CC BY
6
ВЕТЕРИНАРИЯ
Научная статья
УДК 619:579
doi: 10.37670/2073-0853-2022-97-5-171-174
Регуляция антилизоцимной активности бактериоцинсодержащими метаболитами штамма Enterococcus faecium Ef79OSAU
Евгения Викторовна Марисова, Татьяна Михайловна Пашкова,
Ольга Львовна Карташова, Мария Викторовна Сычёва
Оренбургский государственный аграрный университет, Оренбург, Россия
Аннотация. Цель исследования - экспериментально оценить регуляцию антилизоцимной активности бактериоцинсодержащими метаболитами штамма Enterococcus faecium Ef79OSAU. Материалом послужили штамм продуцент бактериоцинов E. faecium Ef79OSAU и культуры условно-патогенных микроорганизмов (Candida albicans ATCC10231, Escherichia coli АТСС 25922, Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853). Антилизоцимную активность определяли фотометрическим методом, её регуляцию бактериоцинсодержащими метаболитами энтерококка осуществляли при совместном инкубировании. Установлено преимущественно ингибирующее действие супернатанта энтерококка на способность микроорганизмов деградировать лизоцим. Доказанное статистически значимое снижение уровня антилизоцим-ного фактора Candida spp.позволяет говорить о потенциальной возможности использования метаболитов штамма E. faecium Ef79OSAU в регуляции данного персистентного свойства дрожжеподобных грибов.
Ключевые слова: Enterococcus faecium Ef79OSAU, бактериоцины, факторы персистенции, антилизо-цимная активность.
Для цитирования: Регуляция антилизоцимной активности бактериоцинсодержащими метаболитами штамма Enterococcus faecium Ef79OSAU / Е.В. Марисова, Т.М. Пашкова, О.Л. Карташова, М.В. Сычёва // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2022. № 5 (97). С. 171 - 174. https:// doi.org/10.37670/2073-0853-2022-97-5-171-174.
Original article
Regulation of antilysozyme activity by bacteriocin containing metabolites of Enterococcus faecium Ef79OSAU strain
Evgeniya V. Marisova, Tatyana M. Pashkova, Olga L. Kartashova, Maria V. Sycheva
Orenburg State Agrarian University, Orenburg, Russia
Abstract. The purpose of the study is to experimentally evaluate the regulation of antilysozyme activity by bacteriocin-containing metabolites of the Enterococcus faecium Ef79OSAU strain. The bacteriocin producing strain E. faecium Ef79OSAU and cultures of opportunistic microorganisms (Candida albicans ATCC10231, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) served as the material. Antilysozyme activity was determined by the photometric method, its regulation by bacteriocin-containing metabolites of enterococcus was carried out during joint incubation. The predominantly inhibitory effect of Enterococcus supernatant on the ability of microorganisms to degrade lysozyme has been established. A proven statistically significant decrease in the level of antilysozyme factor Candida spp. suggests the potential use of metabolites of the E. faecium Ef79OSAU strain in the regulation of this persistent property of yeast-like fungi.
Keywords: Enterococcus faecium Ef79OSAU, bacteriocins, persistence factors, antilysozyme activity.
For citation: Regulation of antilysozyme activity by bacteriocin containing metabolites of Enterococcus faecium Ef79OSAU strain / E.V. Marisova, T.M. Pashkova, O.L. Kartashova, M.V. Sycheva. Izvestia Orenburg State Agrarian University. 2022; 97(5): 171-174. (In Russ.). https://doi.org/10.37670/2073-0853-2022-97-5-171-174.
Обнаружение персистентных свойств микроорганизмов и разработка методических приёмов по их определению способствовали поиску путей управления этими признаками патогенов через их регуляцию при помощи различных абиотических и биотических факторов [1].
Фундаментальное значение этих разработок не только позволяет определить механизм регулирующего воздействия тех или иных факторов в отношении персистентного потенциала микроорганизмов [2], но и даёт возможность
охарактеризовать особенности межмикробных взаимодействий, что определяет прикладное значение указанных исследований, поскольку, по мнению ряда авторов, анализ направленности межмикробных взаимоотношений позволяет прояснить патогенез широкого спектра заболеваний [3]. Практическая значимость также заключается в возможности решения проблемы эффективного лечения больных с инфекционно-воспалительной патологией и оздоровления бактерионосителей [4].
