20%; «1» - на 20-40%; «2» - на 40-60%; «3» - на 60% и более; «-» -подавляющее действие; «+» - стимулирующее действие
исключением масла багульника болотного, которое оказывало индифферентное действие.
Обсуждение
В результате проведенных исследований установлено, что ЭМ багульника, володушки, котовника, мелколепестника подавляют рост S. aureus, ЭМ поручейника, тимьяна, котовника и мелколепестника - рост E. coli, ЭМ володушки - K. pneumoniae.
Известно, что условно-патогенные микроорганизмы, стремясь выжить в условиях биотопа, реализуют персистентные свойства, к числу которых относят наличие антилизоцимной активности и образование биопленок [7]. В результате этого они приобретают способность противостоять факторам естественной резистентности макроорганизма и антимикробным
агентам различного происхождения [4, 14]. С этой точки зрения, важными являются данные об антиперсистентной активности эфирных масел лекарственных растений, полученные в ходе исследования. Установлено, что изученные эфирные масла лекарственных растений характеризовались преимущественно ин-гибирующим действием в отношении антили-зоцимного признака условно-патогенных микроорганизмов и их способности образовывать биопленки. При этом, наиболее эффективно АЛА подавляло эфирное масло дягиля, а ОБ -эфирное масло китагавии байкальской.
Проведенные исследования позволили отобрать перспективные для дальнейшего исследования ЭМ, обладающие как бактерицидным действием, так и ингибирующим влиянием на факторы персистенции микроорганизмов.
13.10.2014
Работа выполнена при поддержке программы фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 12-С-4-1022 «Регуляция биологических свойств микроорганизмов растительными экстрактами как основа разработки антибактериальных средств»
Список литературы:
1. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Москва: Медицина, 1982. -464 с.
2. Буданцев А.Л., Лесновская Е.Е. Дикорастущие полезные растения России. Санкт-Петербург, 2001. - 663 с.
3. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. Москва: Медицина, 1999. - 365 с.
4. Бухарин О.В. Экология микроорганизмов человека. Екатеринбург: УрО РАН, 2006. - 477 с.
5. Вичканова С.А. Перспективы поиска антимикробных средств среди природных веществ из высших растений // Состояние и перспективы исследований биологически активных веществ из растений и создание на их основе новых лекарственных препаратов. - 1983. - С. 107-118.
6. Водолазова С.В., Мяделец М.А., Карпова М.Р. и др. Антимикробная активность эфирных масел и водных извлечений из лекарственных растений Хакасии // Сибирский медицинский журнал. - 2011. - Т.26. - №2. - С. 54-58.
7. Ильницкая А.С., Кичикова В.В. Анализ факторов персистенции у бактерий, вегетирующих на слизистой верхних и нижних дыхательных путей у больных с острыми и хроническими бронхолегочными заболеваниями // Медицинский альманах. - 2011. - №4(17). - С.69-71.
8. Карташова О.Л., Уткина Т.М. Регуляция персистентных свойств микроорганизмов факторами различной природы (обзор) // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал). - 2013. - №1. http:// www.elmag.uran.ru
9. Кириллов Д.А. Лекарственная регуляция персистентных свойств микроорганизмов. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Оренбург, 2004. 22 с.
10. Клокова М.В., Михайлова Т.Н., Тихонов В.Н. Антимикробная активность эфирных масел некоторых видов рода багульник // Успехи в изучении природных и синтетических лекарственных средств. - 1982. - С. 138-140.
11. Мишарина Т.А., Теренина М.Б., Крикунова Н.И. Антиоксидантные свойства эфирных масел // Прикладная биохимия и микробиология. - 2009. - Т.45. - №6. - С. 710-716.
12. Струкова Е.Г. Воздействие эфирных масел сибирского региона на условно-патогенные микроорганизмы // Химия растительного сырья. - 2009. - №4. - С. 79-82.
13. Уткина Т.М., Потехина Л.П., Валышева И.В., Карташова О.Л. Влияние эфирных масел полыни на рост и персистентные свойства стафилококков // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - №6. http://www.science-education.ru/ 106-7360
14. Karen I., Kaidalu N., Spoering A. et al. Persister cells and tolerance to antimicrobial // Fems Microbial. Let. - 2004. - V.1. -№234. - P. 187.
15. Milos M., Makota D. // Food Chem. - 2012. - V.131. - P. 296-299.
16. O'Toole G.A., Kaplan A.H., Kotler R. Biofilm formation as microbial development. Ann. Rev. Microbiol. - 2000. - №4. -P. 49-76.
Карташова О.Л. и др.
Регуляция антилизоцимной активности микроорганизмов..
Сведения об авторах:
Карташова Ольга Львовна, заведующий лабораторией по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, доктор биологических наук, е-mail: [email protected]
Уткина Татьяна Михайловна, старший научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, кандидат биологических наук, е-mail: [email protected]
Попова Лидия Петровна, старший научный сотрудник лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН,
кандидат медицинских наук, е-mail: [email protected]
