CC BY
63
УДК 579.22 + 577.181.5 + 577.352 + 543.55
РЕГИСТРАЦИЯ ПРОЦЕССОВ РАЗРУШЕНИЯ КЛЕТОК И ИХ МЕМБРАН МЕТОДОМ ИМПЕДАНСНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
С.Е. Тарасов, Ю.В. Плеханова, А.Г. Быков, Н.В. Васильева, И.В. Кудрякова, А.Я. Валиахметов, А.Н. Решетилов
Рассмотрена возможность использования метода электрохимической импе-дансной спектроскопии (ЭИС) для количественного определения бактериальных клеток в исследуемом растворе. Метод ЭИС применен для регистрации процессов разрушения бактериальных клеток ферментным препаратом лизоамидазой, а также для процессов, происходящих с клеточной мембраной дрожжей при электропорации.
Ключевые слова: Лизис, импедансная спектроскопия, лизоамидаза, электропо-
рация.
Введение
Клеточный лизис - это разрушение клеточной мембраны, которое приводит к растворению клетки и её компонентов в окружающей среде. Лизис может происходить под действием химических веществ [1], электричества [2], а также оптического [3] или физического воздействия [4; 5]. Чаще всего клеточный лизис применяется для экстракции внутриклеточных соединений, что позволяет проводить анализ состояния клеток. Существует несколько методов регистрации клеточного лизиса, основанных либо на культивировании лизированных микроорганизмов, либо на использовании электронной спектроскопии, либо на регистрации оптической плотности суспензии клеток. Описанные методы в большинстве случаев позволяют успешно производить оценку эффективности клеточного лизиса, но все они имеют свои недостатки, такие как трудоемкость или недостаточная точность определения. Таким образом, актуальна разработка быстрых, простых и недорогих методик определения лизиса бактериальных клеток.
В последние 10 - 15 лет к традиционным методам анализа биологических систем добавился такой метод, как электрохимическая импедансная спектроскопия (ЭИС). ЭИС является мощным недеструктивным инструментом для исследования электрохимических систем, но в основном применяется при изучении коррозии, а также свойств батарей и топливных элементов [6]. Использование ЭИС для изучения биологических систем находится на достаточно ранних стадиях развития, но у метода исследования есть большой потенциал в данной области.
Первым применением ЭИС в биологии стало изучение электрических свойств отдельных тканей, но логичным следующим шагом стал переход на изучение более мелких биологических объектов, к
которым относятся отдельные клетки. У ЭИС нет никаких ограничений по размеру исследуемого образца, так что при использовании сенсоров небольшого размера, данный метод позволяет изучать свойства даже единичных клеток [7]. При этом сами электроды не оказывают большого влияния на свойства клеток, т.к. амплитуда прикладываемого тока не превышает 1 мкА [8]. После подключения электродов снимается импедансный спектр клеток, по которому определяется область частотного диапазона, изменяющаяся наиболее сильно в процессе каких-то клеточных процессов. Дальнейшие измерения возможны уже без приложения всего спектра частот, а лишь в наиболее чувствительной к изменениям области.
Целью работы являлось изучение возможности использования метода электрохимической импедансной спектроскопии для регистрации процесса разрушения клеток или нарушения целостности клеточных мембран.
Материалы и методы
Препарат ферментного комплекса лизоамидаза был выделен из культуральной жидкости Lysobacter sp. XL1 в лаборатории биохимии клеточной поверхности микроорганизмов ИБФМ РАН.
В работе использовали штамм Gluconobacter oxydans sbsp. industrius ВКМ B-1280 (Всероссийская коллекция микроорганизмов). Выращивание проводили в течение 18 - 20 ч в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 50 мл ростовой среды (сорбит - 10 %, дрожжевой экстракт -0,2 %, дистиллированная вода - 100 мл) при перемешивании (200 об/мин, 28 g). Клетки отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин. Осадок отмывали дважды калий-фосфатным буферным раствором (25 мМ, рН 6,5). Культуру поддерживали на скошенной агаризованной среде, содержащей сорбит (100 г/л или 10 %), дрожжевой экстракт (5 г/л или 0,5 %) и агар (15 г/л или 1,5 %).
Штамм Staphylococcus aureus 209P культивировали на дрожже-пептонной среде (pH 7,2), содержащей 3 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л пептона в течение 18 ч при 37 °С с аэрацией.
Штамм Micrococcus luteus B1819 выращивали на агаризованной среде (pH 7,2), содержащей 1 г/л дрожжевого экстракта, 30 г/л соевого экстракта, 5 г/л триптона и 60 г/л аминопептида, 1,5 % агара при 29 □.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae ВКМ Y-1173 из Всероссийской коллекции микроорганизмов РАН выращивали на качалке (120 об/мин) при 29 □ в течение 24 ч до стационарной стадии роста в 200 мл среды, содержавшей (г/л): глюкозу - 20; дрожжевой экстракт - 2; (NH4)2SO4 - 3; MgSO4 х 7H2O - 0,7; Ca(NO3)2 - 0,4; K2SO4 - 2,77. После культивирования клетки отделяли центрифугированием при 3000 g в течение 10 мин и дважды промывали дистиллированной водой.
Использовали печатные золотые электроды марки DRP-220AT (DropSens, Испания), которые представляли собой систему, состоящую из рабочего, вспомогательного электродов и электрода сравнения на полимерной подложке. В печатных золотых электродах рабочий и вспомогательный электроды изготовлены из золота, электрод сравнения -из серебра. Измерения с использованием печатных электродов проводились в ячейке объемом 200 мкл, образованной над поверхностью печатного электрода.
Все электрохимические измерения проводили с помощью потенциостата/гальваностата «VersaSTAT 4» с модулем FRA (Princeton Applied Research, США), обеспечивающим возможность работать в различных вариантах вольтамперометрии и электрохимической импедансной спектроскопии.
Результаты и обсуждение
Для выполнения цели исследования было поставлено две серии экспериментов, в одной из которых задачей была фиксация процесса полного разрушения клеток под действием бактериолитического препарата лизоамидазы (ЛА) [9], а в другом - регистрация возникновения пор в клеточных мембранах под действием электрического тока.
В теории фрагменты клеток обладают различной проницаемостью для электрического тока. Цитоплазма отличается высокой электропроводностью, в то время как клеточная мембрана при обычных условиях плохо проводит электрический ток. Поэтому при разрушении клеточных мембран лизоамидазой (или любым другим способом) при нарушении структуры клеточных мембран общая проводимость системы должна увеличиваться. Это правило действует в случае прикладывания переменного тока низкой частоты (ниже 50 кГц), т.к. при высоких частотах колебания структуры клетки позволяют току проходить сквозь мембрану даже без её разрушения.
Для проверки возможности использования метода было исследовано три суспензии различных микроорганизмов (грамположительные бактерии: Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus и грамотрицательные Gluconobacter oxydans) до и после после воздействия разрушающего агента - лизоамидазы. В ячейку с золотым скрин-принт электродом вливали 1мл раствора суспензии клеток (три различных вида) и измеряли импедансный спектр данной системы. Затем, ячейку промывали и заливали в нее 1 мл раствора, полученного после обработки данной суспензии раствором лизоамидазы в течении 20 минут и вновь измеряли импедансный спектр. По результатам опытов для всех трех культур значение общего сопротивления системы с раствором разрушенных клеток оказалось меньше, чем значение общего сопротивления системы с суспензией живых клеток (табл. 1). Данный
эффект соответствует теоретическим ожиданиям - сопротивление клеток с целой клеточной мембраной выше, чем сопротивление их разрушенных частей.
Таблица 1
Значения общего сопротивления системы с целыми и разрушенными
клетками
Сопротивление системы Micrococcus Staphilococcus Gluconobacter
Сопротивление системы до введения ЛА, кОм 650 750 2000
Сопротивление системы после введения ЛА, кОм 450 500 1400
Для проверки возможности детекции изменения электрохимических параметров в процессе лизиса клеток в реальном времени в ячейку заливалась суспензия бактерий, затем на 150-й секунде измерения вводили раствор лизоамидазы в концентрации 1 мг/мл. Преимущество метода спектрального импеданса в том, что в зависимости от выбранного наблюдаемого параметра и от прикладываемой частоты исследуются разные части спектра системы. В данном случае в качестве наблюдаемого параметра была выбрана емкость двойного электрического слоя (ДЭС). В теории, чем толще слой клеток, находящийся на поверхности электрода, тем выше данная емкость [7]. Соответственно, при разрушении клеток лизоамидазой значение емкости должно понижаться. Ниже представлен типичный график изменения модуля емкости системы с клетками Micrococcus luteus и Staphylococcus aureus при добавлении в систему лизоамидазы и при подаче тока частотой 100 Гц.
В случае с грамположительными бактериями емкость ДЭС действительно уменьшалась после добавления препарата лизоамидазы в суспензию клеток, что показывает теоретическую возможность использования данного метода регистрации для мониторинга процессов бактериального лизиса, однако существуют два ограничения. Во-первых, при использовании грамотрицательных бактерий (на примере Gluconobacter oxydans) уменьшение емкости ДЭС было не столь значительным, а во-вторых само добавление в систему ЛА характеризуется резким падением емкости, что не дает возможности наблюдать кинетику начала разрушения клеток.
В связи с выявленными минусами, в дальнейшем представлялось целесообразным оценить, как изменяется импеданс системы в зависимости от концентрации клеток и насколько лучше разрушение клеток детектируется при их иммобилизации в гель хитозана. Для этого измеряли импеданс двух электродов: с иммобилизованными в гель хитозана целыми клетками G. oxydans и разрушенными ультразвуком. Сопротивление
системы после разрушения клеток резко увеличивается. Если в опыте c суспензией клеток сопротивление после разрушения клеток уменьшилось с 2 МОм до 1,4 МОм, то при иммобилизации биоматериала произошло увеличение от 30 кОм до 1,5 МОм, что делает данный способ намного более чувствительным. Подобная же картина наблюдается и для клеток рода Staphylococcus но изменение менее выражено - от 90 кОм до 200 кОм.
3.20
t 310
5
3.00
m
■=£ 2.90
XI
У 2.80
ш 2.70
2.60
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Время, С
Рис. 1. Изменение модуля емкости от времени для клеток Micrococcus и клеток Staphylococcus при добавлении лизоамидазы
Данный эффект можно объяснить тем, что сам по себе иммобилизующий агент - хитозан - является практически непроводящим полимером. При иммобилизации в нем целых клеток микроорганизмов в структуре геля появляются «каналы» для тока. Хотя клетки сами по себе тоже проводят ток плохо, они все же являются лучшими проводниками, чем хитозан. При иммобилизации же разрушенных клеток в гель хитозана - структура таких «каналов» нарушается, и из-за этого резко увеличивается общее сопротивление системы.
Кроме того, была показана зависимость общего импеданса системы от количества добавленной суспензии клеток. На рис. 2 представлены пять импедансных характеристик, каждой из которых соответствует определенная концентрация G. oxydans. Как видно из графиков, наименьшее сопротивление соответствует системе с наибольшей концентрацией клеток, что коррелирует с результатами предыдущего опыта.
Таким образом, было показано, что изменение количества клеток в системе влияет на общий импеданс системы, и метод импедансной спектроскопии может использоваться для мониторинга изменения
количества биоматериала в системе. Однако общий импеданс суспензии бактериальных клеток уменьшается после добавления туда препарата лизоамидазы.
2ге; Ом
Рис. 2. Диаграммы Найквиста для суспензий с различным содержанием клеток G. oxydans (1 - 0 мг/мл клеток; 2 -10 мг/мл; 3 - 20 мг/мл; 4 - 30 мг/мл; 5 - 50 мг/мл). Zim - мнимая компонента импеданса, Zre - реальная компонента импеданса
Для более подробного изучения влияние действия лизоамидазы на клетки было проведено измерение проводимости суспензии клеток в процессе воздействия на нее препарата лизоамидазы. Для этого изучали лишь высокочастотный спектр импедансных характеристик, который соответствует сопротивлению электролита в системе.
В качестве первого эксперимента было измерено сопротивление чистого электрода в трис-буфере (pH 8,0) и после добавления лизоамидазы, после чего измерили их сопротивления электролита (биомасса не добавлялась). Сопротивление электролита после добавления препарата уменьшилось с 1,22±0,11 кОм до 1,01±0,09 кОм. Необходимо было проверить, как изменяется сопротивление электролита непосредственно при разрушении клеток лизоамидазой.
Измеряли изменение сопротивления электролита в системе непосредственно в процессе действия лизоамидазы на суспензию клеток Staphylococcus aureus. На рис. 3 кривая № 1 отражает сопротивление электролита до начала реакции в суспензии клеток (915 Ом), кривая № 2 показывает значение через 5 минут, после добавления лизоамидазы -резкий скачок до 850 Ом. Кривая № 3 - через 10 минут небольшое
смещение до 842 Ом. После окончания реакции (через 30 минут) - кривая №4, 825 Ом.
Рис. 3. Начальные точки диаграмм Найквиста для суспензии клеток Staphylococcus aureus до (1) и после добавления 50 мкл 1 мг/мл раствора лизоамидазы через 5 (2), 10 (3) и 30 (4) минут. Смещение кривой влево соответствует уменьшению сопротивления раствора. Zim - мнимая компонента импеданса, Zre - реальная компонента импеданса
Добавление лизоамидазы в раствор вызывает уменьшение сопротивления электролита, при этом разрушение клеток Staphylococcus также уменьшает сопротивление электролита, но на меньшую величину. Таким образом, можно сделать вывод, что в изменение сопротивления раствора после биологического лизиса бактерий вносят вклад как сами ионы ЛА, так и непосредственное разрушение клеток под её действием. Чтобы оценить влияние лизоамидазы на изменение сопротивления буфера, измерялась разница в сопротивлениях раствора до и после добавления ЛА для буферов с разной молярностью. Результаты представлены в табл. 2.
При измерениях с участием лизоамидазы нежелательно применять буфер с молярностью выше 50 мМ, в то время как влияние введения ли-зоамидазы на сопротивление раствора полностью исчезает лишь при использовании 100 мМ буфера. Следовательно, необходимо уменьшение концентрации лизоамидазы. При использовании 25 мМ буфера и уменьшении концентрации ЛА в 5 раз влияние лизоамидазы снижается до приемлемого (1...2 Ом), но разрушение одинакового количества бактериальных клеток происходит в 5 раз дольше, т.е. 75 минут вместо 15.
Таблица 2
Изменение сопротивления буфера при добавлении лизоамидазы
Молярность буфера, мМ АЯ при добавлении 25 мкл ЛА, Ом
10 46
12,5 37
25 25
50 5-10
75 3
100 0,5
Таким образом, авторами было показано, что метод ЭИС подходит для регистрации процессов разрушения клеток с помощью измерения сопротивления электролита. Однако, сам препарат лизоамидаза не подходит для нашей работы, т.к. является электроактивным, и сильно изменяет сопротивление электролита в первые же секунды добавления лизоамидазы в систему.
После экспериментов с ЛА было решено опробовать метод ЭИС при регистрации процессов, происходящих при нарушениях клеточной мембраны, без полного разрушения клеток. В качестве действующего агента был выбран метод электропорации, т.к. он не воздействует химически на реакционную среду, в отличие от химических порирующих агентов. Для проверки возможности детекции ионов, вытекающих в раствор в процессе электропорации клеток, были построены калибровочные кривые методом ЭИС с зависимостью сопротивления раствора от содержания в нем ионов калия и контрольная калибровочная кривая с использованием калиевого электрода. Калибровочные кривые представлены на рис. 4. Показано, что метод ЭИС предлагает чуть более высокую чувствительность при концентрации клеток 33 мг/мл, поэтому в качестве контрольного образца была использована суспензия дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКМ У-1173 с данной концентрацией.
При изучении реального образца разрушенных электропорацией клеток в суспензии концентрацией 33 мг/мл при температуре 4 °С получены следующие содержания ионов - 5,8 х 10-4 М методом ЭИС и 4,1х10-4 М калиевым электродом. Из этого можно сделать вывод, что в данных клетках содержание калия составляло 70,6 %.
Таким образом, метод ЭИС позволяет определить выход ионов из клеток во внешнюю среду, что может быть использовано для экспресс-определения эффективности работы различных препаратов. После добавления препарата к суспензии клеток и измерения импедансного спектра можно будет сделать вывод, происходит ли нарушение клеточной мембраны (если наблюдается уменьшение сопротивления электролита) или же нет. Однако, данный метод имеет 2 недостатка: 1) точно работает
только в том случае, если сам разрушающий агент не электроактивен; 2) разрушение клеток желательно проводить в той же ячейке, где и будет проводиться измерение импедансного спектра, т.к. иначе не удастся получить кинетику первых секунд разрушения мембраны и выхода раствора из цитоплазмы клеток во внешнюю среду.
12000 10000 8000 6000 к? 4000 2000 0
■ ■ ■ \ / * у /
• ♦ / / / со 2
*-—f\ 4 / ш"
/ /
_— / —
380
- 360
- 340
- 320
- 300
- 280 - 260 - 240
220 b 200 180 160
10-Ю 10-f 1Qri 10-7 10-в 10-3 10г4 10-3 10-2 №1
С ИОНОВ
10°
Рис. 4. Калибровочные кривые, полученные методом ЭИС и калиевым электродом. Красная кривая - зависимость сопротивления раствора от концентрации ионов калия на фоне 33 мг/мл клеток, полученная методом ЭИС, синяя - на фоне 100 мг/мл клеток, полученная методом ЭИС; зеленая кривая - зависимость потенциала от концентрации ионов, полученная К+-электродом
Заключение
В результате проведенных исследований показано, что метод ЭИС позволяет регистрировать изменение количества клеток в исследуемом образце по изменению общего импеданса системы. Кроме того, в случае грамположительных бактерий (напр., Staphylococcus aureus и Micrococcus luteus), возможна регистрация бактериологического лизиса клеток в реальном времени по уменьшению емкости ДЭС суспензии клеток. Препарат лизоамидаза является электроактивным веществом, поэтому использование ЭИС для оценки степени разрушения клеток при воздействии лизоамидазой затруднено и не имеет серьезных преимуществ перед существующими методами, такими как спектрофотометрия.
На примере дрожжей Saccharomyces cerevisiae показано, что методом ЭИС можно регистрировать изменения проводимости раствора в
суспензии клеток и с помощью этого оценивать влияние различных агентов на структуру клеток по выходу общего количества ионов во внешнюю среду. Данный метод может использоваться для экспресс-анализа эффективности воздействия фунгицидных препаратов на клеточные мембраны грибов.
Список литературы
1. Irimia D., Tompkins R.G., Toner M. Single-cell chemical lysis in picoliter-scale closed volumes using a microfabricated device // Anal. Chem. 2004. Vol. 75. №20. P. 6137-6143.
2. Han F., Wang Y., Bachman M. Fast electrical lysis of cells for capillary electrophoresis // Anal. Chem. 2003. Vol. 75. №15. P. 3688-3696.
3. Rau K.R., Guerra A. Investigation of laser-induced cell lysis using time-resolved imaging // Appl. Phys. Lett. 2004. Vol. 84. P. 2940.
4. Pethica B. A. Lysis by physical and chemical methods // J. Gen. Microbiol. 1958. Vol. 18. №2. P. 473-480.
5. Di Carlo D., Jeong K.H., Lee L.P. Reagentless mechanical cell lysis by nanoscale barbs in microchannels for sample preparation // Lab Chip. 2003. Vol. 3. № 4. P. 287-291.
6. Kelly R.G., Scully J.R., Buchheit R.G. Electrochemical techniques in corrosion science and engineering (1st edn.) // CRC Press. 2002. 244 p.
7. Liu J.J., Li H., Zhang F. Online impedance monitoring of yeast cell culture behaviours // Microelectronic Engineering. 2011. Vol. 88. P. 1711-1713.
8. Bard, A., Faulkner, L. Electrochemical Methods. Fundamentals and Application, 2-nd ed. // Wiley, New York. 2001. P. 368 - 414.
9. Кулаев И.С., Северин А.И., Абрамочкин Г.В. Бактериолитические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине // Вестн. АМН СССР. 1984. № 8. С. 64-69.
Тарасов Сергей Евгеньевич, асп., setar25@,gmail. com, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН,
Плеханова Юлия Викторовна, канд. биол. наук, науч. сотр., plekhanova@ibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН,
Быков Александр Геннадьевич, мл. науч. сотр., agbykov@,rambler.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН,
Васильева Наталья Валерьевна, канд. биол. наук, зав. лабораторией, Vasilyevanv@rambler.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
Кудрякова Ирина Валерьевна, мл. науч. сотр., kudryakovairina@yandex.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН,
Валиахметов Айрат Явдатович, канд. биол. наук, науч. сотр., airatv@ibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
Решетилов Анатолий Николаевич, д-р хим. наук, проф., зав. лабораторией, anatol@ibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
DETECTION OF CELL AND MEMBRANE DISINTEGRATION BY THE IMPEDANCE
SPECTROSCOPY
S.E. Tarasov, Yu.V. Plekhanova, A.G. Bykov, N.V. Vasilieva., I.V. Kudryakova, A.Ya. Valiakhmetov, A.N. Reshetilov
The possibility of using the method of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) for the quantitative determination of the presence of bacterial cells in the solution was shown. EIS was used to detect the processes of destruction of bacterial cells with lysoamidase, as well as for processes that occur with the yeast cell membrane during electroporation. Key words: lysis, impedance spectroscopy, lysoamidase, electroporation.
Tarasov Sergei Evgenievich, post-graduate student, setar25@gmail. com, Russia, Pushchino, G. K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Plekhanova Yuliya Viktorovna, candidate of biological sciences, research scientist, plekhanova@ibpm.pushchino.ru, Russia, Pushchino, G. K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Bykov Aleksandr Gennadievich, junior research scientist, agbykov@rambler.ru, Russia, Pushchino, G. K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Vasilyeva Natalia Valerievna, candidate of biological sciences, head of laboratory, Vasilyevanv@rambler.ru, Russia, Pushchino, G. K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Kudryakova Irina Valerievna, candidate of biological sciences, junior research scientist, kudryakovairina@yandex. ru, Russia, Pushchino, G. K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Valiakhmetov Airat Yavdatovich, candidate of biological sciences, research scientist, airatv@ibpm.pushchino.ru, Russia, Pushchino, G. K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Reshetilov Anatoliy Nikolaevich, doctor of chemical sciences, professor, head of laboratory, anatol@ibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, G. K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences
