CC BY
29
УДК: 543.55 + 543.554
БЕЗМЕДИАТОРНЫЙ МИКРОБНЫЙ ЭЛЕКТРОД НА ОСНОВЕ ТЕРМОРАСШИРЕННОГО ГРАФИТА
А.Е. Китова, В.В. Колесов, А.Н. Решетилов
Исследовано биоэлектрокаталитическое окисление этилового спирта целыми клетками бактерий 01исопоЪа&ег охуёат. Показано, что электроокисление этанола на биоаноде из терморасширенного графита (ТРГ) может протекать без участия медиаторов электронного транспорта. Исследование хронопотенциометрических и циклических вольтамперных характеристик показало уменьшение стационарного потенциала биоэлектродов при внесении этилового спирта (120 мВ за время 600 с), а также рост анодного тока при потенциалах электрода выше 50 мВ относительно электрода сравнения. Исследованы зависимости величины отклика ТРГ-биоэлектрода от концентрации этилового спирта и концентрации иммобилизованной биомассы. Разработанный биоэлектрод может быть использован в безреагентных биосенсорах.
Ключевые слова: 01исопоЪа&ег охуёат, терморасширенный графит, спектральный графит, этиловый спирт, биоэлектрокаталитическое окисление.
Введение
Безмедиаторный биоэлектрокатализ в последнее время часто используется в таких устройствах как биотопливные элементы и биосенсоры [1, 2]. Преимуществом использования безмедиаторного биоэлектрокатализа является минимизация потерь термодинамической эффективности биоэлектрокаталитических реакций и возможность значительного упрощения конструкции биоэлектрода [3].
Прямой перенос электронов для целых клеток, таких как Shewanella и ОеоЪа^ег был показан ранее [4-6]. Эти микроорганизмы способны к прямому переносу электронов от окисляемого субстрата на внеклеточные акцепторы электронов без использования редокс медиаторов. Бактерии ОЫсопоЪа^ег содержат мембраносвязанные дегидрогеназы (ДГ), такие как алкогольДГ, глюконатДГ фруктозоДГ, лактатДГ, для которых был показан прямой перенос электронов при окислении соответствующих субстратов [2, 3, 7-10]. Эффект прямого электроокисления глюкозы с участием Р00-зависимой глюкозоДГ наблюдался либо при использовании углеродных нанотрубок [10], либо за счет генетической модификации фермента [11, 12]. В этой связи, актуальной задачей является выяснение возможности и эффективности использования в качестве анодного биокатализатора целых микробных клеток, содержащих PQQ-зависимые дегидрогеназы.
Материал электродов, используемый при создании биотопливных элементов (БТЭ) должен быть электропроводящим, биосовместимым и химически стабильным. БТЭ на основе алкогольДГ и спектрального графита представлен в работе [9]. Модификация анода ферментного БТЭ
графеновыми нанопластинами использована в работе [13]. Терморасширенный графит (ТРГ) является графеноподобным материалом и обладает высокой электропроводностью, большой удельной поверхностью, химической стойкостью и биосовместимостью [14]. Использование данного материала для создания безмедиаторных биоэлектродов на основе мембранных фракций клеток О1исопоЬас1ег было нами показано в работе [15].
Целью настоящей работы являлось изучение возможности и условий прямого биоэлектрокаталитического окисления этилового спирта целыми клетками бактерий 01исопоЬас1ег охуйат„ иммобилизованными на терморасширенном графите.
Материалы и методы
Штамм бактерий О. охуйат ВКМ B-1280 (Всероссийская коллекция микроорганизмов). Бактерии выращивали в соответствии с методикой [16]. В качестве материала рабочих электродов использовали терморасширенный графит [14], а также спектральные графитовые электроды марки С-3М (ООО "Полипроф-Л"). Диаметр электрода из спектрального графита составлял 6 мм, высота - 1 мм. Электрод из ТРГ формировали путем прессования порошка ТРГ под давлением 150 мбар. Диаметр ТРГ-электрода составлял 12 мм.
