CC BY
20
УДК 619:615.33+619:616-07
Регенерирующие свойства нового препарата диальдерон Азямов Михаил Андреевич, кандидат вет. наук, зав. лабораторией, Агалакова Татьяна Владимировна, кандидат биол. наук, ст. научный сотрудник ФГБНУ «Зональный научно-исследовательский институт сельского хозяйства Северо-Востока имени Н.В. Рудницкого», г. Киров, Россия
E-mail: agalakovatv@mail.ru
В статье представлены материалы исследований функциональной активности различных типов иммуно-компетентных клеток при изучении регенерирующих свойств нового препарата диальдерона Исследования выполняли в 2014 г. в лабораторных условиях на модели гнойных ран у крыс самцов линии Вистар в соответствии с международными требованиями гуманного отношения к лабораторным животным. Для выполнения этой задачи использовали две группы крыс по 10 животных в каждой. Животным под наркозом иссекали кожный лоскут площадью 20 мм2 и наносили на поверхность раны 1 млрд микробных клеток Staphylococcus aureus. Через день, в течение 8 суток крысам подопытной группы вводили диальдерон в дозе 30 мг внутримышечно, а животным контрольной группы цефазолин наружно в дозе 1 г на рану. Критерием оценки регенерации раны служили сроки появления грануляции, эпитализации, показатели лейкоцитов и групп Т- и В-лимфоцитов, уровень фагоцитоза, некоторых цито-кинов и снижение микробной контаминации стафилококком меньше 105 микробных клеток на 1 см2. Наблюдение за животными проводили в течение 25 суток. Содержание субпопуляции Т-лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии с моноклональными антителами против лимфоцитарных антигенов CD2, CD4, CD8, CD25 на цитометре FACS Calibur («Becton Dickinson»). Полученные результаты позволили установить, что диальдерон способствовал быстрой регенерации тканей, устранению этиопатогенетических факторов (гнойного воспаления микробных клеток, некротических детритов) и ускорению эпителизации ран. Данное действие диальдерона объяснялось активацией ТН1 субпопуляции лимфоцитов, которые стимулируют выработку противовоспалительных цитокинов а-ФНО и 1-ИЛ р. Максимальная выработка противовоспалительных цитокинов в крови крыс подопытной группы наблюдалась на пятые сутки а-ФНО 870,8±0,24 нг/мл, 1 ИЛ в - 29,78±0,21 нг/мл, а затем организм приходил в физиологическую норму: а-ФНО 82,5±0,56 нг/мл, 1 ИЛ в 16,4±0,71 нг/мл.
Ключевые слова: грануляция, диальдерон, иммунитет, крысы, регенерация, цитокины
Цитокины участвуют в формировании и Материал и методы. Исследования вы-
регуляции защитных реакций и гомеостаза, они полнялись в лаборатории ветеринарной имму-вовлечены во все звенья гуморального и клеточ- нологии ФГБНУ «НИИСХ Северо-Востока»
ного иммунного ответа и являются важнейшими факторами иммунопатогенеза [1, 2, 3]. Основой патогенеза любого заболевания является запуск цитокинового каскада, который включает, с одной стороны, противовоспалительные цитокины, а с другой, воспалительные. Изучение уровня цитокинов позволяет получить информацию о функциональной активности различных типов иммунокомпетентных клеток [4, 5]. Поэтому разработка лечебных препаратов для цитокино-терапии на основе биологически активных компонентов является актуальной задачей [6, 7].
Учеными ФГБНУ «НИИСХ Северо-Востока» разрабатывается комплексный иммуно-корректирующий препарат, который позволит сократить длительность курса лечения при ряде заболеваний сельскохозяйственных животных, снизить поствирусные осложнения, увеличить срок использования дойных коров, а также уменьшить применение антибиотиков, нестероидных противовоспалительных средств и повысить сохранность сельскохозяйственных животных до 95%.
Цель исследований - изучить функциональную активность различных групп иммуно-компетентных клеток при оценке регенерирующих свойств диальдерона.
(г. Киров).
Содержание субпопуляции Т-лимфоци-тов определяли методом проточной цитометрии с моноклональными антителами против лимфоцитарных антигенов CD2, CD4, CD8, CD25 на цитометре FACS Calibur («Becton Di-crinson») [8].
Уровень цитокинов у мышей определяли методом ИФА с помощью тест-систем Bio Source Int. и маркеров Ray Biotech на сканере Alpha Sсan Microarray Scaner (Alpha Innotech) [9].
Исследования выполнялись на самцах крыс Вистар массой 250,0±5,0 г. Крыс разделяли на две группы по 10 животных в каждой. Крыс содержали в стандартных условиях вивария. Для моделирования гнойных ран после депиляции и антисептической обработки, под наркозом, животным иссекали кожный лоскут площадью 20 мм2 в межлопаточной области, затем наносили на поверхность раны 1 млрд микробных клеток Staphylococcus aureus (NCTC 10788).
Через сутки крысам подопытной группы в течение 8 суток вводили диальдерон в дозе 30 мг (0,3 мл) внутримышечно в заднебедрен-ную группу мышц. Животным контрольной группы раны обрабатывали раствором цефа-золина (1 г на 10 мл стерильной воды, «ОАО»
Синтез», Цефозолин — АКОС, Р №002895/01) один раз в сутки [10].
Критерием оценки регенерации раневой поверхности было макроскопическое состояние раны (сроки появления грануляции, краевой эпителизации, очищения раны от гнойно-некротических масс и полной эпителиза-ции), показатели лейкоцитов и лимфоцитов, уровень фагоцитоза и цитокинов, очищение раны от микробной контаминации (при обнаружении в ране меньше 105 микробных клеток стафилококка на 1 см2) на элективно-солевом агаре и тиогликолевой среде.
За животными наблюдали в течение 25 -ти суток. На 2, 5, 10, 20, 25-й дни определяли количество лейкоцитов, соотношение Т- и В-лимфо-цитов, фагоцитарный индекс по методу Райта, количество интерлейкина-1 и а-ФНО на Alpha Microarray Scaner (Alpha Innotech) с помощью маркеров Ray Biotech для определения цитокинов у крыс [10, 11, 12].
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета STATISTICA [13].
Результаты и их обсуждение. Все раны до лечения представляли собой гнойные очаги, покрытые толстым слоем некротического налета серовато-желтой окраски с неприятным запахом. Исходная контаминация в обеих группах составила 4,2±0,03х106 микробных клеток на 1 см2 раны.
На вторые сутки - гнойные раны у крыс контрольной и подопытной групп представляли собой гнойный очаг с некротическим налетом. Окружающая кожа была отечна и гиперемирована. Микробная контаминация St. aureus составила соответственно 3,8±0,02х106 и 4,1±0,04х106 микр. клеток/см2 (табл.). Крысы отказывались от корма, беспокоились, пытались спрятаться. Анализ крови не показал достоверного увеличения лейкоцитов, лимфоцитов и фагоцитоза. Уровень цитокинов был повышен ввиду микробной интоксикации.
На пятые сутки у крыс контрольной группы поврежденная поверхность представляла гнойный очаг с некротическим налетом. Кожа вокруг раны оставалась гиперемирована и отечна. Наблюдалось незначительное увеличение лейкоцитов и лимфоцитов Т и В популяций под действием бактериальных липополисаха-ридов, а также незначительное повышение фагоцитарного индекса и а-ФНО (табл.). У животных подопытной группы отмечали уменьшение некротического налета, краевую эпителизацию, начало грануляции. Уровень контаминации стафилококками оставался высоким 2,7±0,02х106 микр.клеток/см2. Незначительно повышались
лейкоциты и В-лимфоциты, а Т-лимфоциты увеличивались на 12,5%, фагоцитарный индекс повысился почти в 1,5 раза. Особенно высоко поднялся уровень фактора некроза опухолей (в 1,6 раза выше, чем в контрольной группе), стимулирующий усиление хемотаксиса и адгезии фагоцитарных и дендритных клеток и выработку коллагеназы, что способствовало грануляции и эпитализации гнойной раны.
На десятые сутки у крыс контрольной группы наблюдалось созревание грануляционной ткани с умеренно выраженным воспалением. Раны были покрыты слоем некротического детрита с высокой контаминацией стафилококком 3,6±0,02х106 микр. клеток/см2 (Р<0,05). У животных подопытной группы отмечали ускорение раневого процесса, чистую гранулирующую поверхность без признаков воспаления, с хорошей краевой эпителизацией. Раневой процесс ускорялся на пять суток. Количество лимфоцитов на 10-е сутки наблюдения в подопытной группе увеличивалось в 1,28 раз по сравнению с контролем, что указывало на активацию Т-клеточного звена иммунитета. В связи с элиминацией процесса воспаления уровень цитокинов в крови подопытных крыс снизился по сравнению с показателями а-ФНО и ИЛ-1 у животных контрольной группы.
На двадцатые сутки у животных подопытной группы наблюдали полную эпителизацию ткани с образованием чистого мягкого рубца. Показатели лейкоцитов и лимфоцитов крови находились в пределах физиологической нормы.
В контрольной группе эпителизация раны у животных наблюдалась на 25-е сутки. Эпите-лизация шла с грубыми рубцовыми изменениями, что указывает на недостаточную активацию фибробластов, моноцитов и Т-клеточной популяции. Фагоцитарный индекс и а-ФНО фактор в контрольной группе были повышены по сравнению с показателями подопытной группы, так как еще сохранялась контаминация раны St. aureus 1,8±0,03х105 микр. клеток/см2 (Р<0,05), тогда как в подопытной группе на тиогликолевых средах и элективно-солевом агаре роста стафилококков, выделенных с рубцов крыс, не отмечалось (табл.).
Выводы. В связи с вышеизложенным можно сделать вывод, что диальдерон способствует быстрой регенерации тканей и устранению эти-опатогенетических факторов (гнойного воспаления, микробных клеток и некротических детри-тов). Данное действие диальдерона объясняется активацией ТН1 субпопуляции лимфоцитов, которые стимулируют выработку противовоспалительных цитокинов а-ФНО и у-ИФН.
оо
Таблица
Показатели регенерации гнойных ран у крыс при применении диалъдерона
Дни наблюдения, сут Состояние раневой поверхности Уровень контаминации 5/. аигеш, микр. клеток/см' Количество лейкоцитов, 10% В-лимфоциты, % Т-лимфоциты, % Фагоцитарный индекс а-ФНО, нг/мл 1 плр, нг/мл
Контроль (п = 10)
2 Гнойный очаг с некротическим налетом. Окружающая кожа отечна и гиперемирована 3,8±0,02х106 11,61±0,35 25,84±0,51 58,54±0,25 4,54±0,24 490,8±0,35 16,95±0,55
5 Гнойный очаг с некротическим налетом. Кожа вокруг раны гиперемирована и отечна 4,5±0,01х106 12,94±0,56 32,12±0,24 65,46±0,17 6,45±0,18 539,8±0,14 16,52±0,81
10 Созревание грануляционной ткани с умеренно выраженным воспалением, покрыта слоем некротического детрита 3,6±0,02х106 12,42±0,25 31,25±0,14 65,85±0,46 6,24±0,56 560,5±0,24 15,98±0,11
25 Полная эпителизация с грубыми Рубцовыми изменениями 1,8±0,03х105 10,86±0,61 29,85±0,28 56,45±0,35 6,12±0,12 478,4±0,15 15,75±0,85
Опыт (п = 10)
2 Гнойный очаг с некротическим налетом. Окружающая кожа отечна и гиперемирована 4,1±0,04х106* 8,54±0,15* 22,15±0,27* 68,75±0,11* 4,82±0,15* 540,2±0,44* 19,32±0,56*
5 Слабый некротический налет. Краевая эпителизация. Начало грануляции 2,7±0,02х106* 8,21±0,22* 31,25±0,81 * 81,25±0,14* 9,42±0,11 * 870,8±0,24* 29,78±0,21*
10 Чистая гранулирующая поверхность без признаков воспаления, с хорошей краевой эпителизацией 2,1±0,02х104 8,74±0,19* 32,71±0,54* 87,94±0,26* 8,75±0,44* 285,7±0,41 * 26,1±0,46*
20 Полная эпителизация ткани с образованием чистого мягкого рубца отсутствует 8,65±0,14* 34,58±0,15* 65,82±0,12* 4,24±0,81* 82,5±0,56* 16,4±0,71*
>
"С
"С Я
х
Я
М И "С
о
О
п> И п> "С
О
и
о о н о
я р
% о\
Э\
ы о
►п
*Достоверно при Р<0,05 по отношению к контролю
Максимальная выработка противовоспалительных цитокинов в крови крыс подопытной группы наблюдалась на пятые сутки а-Ф-НО 870,8±0,24 нг/мл, 1 ИЛ в 29,78±0,21 нг/мл, а затем организм приходил в физиологическую норму с показателями а-ФНО 82,5±0,56 нг/мл и 1 ИЛ в 16,4±0,71 нг/мл.
Список литературы
1. Ежов М.Ю., Ежов И.Ю., Канко А.К. Нерешенные вопросы регенерации хрящевой и костной ткани // Успехи естественного естествознания. 2015. №5. С. 126-131.
2. Нагаев Б.С., Нагаева М.Х., Камбачокова Э.А. О роли цитокинов в регуляции иммунной системы при инфекционных заболеваниях // Инфекционные болезни: Материалы III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням (Москва 2830 марта 2011 г.). 2011. Т. 9, Приложение №1. С. 260.
3. Осиков М.В., Симонян Е.В., Федосеев А.А. Механизм влияния эритропоэтина на количественный состав лимфоцитов в крови при экспериментальной термической травме // Современные проблемы науки и образования. 2016. №2. С. 35-38.
4. Noh G., Lee J. Atopic dermatitis and cytokines: the immunoregulatory and therapeutic implications of cytokines in atopic dermatitis Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov 2012. №.6(3). P. 248-261.
5. Smith A.J. Cytokine and cytokine receptor gene polymophisms and their functionality Cytokine
and growth factor reviews. 2009. Vol. 20. №1. Pp.43-59.
6. Terryberry J., Armstrong G., Sawyer J. SQI diagnostic human cytokine 8-plex microarray // SQI Diagnostic. 2012. P. 1-4.
7. Tomoiu A., Larbi A., Fortin C. Do membrane rafts contribute to human immunosensce? // Ann. N.Y. Acad. Sci., 2013. Vol. 1100. P. 98-110.
8. Alvarez-Rueda N., Leprieur S., Clemenceau B., Supiot S., Sebille-Rivain V., Faivre-Chauvet A. Binding activities and antitumor properties of a new mouse/ human chimeric antibody specific for GD2 ganglioside antigen. // Clin. Cancer Res. 2017. №13. P. 5613-5620.
9. Godwin J.W., Pinto A.R., Rosenthal N.A. Macrophages are reguired for adult salamander limb regeneration // PNAS. 2013. №110(23). Pp. 9415-9420.
10. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Под ред. Фисенко В.П. М., 2000. С. 228-231.
11. Raza K., Singh B., Singla S., Wadhwa S., Garg B., Chhibber S. Nanocolloidal carriers of isotretinoin: antimicrobial activity against Propionibacterium acnesanddermatokinetic modeling. Mol.Pharm. 2013.10. P. 1958-1963.
12. Dinarello C. IL-1 in the pathogenesis and treatment of inflammatory diseases blood. 2011. Vd. 117. P. 3720-3732.
13. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2002. 312 с.
Regenerating properties of new drug Dyalderon
Aziamov M.A., PhD in veterinary, head of laboratory, Agalakova T.V., PhD in biology, senior researcher North-East Agricultural Research Institute, Kirov, Russia
The article presents studies of the functional activity of different types of immunocompetent cells in the study of regenerative properties of a new drug dyalderon. The study was performed in the laboratory, on the model of purulent wounds in male rats of the Vistar line, in accordance with international requirements of humane treatment of laboratory animals. The two groups of rats, 10 animals each, were used to accomplish this task. Animals under anesthesia were dissected skin flap area of 20 mm2 was applied to the surface of the wound. 1bn. microbial cells of Staphylococcus aureus. Through the day the rats of the experimental group was administered with dyalderon at a dose of 30 mg intramuscularly, and the animals of the control group Cefazolin topically at a dose of 1 g per wound, during for 8 days. The criterion for the regeneration of the wounds were the time of appearance of granulation, epitelizaciei, the leukocyte count and groups T and b-lymphocytes, the level of phagocytosis and of some cytokines and decrease microbial contamination by Staphylococcus is less than 105 microbial cells per 1 cm2. Observation of the animals was carried out for 25 days. The results obtained allowed to establish that dyalderon contributed to the rapid tissue regeneration and elimination of the etiopathogenetic factors of the purulent inflammation of microbic cells, and necrotic detritus and accelerate epithelializa-tion of wounds. This dyalderons action activated of TH1 lymphocytes subpopulations, which stimulate the production of inflammatory cytokines a-TNF and 1-HHp. The maximum development of anti-inflammatory cytokines in the blood of rats of the experimental group was observed on the fifth day of a-TNF 870,8±0,24 ng/ml, 1 IL p 29,78±0,21 ng/ml, and organism's physiological norm, was came a-TNF 82,5±0,56 ng/ml, and IL 1 p 16,4±0,71 ng/ml.
Key words: granulation, dyalderon, immunity, rats, regeneration, cytokines
References my pri infektsionnykh zabolevaniyakh. [The role of cy-
1. Ezhov M.Yu., Ezhov I.Yu., Kanko A.K. tokines in regulation of the immune system in infectious
Nereshennye voprosy regeneratsii khryashchevoy i diseases]. Materialy III Ezhegodnogo Vserossiyskogo
kostnoy tkani. [Unsolved problems of regeneration of Kongressa po infektsionnym boleznyam (Moskva 28-
cartilage and bone tissues]. Uspekhi estestvennogo es-testvoznaniya. 2015. no. 5. pp. 126-131.
2. Nagaev B.S., Nagaeva M.Kh., Kambachoko-va E.A. O roli tsitokinov v regulyatsii immunnoy siste-
30 marta 2011 g.). Infektsionnye bolezni. [Materials of the III Annual Russian Congress on infectious diseases (Moscow, 28-30 March 2011). Infectious diseases]. 2011. Vol. 9, Prilozhenie no. 1. pp. 260.
3. Osikov M.V., Simonyan E.V., Fedoseev A.A. Mekhanizm vliyaniya eritropoetina na kolichestvennyy sostav limfotsitov v krovi pri ekspe-rimental'noy termi-cheskoy travme. [Mechanism of the effect of erythropoietin on the quantitative composition of lymphocytes in the blood in experimental thermal trauma]. Sovremennye problemy nauki i ob-razovaniya. 2016. no. 2. pp. 35-38.
4. Noh G., Lee J. Atopic dermatitis and cytokines: the immunoregulatory and therapeutic implications of cytokines in atopic dermatitis Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov 2012. no. 6 (3). pp. 248-261.
5. Smith A.J. Cytokine and cytokine receptor gene polymophisms and their functionality Cytokine and growth factor reviews. 2009. Vol. 20. no. 1. pp. 43-59.
6. Terryberry J., Armstrong G., Sawyer J. SQI diagnostic human cytokine 8-plex microarray. SQI Diagnostic. 2012. pp. 1-4.
7. Tomoiu A., Larbi A., Fortin C. Do membrane rafts contribute to human immunosensce? Ann. N.Y. Acad. Sci., 2013. Vol. 1100. pp. 98-110.
8. Alvarez-Rueda N., Leprieur S., Clémenceau B., Supiot S., Sébille-Rivain V., Faivre-Chauvet A. Binding activities and antitumor properties of a new mouse
/human chimeric antibody specific for GD2 ganglioside antigen. Clin. Cancer Res. 2017. no. 13. pp. 5613-5620.
9. Godwin J.W., Pinto A.R., Rosenthal N.A. Macrophages are reguired for adult salamander limb regeneration. PNAS. 2013. no. 110(23). pp. 9415-9420.
10. Rukovodstvo po eksperimental'nomu (dok-linicheskomu) izucheniyu novykh farmakologicheskikh veshchestv. [Manual on experimental (preclinical) study of new pharmacological substances]. Pod red. Fisenko VP. Moscow, 2000. pp. 228-231.
11. Raza K., Singh B., Singla S., Wadhwa S., Garg B., Chhibber S. Nanocolloidal carriers of isotretinoin: antimicrobial activity against Propionibacterium acnes and dermatokinetic modeling. Mol. Pharm. 2013. 10. pp. 1958-1963.
12. Dinarello C. IL-1 in the pathogenesis and treatment of inflammatory diseases blood. 2011. V. 117. pp. 3720-3732.
13. Rebrova O.Yu. Statisticheskiy analiz med-itsinskikh dannykh. Primenenie paketa prikladnykh programm STATISTICA. [Statistical analysis of medical data. Application software package STATISTICA]. Moscow: MediaSfera, 2002. 312 p.
УДК 636.32/38:612.015.3
Связь метаболического профиля молодняка овец разных генотипов с темпами роста
Жариков Яков Александрович1, кандидат с.-х. наук, ст. научный сотрудник,
Канева Лидия Александровна2, директор,
Бобрецов Виктор Егорович2, мл. научный сотрудник,
Козлова Юлия Анатольевна2, мл. научный сотрудник
1ФГБНУ Научно-исследовательский институт сельского хозяйства
Республики Коми, г. Сыктывкар, Республика Коми, Россия,
2ФГБНУ Печорская опытная станция ФГБНУ Научно-исследовательский
институт сельского хозяйства Республики Коми, с. Коровий Ручей,
Усть-Цилемский район, Республика Коми, Россия
E-mail: zharikov.yakov@yandex.ru; E-mail: lidiya@topcen.org
Дана оценка метаболического профиля сыворотки крови чистопородного и помесного молодняка овец в контексте интенсивности роста. Объектом исследований были пятимесячные чистопородные ярки романовской породы (Р) и помесные, полученные в результате скрещивания маток печорской породной группы с бараном остфриз-ской породы (1/2П х '/2О), выращенные в одинаковых условиях кормления и содержания на Печорской опытной станции. Для опыта было сформировано четыре группы молодняка по 5 голов в каждой: I (1/2Пх 1/2О) - с высокой энергией роста; II (1/2П х 1/2О) - с низкой; III (Р) - с высокой и IV (Р) - с низкой. Группы ярок с низкой энергией роста приняты за контроль. Метаболический профиль быстрорастущих ярок характеризовался следующими особенностями: уровень альбуминов более 45% от общего белка; А/Г коэффициент приближается к единице; средний и ниже среднего (3,3-5,0 ммоль/л) в пределах нормы уровень мочевины; глюкоза+холестерин больше пяти; коэффициент де Ритиса - 1,8-2,2; высокие в пределах нормы значения кальция, фосфора и щелочной фосфатазы. Метаболический профиль медленнорастущих ярок: уровень альбуминов менее 45% от общего белка; А/Г коэффициент - менее 0,85; глюкоза и глюкоза + холестерин - на нижней границе нормы; коэффициент де Ритиса выше 2,2. Существенные различия в пользу быстрорастущих ярок по интенсивности белкового, углеводного и других обменов позволяют использовать биохимические параметры крови на ранних этапах онтогенеза в качестве маркерных признаков для прогнозирования роста и при оценке адаптации к условиям содержания.
Ключевые слова: порода, печорская, остфризская, романовская, ярки, темпы роста, кровь, субстраты, ферменты, метаболизм, биохимические маркёры
Известно, что формирование продуктивности животных во многом обусловлено состоянием и спецификой их метаболического
гомеостаза. Тип обмена веществ, его характер и интенсивность складываются под влиянием как условий кормления и содержания, так и на-