Особое внимание исследователей в этой связи привлекают антимикробные вещества бактериального, растительного [5, 6] и животного происхождения [7, 8], которые модифицируют биологические характеристики возбудителя, в том числе его способность к персистенции. Одним из наиболее распространённых и часто встречающихся персистентных признаков микроорганизмов, определяющих длительное переживание патогена в организме хозяина, является антилизоцимная активность (АЛА) [9].
Между тем в доступной литературе отсутствуют данные о влиянии бактериоцинов энтерококков на антилизоцимный фактор условно-патогенных микроорганизмов, что и предопределило цель настоящего исследования - оценить регуляцию антилизоцимной активности бактериоцинсодер-жащими метаболитами штамма Enterococcus faecium Ef79OSAU.
Материал и методы. В качестве штамма продуцента бактериоцинов использовали авирулентную фекальную культуру E. faecium Ef79OSAU, в геноме которой имеется кластер генов, ответственных за синтез энтероцина A [10]. Для получения супернатанта (бакте-риоцинсодержащих метаболитов) энтерококка культуру инокулировали в MRS-бульоне и культивировали при 37 °C в течение 48 час. на шейкере-инкубаторе. Бесклеточный фильтрат получали путём центрифугирования при 7000 об/мин в течение 20 мин. при 6 °C, с последующим фильтрованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм (Millex-GV, Merck). О присутствии в культуральной жидкости бакте-риоцина А судили по наличию антимикробной активности фильтрата, которую устанавливали чашечным методом.
Влияние метаболитов энтерококка на анти-лизоцимную активность тест-штаммов (Candida albicans ATCC10231, Escherichia coli АТСС 25922, Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853) исследовали при совместном инкубировании. Для этого взвесь суточных агаровых культур в стерильном изотоническом растворе NaCl соинкубировали с бак-териоцинсодержащим супернатантом E. faecium Ef79OSAU в предварительно установленных минимальной подавляющей концентрации (МПК) и / МПК в течение суток при 37 °C.
Антилизоцимную активность тест-штаммов определяли по методике О.В. Бухарина с соавторами (1997) фотометрическим методом [11].
Полученные в ходе исследования численные материалы были обработаны статистически с определением средних значений, среднего квадратичного отклонения и средней ошибки средней. Достоверность различий сравниваемых показателей оценивали по t-критерию Стью-дента [12].
Статистическую обработку данных проводили с помощью автоматизированной программы Microsoft Office Excel 2010.
Результаты и обсуждение. Проведённые исследования позволили выявить преимущественно ингибирующее влияние бактериоцинсодержащих метаболитов E. faecium Ef79OSAU на анти-лизоцимную активность условно-патогенных микроорганизмов.
Наиболее эффективно антилизоцимный признак снижался у С. albicans ATCC10231 (рис. 1) под влиянием бактериоцинсодержа-щего супернатанта энтерококка в V МПК: до 0,79 ± 0,010 мкг/мл против 1,43 ± 0,080 мкг/мл в контроле (P < 0,01). Отчётливо, но в меньшей степени (на 17,6 %; P < 0,05), было выражено ингибирующее действие на антилизоцимный маркёр дрожжеподобных грибов рода Candida бактериоцинсодержащих метаболитов в МПК.
В работе C.E. Graham et al. (2017) выявлена аналогичная закономерность: энтероцин V, продуцируемый Enterococcus faecalis, ингиби-рует такой фактор персистенции грибов рода Candida, как биоплёнкообразование. Однако механизм этого явления пока не ясен и требует расшифровки [13].
Антилизоцимный признак синегнойной палочки оказался менее подвержен модифицирующему влиянию супернатанта E. faecium Ef79OSAU. Выявлено, что после воздействия бактериоцинсодержащими метаболитами энтерококка в МПК антилизоцимный признак тест-культуры значимо не изменялся. Уменьшение концентрации метаболитов до V МПК сопро-
МПК
V МПК
опыт
контроль
Здесь и далее:
* разница статистически значима между показателями контрольной и опытной групп P < 0,05; **P < 0,01.
Рис. 1 - Влияние бактериоцинсодержащих
метаболитов E. faecium Ef79OSAU на антилизоцимную активность С. albicans ATCC10231
Izvestia Orenburg State Agrarian University. 2022; 97(5)
Veterinary Sciences
вождалось статистически значимым снижением способности P. aeruginosa АТСС 27853 деградировать лизоцим (P < 0,05) (рис. 2).
Действие супернатанта энтерококка на АЛА S. aureus ATCC 6538-P имело следующие особенности: соинкубирование тест-штамма с бактериоцинсодержащими метаболитами в V МПК снижало антилизоцимную активность в среднем в 1,3 раза по сравнению с контролем (P < 0,01). Влияние же действующего вещества в МПК повышало изучаемый признак на 6,7 %.
Минимальный эффект изменения антилизо-цимной активности наблюдали после соинкуби-рования бактериоцинсодержащих метаболитов энтерококка в обеих изученных концентрациях с кишечной палочкой. Так, снижение уровня АЛА
1,8 1,6 1,4 1,2 1,0
0,6 0,4 0,2 0
И
МПК
V МПК
опыт
контроль
Рис. 2 - Изменение выраженности
антилизоцимной активности P. aeruginosa АТСС 27853 под действием бактериоцинсодержащих метаболитов энтерококка
1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0
МПК
V МПК
опыт
контроль
Рис. 3 - Изменение антилизоцимной активности E. œli АТСС 25922 под влиянием бактериоцинсодержащих метаболитов энтерококка
по сравнению с исходным на 1,5 % зарегистрировано после соинкубирования тест-культуры с супернатантом E. faecium Ef79OSAU в МПК. Статистически незначимое повышение антили-зоцимного признака на 3,9 % регистрировали после соинкубирования E. coli АТСС 25922 с супернатантом энтерококка в V МПК (рис. 3).
Выводы. Результаты экспериментального изучения влияния бактериоцинсодержащих метаболитов энтерококка на АЛА преимущественно демонстрируют снижение персистирующей способности условно-патогенных микроорганизмов по антилизоцимному признаку.
Наиболее эффективно снижалась антилизо-цимная активность грибов рода Candida, что позволяет говорить о потенциальной возможности использования метаболитов штамма E. faecium Ef79OSAU в регуляции данного персистентного свойства дрожжеподобных грибов.
Список источников
1. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина, 1999. 366 с.
2. Факторы, способствующие персистенции условно-патогенных микроорганизмов / Л.В. Михайлова,
B.О. Крамарь, Т.Н. Савченко и др. // Вестник ВолГМУ. 2010. № 4 (36). С. 76 - 79.
3. Бугеро Н.В., Потатуркина-Нестерова Н. Изменение биологических свойств энтерококков в условиях межмикробного взаимодействия с простейшими бластоцистами // Современные проблемы науки и образования. 2013. № 1. С. 331.
4. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство (медико-экологический аспект). Екатеринбург: УрО РАН. 1996. 206 с.
5. Азнабаева Л.М., Киргизова С.Б. Лекарственная регуляция антилизоцимной активности стафилококков // Современные проблемы науки и образования. 2013. № 2. С. 46 - 52.
6. Биохимические особенности и антибактериальное действие препаратов Fragaria viridis / Н.Ф. Гусев, Ю.А. Докучаева, М.В. Сычёва и др. // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2016. № 4 (60). С. 206 - 209.
7. Сычёва М.В., Шейда Е.В., Карташова О.Л. Влияние тромбодефенсинов некоторых видов животных на антилактоферриновую активность микроорганизмов // Учёные записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2010. Т. 203.
C. 256 - 259.
8. Изучение биологических эффектов антимикробных пептидов из тромбоцитов кур методом атомно-силовой микроскопии / М.В. Сычёва, Ю.И. Пешкова, А.С. Васильченко и др. // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2015. № 5 (55). С. 198 - 200.
9. Бухарин О.В., Валышев А.В. Микробные ингибиторы лизоцима // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. № 4. С. 8 - 13.
10. Genome Analysis of the Probiotic Strain Enterococcus faecium Ef79OSAU / M.V. Sycheva, E.V. Popova, Y.A. Khlopko et al. Microbiology Resource Announcements. 2021; 10(42): e00691-21. https://doi.org/10.1128/ MRA.00691-21.
11. Бухарин О.В., Валышев А.В., Елагина Н.Н. Фотометрическое определение антилизоцимной активности микроорганизмов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997. № 4. С. 117 - 120.
12. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Гос. изд-во мед. лит., 1962. 180 с.
13. Enterococcus faecalis bacteriocin EntV inhibits hyphal morphogenesis, biofilm formation, and virulence of Candida albicans / C.E. Graham, M.R. Cruz, D.A. Garsin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2017; 114(17): 4597-4512. https://doi.org/10.1073/pnas.1620432114.
References
1. Bukharin O.V. Persistence of pathogenic bacteria. M.: Medicine, 1999. 366 р.
2. Factors contributing to the persistence of opportunistic microorganisms / L.V. Mikhailova, V.O. Kramar, T.N. Savchenko et al. Bulletin of VolGMU. 2010; 4(36): 76-79.
3. Bugero N. V., Potaturkina-Nesterova N. Changes in the biological properties of enterococci under conditions of intermicrobial interaction with typical blastocysts. Modern problems of science and education. 2013; 1: 331.
4. Bukharin O.V., Usvyatsov B.Y. Bacteriocarrier (medical and ecological aspect). Yekaterinburg: Ural Branch of the Russian Academy of Sciences. 1996; 206.
5. Aznabaeva L.M., Kirgizova S.B. Drug regulation of antilysozyme activity of staphylococci. Modern Problems of Science and Education. 2013; 2: 46-52.
6. Biochemical features and antibacterial action of Fragaria viridis preparations / N.F. Gusev, Y.A. Dokuchaeva,
M.V. Sycheva et al. Izvestia Orenburg State Agrarian University. 2016; 4(60): 206-209.
7. Sycheva M.V, Sheida E.V., Kartashova O.L. Influence of thrombodefensins of some animal species on the antilactoferrin activity of microorganisms. Scientific notes Kazan Bauman State Academy of Veterinary Medicine. 2010; 203: 256-259.
8. Study of the biological effects of antimicrobial peptides from chicken platelets using atomic force microscopy / M.V. Sycheva, Yu.I. Peshkova, A.S. Vasilchenko et al. Izvestia Orenburg State Agrarian University. 2015; 5(55): 198-200.
9. Bukharin O.V, Valyshev A.V. Microbial inhibitors of lysozyme. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2006; 4: 8-13.
10. Genome Analysis of the Probiotic Strain Enterococcus faecium Ef79OSAU/ M.V Sycheva, E.V. Popova, Y.A. Khlopko et al. Microbiology Resource Announcements. 2021; 10(42): e00691-21. https://doi.org/10.1128/MRA.00691-21.
11. Bukharin O.V., Valyshev A.V., Elagina N.N. Photometric determination of anti-lysozyme activity of microorganisms. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 1997; 4: 117-120.
12. Ashmarin I.P., Vorobyov A.A. Statistical methods in microbiological research. L.: State. publishing house Med. Lit, 1962. 180 p.
13. Enterococcus faecalis bacteriocin EntV inhibits hyphal morphogenesis, biofilm formation, and virulence of Candida albicans / C.E. Graham, M.R. Cruz, D.A. Garsin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2017; 114(17): 4597-4512. https://doi.org/10.1073/pnas.1620432114.
Евгения Викторовна Марисова, аспирантка, popova_zhenechka@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-9801-1191
Татьяна Михайловна Пашкова, доктор биологических наук, профессор, pashkova070782@mail.ru Ольга Львовна Карташова, доктор биологических наук, профессор, labpersist@mail.ru Мария Викторовна Сычёва, доктор биологических наук, sycheva_maria@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-1455-1631
Evgeniya V. Marisova, postgraduate, popova_zhenechka@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-9801-1191 Tatyana M. Pashkova, Doctor of Biology, Professor, pashkova070782@mail.ru Olga L. Kartashova, Doctor of Biology, Professor, labpersist@mail.ru
Maria V. Sycheva, Doctor of Biology, sycheva_maria@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-1455-1631
Вклад авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Contribution of the authors: the authors contributed equally to this article. The authors declare no conflicts of interests. Статья поступила в редакцию 24.08.2022; одобрена после рецензирования 19.09.2022; принята к публикации 19.09.2022.
The article was submitted 24.08.2022; approved after reviewing 19.09.2022; accepted for publication 19.09.2022. -♦-