Клетки иммобилизовали на поверхности рабочего электрода в геле низкомолекулярного хитозана (Sigma-Aldrich, США). Для этого 10 мкл клеточной биомассы (250 мг/мл) наносили на поверхность электрода и высушивали при комнатной температуре в течение часа. Затем на биоэлектроды наносили 5 мкл 2%-го раствора хитозана в 1%-й уксусной кислоте [17] и высушивали при комнатной температуре в течение 30 мин.
Циклические вольтамперограммы (ЦВА) регистрировали с использованием 3-х электродной схемы при скорости сканирования потенциала 3 мВ/с. Электродом сравнения являлся насыщенный хлорсеребряный электрод; вспомогательным электродом - платиновая пластина площадью 1,8 см . Хронопотенциометрические исследования проводили путем измерения зависимости стационарного потенциала рабочего электрода от времени относительно электрода сравнения. Все измерения проводили в 25 мМ калий-фосфатном буфере (рН 6.0). Концентрация этилового спирта в рабочем электролите составляла в различных экспериментах от 0,1 до 10 мМ. Измерения вольтамперных характеристик выполняли на гальванопотенциостате IPCmicro (ООО «Кронас», Россия).
Результаты и обсуждение
Характер изменения потенциала биоанода на основе ТРГ и клеток О. охуйат от времени приведен на рис. 1 (кривая 1). Как видно из рисунка, при внесении этилового спирта в рабочий электролит стационарный потенциал биоанода сдвигается в область отрицательных значений потенциала. Максимальное изменение потенциала рабочего ТРГ-электрода от исходного значения составляло 120 мВ (кривая 1) за время 600 с. Данный эффект можно объяснить наличием у бактерий О. охуйат PQQ-зависимой алкогольдегидрогеназы, катализирующей электроокисление этанола по механизму безмедиаторного биоэлектрокатализа [7]. На рис. 1 также приведен характер изменения потенциала биоанода на основе спектрального графита и клеток О. охуйат от времени (кривая 2). Максимальное изменение потенциала рабочего электрода от исходного значения составляло 180 мВ за 600 с. В качестве недостатка биоэлектродов из спектрального графита следует отметить нестабильность откликов электродов. Низкая стабильность, возможно, обусловлена высокой абсорбционной способностью электродов из спектрального графита вследствие пористой структуры по сравнению с электродами из ТРГ. На вставке представлены хроноамперометрические зависимости биоанодов на основе ТРГ (кривая 1) и спектрального графита (кривая 2) зарегистрированные при потенциале 400 мВ.
На рис. 2 и 3 приведены ЦВА, зарегистрированные для биоэлектродов на основе ТРГ и спектрального графита. В присутствии этилового спирта анодный ток возрастал по сравнению с контролем, в отсутствие субстрата. Увеличение анодного тока наблюдалось при потенциалах электрода выше 50 мВ относительно электрода сравнения. Изменение величины анодного тока при потенциале рабочего электрода 400 мВ относительно электрода сравнения составило ~ 10 мкА для ТРГ -электрода и 14 мкА для спектрального графита. Наблюдаемое незначительное увеличение анодного тока окисления этилового спирта может быть связано с относительно невысокой концентрацией электрокаталитически активных центров на поверхности электродов или из-за недостаточной эффективности электронного транспорта между биокатализатором и электродом.
Зависимость изменения потенциала ТРГ-биоанода от концентрации этилового спирта показана на рис. 4. Амплитуду (ДE) сигнала измеряли за время, равное 200 с. Концентрация этилового спирта 10 мМ являлась насыщающей для данного электрода.
Зависимость отклика ТРГ-биоэлектрода от количества иммобилизованной биомассы представлена на рис. 5. Измеряемая концентрация этилового спирта составляла 0,5 мМ. Концентрация биомассы для иммобилизации на электроде, равная 250 мг/мл, являлась оптимальной, так как при данной концентрации наблюдали стабильные результаты.
Время, с
Рис. 1. Изменение стационарных потенциалов от времени для ТРГ-биоанода (кривая 1) и биоанода на основе спектрального графита (кривая 2) при добавлении в электролит этилового спирта (10 мМ).
На вставке даны хроноамперометрические зависимости ТРГ-биоанода (кривая 1) и биоанода на основе спектрального графита (кривая 2) при потенциале 400 мВ после добавления в рабочий электролит
этилового спирта (10мМ)
20 -г
15 -
10 -
5 -
о
0 -
и
-5 -
нч
-10 -
-15 -
-20 -
-100
2
100
200 и, мВ
300
400
500
Рис. 2. ЦВА ТРГ-биоанода в 25 мМ калий-фосфатном буферном растворе, рН 6,0 (кривая 1) и в присутствии 10 мМ этанола (кривая 2). Скорость изменения потенциала электрода - 3мВ/с
0
20
сч
о «
-100
100
200 и, мВ
300
400
500
Рис. 3. ЦВА биоанода на основе спектрального графита в 25 мМ
калий-фосфатном буферном растворе, рН 6,0 (кривая 1) и в присутствии 10 мМ этанола (кривая 2). Скорость изменения потенциала электрода - 3мВ/с
0
Рис. 4. Зависимость изменения потенциала ТРГ-биоанода от концентрации этилового спирта
Рис. 5. Зависимость изменения потенциала ТРГ-биоанода от количества иммобилизованной биомассы
Выводы
Таким образом, показана возможность биоэлектрокаталитического окисления этанола на биоэлектродах из ТРГ и спектрального графита, модифицированных клетками О. охуйат. Электрохимическая реакция протекает по безмедиаторному механизму. Увеличение анодного тока наблюдалось при потенциалах электрода выше 50 мВ относительно
электрода сравнения (рис. 2 и 3). Получена зависимость изменения потенциала рабочего электрода ТРГ-электрода от концентрации этилового спирта (калибровочная зависимость). Электрохимическое окисление этилового спирта клетками G. oxydans происходило как на электродах из ТРГ, так и на электродах из спектрального графита. Преимуществом ТРГ является пластичность данного материала и возможность формирования электродов различных размеров и форм (в том числе электродов толщиной не более 0,1 мм). Полученные результаты могут быть использованы при разработке безреагентных биосенсоров, а также при создании безмедиаторных БТЭ.
Работа выполнена при поддержке проекта РНФ «Разработка, создание и исследование новых гибридных сенсоров, основанных на наноэлектронных, акустоэлектронных и электрохимических технологиях для биологических применений», № 18-49-08005.
Список литературы
1. Sales M.G.F., Brandâo L. Autonomous electrochemical biosensors: A new vision to direct methanol fuel cells //Biosensors and Bioelectronics. 2017. V. 98. P. 428-436.
2. Bioanode with alcohol dehydrogenase undergoing a direct electron transfer on functionalized gold nanoparticles for an application in biofuel cells for glycerol conversion / D. Ratautas, L. Tetianec, L. Marcinkevicienè [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2017. V. 98. P. 215-221.
3. The electron transfer pathway in direct electrochemical communication of fructose dehydrogenase with electrodes / S. Kawai, T. Yakushi, K. Matsushita [et al.] // Electrochemistry Communications. 2014. V. 38. P. 28-31.
4. Metagenomic insight into methanogenic reactors promoting direct interspecies electron transfer via granular activated carbon / Jeong-H. Park, Jong-H. Park, H. Je Seong [et al.] // Bioresource Technology. 2018. V. 259. P. 414-422.
5. A framework for modeling electroactive microbial biofilms performing direct electron transfer / B. Korth, L.F.M. Rosa, F. Harnisch [et al.] // Bioelectrochemistry. 2015. V. 106. Part A. P. 194-206.
6. Liu X., Wu W., Gu Z. Poly (3,4-ethylenedioxythiophene) promotes direct electron transfer at the interface between Shewanella loihica and the anode in a microbial fuel cell // Journal of Power Sources. 2015. V. 277. P. 110115.
7. Membrane-bound dehydrogenases from Gluconobacter sp.: Interfacial electrochemistry and direct bioelectrocatalysis / J. Tkac, J. Svitel, I. Vostiar [et al.] // Bioelectrochemistry. 2009. V. 76. P. 53-62.
8. Construction of a protein-engineered variant of D-fructose dehydrogenase for direct electron transfer-type bioelectrocatalysis / Y. Hibino, S. Kawai, Y. Kitazumi [et al.] // Electrochemistry Communications. 2017. V. 77. P. 112-115.
9. Ramanavicius A., Kausaite A., Ramanaviciene A. Potentiometric study of quinohemoprotein alcohol dehydrogenase immobilized on the carbon rod electrode // Sensors and Actuators B: Chemical. 2006. V. 113. № 1. P. 435444.
10. Mediatorless electron transfer in glucose dehydrogenase/laccase system adsorbed on carbon nanotubes / D. Ratautas, L. Marcinkeviciene, R. Meskys [et al.] // Electrochimica Acta. 2015. V. 174. P. 940-944.
11. Okuda J., Sode K. PQQ glucose dehydrogenase with novel electron transfer ability // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2004. V. 314. P. 793-797.
12. The electrochemical behavior of a FAD dependent glucose dehydrogenase with direct electron transfer subunit by immobilization on self-assembled monolayers / I. Lee, N. Loew, W. Tsugawa [et al.] // Bioelectrochemistry. 2018. V. 121. P. 1-6.
13. Membraneless enzymatic biofuel cells based on graphene nanosheets / C. Liu, S. Alwarappan, Z. Chen [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2010. V.25.1829-1833.
14. Композиционные материалы на основе терморасширенного графита / В.Н. Горшенев, А.С. Илюшин, В.В. Колесов [и др.] // Перспективные материалы. 2008. Вып. 6. Ч. 1. С. 351-355.
15. Mediator-free bioelectrocatalytic oxidation of ethanol on an electrode from thermally expanded graphite modified by Gluconobacter oxydans membrane fractions / A.N. Reshetilov, A.E. Kitova, V.V. Kolesov [et al.] // Electroanalysis. 2015. V. 27. № 6. P. 1443-1448.
16. Туркина М.В., Кощеенко К.А. Морфофизиологические особенности включенных в полиакриламидный гель клеток Gluconobacter oxydans // Известия Академии наук СССР. Серия биологическая. 1986. №. 8. C. 851-861.
17. A glucose biosensor based on Prussian blue/chitosan hybrid film / X. Wang, H. Gu, F. Yin [et al.] // Biosensors and Bioelectronics. 2009. V. 24. № 5. P. 1527-1530.
Китова Анна Евгеньевна, канд. биол. наук, научный сотрудник, kitova@ibpm.pushchino. ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН,
Колесов Владимир Владимирович канд. физ.-мат. наук, зав. лабораторией, kvv@cplire.ru, Россия, Москва, Институт радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова РАН,
Решетилов Анатолий Николаевич, д-р хим. наук, проф., зав. лабораторией, anatol@,ibpm.pushchino. ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН
MEDIA TORLESS MICROBIAL ELECTRODE ON THE BASIS OF THERMALLY EXPANDED GRAPHITE
A.E. Kitova, V. V. Kolesov, A.N. Reshetilov
The bioelectrocatalytic oxidation of ethanol was studied by whole cells of the bacteria Gluconobacter oxydans. It was shown that the electrooxidation of ethanol on a bioanode from thermally expanded graphite (TRG) can proceed without the participation of electron transport mediators. The study of chronopotentiometric and cyclic voltammetric characteristics showed a decrease in the steady-state potential of bioelectrodes when introducing ethanol (120 mV for a time of 600 s), as well as an increase of anode current at electrode potential greater than 50 mV relative to the reference electrode. Dependences on the response of the TRG-bioelectrode on the concentration of ethanol and the concentrations of immobilized biomass were investigated. The developed bioelectrode can be used in reagentless biosensors.
Key words: Gluconobacter oxydans, thermally expanded graphite, spectral graphite, ethanol, bioelectrocatalytic oxidation.
Kitova Anna Evgen'evna, candidate of biological sciences, researcher, kitova@,ibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Kolesov Vladimir Vladimirovich, candidate of of physical and mathematical sciences, manager of laboratory, kvv@cplire.ru, Russia, Moscow, V.A. Kotelnikov Institute of Radio Engineering and Electronics, Russian Academy of Sciences,
Reshetilov Anatoly Nikolaevich, doctor of chemical sciences, professor, manager of laboratory, anatol@,ibpm.pushchino.ru, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences
