CC BY
58
УДК 581.4
В.В.Соловъева,Н.А.Вечернина,
O.K. Таварткиладзе,А.И.Шмаков
Регенерация растений Brachanthemum baranovii (Krasch. et Poljak) Krasch. в культуре in vitro
Brachanthemum baranovii (Krasch. et Poljak) Krasch. является узколокальным эндемиком Центрального Алтая (сем. Asteraceae), который занесен в Красную книгу РСФСР как уязвимый вид, нуждающийся в государственной охране. Это полукустарничек высотой 15-50 см, растущий в условиях каменистой степи на высоте 850-1200 м над уровнем моря. Растение встречается исключительно на известняковых обнажениях и проявляет чрезвычайную требовательность к характеру субстрата. Узкая стенотопность вида при отсутствии вегетативного размножения и сильной зависимости вызревания семян от погодных условий ограничивает возможности сохранения и распространения B. baranovii как в природе, так и в культуре [1, 2, 3]. Опыт первичной интродукции вида показал, что в необычных для себя условиях растения страдали от выпревания при обилии снега, цвели, но не образовывали семян [4]. Вследствие этого продолжительность жизни B. baranovii в ботаническом саду составляла 1 вегетационный период, редко 2. Видимо, создание условий, соответствующих экологическим требованиям вида, позволило бы повысить эффективность его интродукции. Однако слабая изученность его биологии и уникальность природных мест обитания сильно затрудняют воссоздание естественных условий существования B. baranovii, необходимых для его успешного роста и размножения.
В сложившейся ситуации актуален поиск нетрадиционных подходов к сохранению генофонда растений. Одним из таких подходов является использование методов биотехнологии растений, благодаря которым стало реальным, например, осуществление программ по сохранению генофонда таких редких растений, как шафран [5], лиственница Сукачева [6], морошка приземистая [7]. Однако применять эти методы можно только к таким растениям, для которых разработаны методы регенерации в культуре изолированных органов. Целью нашего исследования явилось изучение условий регенерации B. baranovii в культуре in vitro.
Материалы и методы. В качестве первичного материала для введения в культуру in vitro использовали свежесобранные семена
B. baranovii. Поверхностную стерилизацию семян осуществляли по методике, разработанной в лаборатории биотехнологии растений ЮСБС [8]: погружали на 30 мин в 0,2% раствор хлорсодержащего порошка «Беласепт», а затем на 10 мин в 0,1% раствор сулемы. Простерилизованные и промытые семена помещали на питательную среду по прописи Гам-борга (В5), дополненную 1 мкМ 6-бензилами-нопурина (БАП).
В опытах по изучению влияния генотипа на регенерационную способность B. baranovii in vitro использовали побеги четырех генотипов - 1, 2, 3, 4, которые культивировали на среде В5 с 0,5 мкМ БАП.
В экспериментах по изучению влияния ци-токининов (БАП, кинетин (К), 2-изопентени-ладенин (2-iP), аденин сульфат (АС)) использовали микропобеги генотипа 1.
Работу в асептических условиях, приготовление и стерилизацию питательных сред проводили по общепринятым методикам [9]. рН сред доводили перед автоклавированием до 5,8-5,9. Культивирование проводили при фотопериоде 16 ч и температуре 24±1 °С. Субкультивирование осуществляли через каждые 25-30 суток.
Результаты и их обсуждение. Использование описанного режима стерилизации позволило полностью освободить семена от микрофлоры и получить высокую всхожесть семян (83%). Наблюдения показали, что основная часть семян (10 из 18) прорастала на среде с БАП в течение 14 суток, что говорит о достаточной зрелости семян, для проращивания которых не требовалось периода покоя. У полученных проростков удаляли корешки и продолжали культивировать их на той же среде до появления настоящих листьев. В следующем пассаже использовали среду В5 с 0,5 мкМ БАП, где на эксплантах регенерировали новые побеги в количестве 5-8 шт/эксплант высотой от 0,5 до 1,0 см.
Известно, что для индукции регенерационных процессов в культуре изолированных органов в питательные среды необходимо добавлять стимуляторы роста - цитокинин в определенных сочетаниях с ауксином и/или гибберрилином. В то же время у многих рас-
Таблица 1
Влияние БAП на регенерационную способность побегов B. baranovii in vitro (n = 20)
Концентрация, мкМ Количество побегов, шт./эксплант Частота регенерации, % Частота каллусогенеза, %
0 0 0 0
0,5 5,0 100 100
1,0 6,1 100 100
5,0 6,1 100 100
10,0 8,5 100 100
20,0 6,3 100 100
HOP™, 0,5
тений (земляника, малина черная и ежевика, сенполия) добиться регенерации побегов можно в присутствии одного стимулятора - ци-токинина, воздействие которого определяется его концентрацией и химической природой [10, 11, 12]. Нами было изучено влияние БАП, К, 2-ІР (0,5-40,0 мкМ) и АС (5-150 мг/л) на регенерационную способность побегов В. Ьагапоуіі. Полученные результаты представленої в таблицах 1 и 2.
Как следует из данных таблиц 1 и 2, лучшим индуктором побегообразования среди изученных цитокининов являлся БАП. Этот регулятор роста индуцировал образование 5-6 дополнительных побегов у 100% эксплантов, начиная с относительно низких концентраций -0,5-1,0 мкМ. Этот факт свидетельствует о высоком содержании эндогенных стимуляторов роста, что, как правило, является условием высокой пролиферативной активности эксплан-
тов [13]. Более высокие концентрации БАП (5,0-10,0 мкМ) стимулировали процесс регенерации, выюытая одновременно изменения в морфологии регенерирующих побегов. С повышением концентрации цитокинина междоузлия побегов становились короче, изменялись размеры, форма и количество листьев на побегах.
Наибольшее количество побегов (7-10 шт./ эксплант) регенерировало на питательной среде с 10 мкМ БАП. При этом побеги выглядели как пучки видоизмененных листьев с сильно укороченным стеблем. В связи с этим конгломераты видоизмененных побегов доращивали на среде В5 со сниженным содержанием БАП -0,5 мкМ. В ходе культивирования побеги вытягивались в длину и приобретали нормальную морфологию. Установлено, что после доращивания 73% побегов высотой 8-14 мм быши способны к укоренению на безгормональной среде. Видимо, подобное чередование сред позволи-
Таблица 2
Влияние цитокининов на регенерацию побегов B. baranovii in vitro (n = 12)
Концентрация цитокинина, мкМ Количество побегов, шт./эксплант Средняя высота побегов, мм Частота регенерации, % Частота каллусогенеза, %
Кинетин
0,5 0,4 менее 5 25 46
1,0 3,2 4,9 83 100
2,0 5,8 6,3 100 100
5,0 7,6 8,0 100 100
10,0 7,5 7,9 100 100
20,0 7,2 5,9 100 100
НСР0,05 2,0
2-ІР
0.5 0,5 5,5 25 100
1,0 1,6 4,8 83 100
2,0 2,5 6,2 100 100
5,0 4,7 9,1 100 100
10,0 6,0 6,3 100 100
20,0 5,2 7,6 100 100
НСР0,05 1Д
АС (мг/л)
20 0 - 0 -
50 0 - 0 -
100 0,4 менее 5 33 -
ло выровнять гормональный баланс побегов, нарушенный из-за культивирования на средах с относительно высоким содержанием цито-кинина.
Из данных таблицы 2 видно, что при культивировании побегов B. baranovii на питательных средах с относительно низким содержанием К и 2-iP (0,5-1,0 мкМ) индуцировать побегообразование у 100% эксплантов не удавалось, что свидетельствует о более слабом по сравнению с БАП влиянии этих регуляторов роста на регенерационный процесс. С повышением концентрации К, 2-iP частота регенерации, интенсивность регенерации и скорость роста побегов возрастали, достигая максимальных значений при 5,0-10,0 мкМ К (коэффициент размножения 1:7 - 8) и 10,0-20,0 мкМ 2-iP (коэффициент размножения 1:5 - 6).
Наихудшие результаты были получены в опытах с АС, который является предшественником в синтезе эндогенных цитокининов (табл. 2). Регенерацию единичных побегов у 33% эксплантов наблюдали только после увеличения концентрации АС до 100-150 мг/л. При более низких концентрациях (5-50 мг/л) вместо побегообразования происходило укоренение 40-70% эксплантов (такое же, как на без-гормональной среде), что свидетельствует о слабом использовании АС в биосинтезе эндогенных цитокининов.
По всей видимости, наблюдаемые различия в эффективности воздействия экзогенных цитокининов на регенерацию определяются особенностями их метаболизма в клетках растений. Например, 2-iP при микроразмножении некоторых растений используют в концентрациях, которые на порядок выше применяемых концентраций БАП [14]. Это может быть связано с тем, что 2-iP является природным фитогормоном, поэтому он более интенсивно разрушается в растительных клетках под воздействием окислительных ферментов. Синтетические цитокинины БАП и К не «узнаются» ферментами клеток, сохраняя свою стабильность и активность [15].
При разработке методов регенерации необходимо учитывать, что растения разных генотипов одного вида могут по-разному реагировать на предлагаемые условия культивирования in vitro. Поэтому нами было изучено влияние генотипа на регенерационную способность побегов B. baranovii (табл. 3).
Как показали наши исследования, коэффициент размножения побегов B. baranovii исследуемых генотипов варьировал в небольших пределах - от 4 до 6 шт. на 1 эксплант. Одна-
Таблица 3
Влияние генотипа на регенерацию побегов В. Ъагапоуп на питательной среде В5 с 0,5 мкМ БАП (п = 20)
Г енотип Количество побегов, шт./эксплант Средняя высота побегов, мм
1 5,0 -
2 4,4 7,2
3 5,6 6,0
4 5,4 5,6
НСР„.„5 0,6
ко отмечены индивидуальные особенности каждого из изучаемых генотипов по морфологии регенерирующих побегов и интенсивности кал-лусогенеза, развивающегося в основании побегов. Разная реакция на включаемые в питательную среду регуляторы роста, по мнению
A.В. Высоцкого [10], отражает в какой-то мере эндогенное содержание ростовых веществ, которое является генетически обусловленным признаком вида или сорта. Характер превращения цитокининов в клетке, от которого зависит активность регулятора роста, также детерминирован генетически [15].
Во время цветения B. baranovii разных генотипов было установлено, что взрослые растения генотипа 1 отличались от растений других генотипов (с желтыми цветами) тем, что имели белый венчик и сочетали в себе признаки и B. baranovii, и Dendranthema sinuatum (Ledeb.) Tzvel. Некоторые исследователи считают, что именно такие растения являются настоящими представителями вида B. baranovii, связывая происхождение вида с межродовой гибридизацией между D. sinuatum и B. krylovii, которые входят в состав фитоценозов
B. baranovii [16]. Если высказанное предположение верно, то клональное размножение растений генотипа 1 становится особенно актуальным, так как B. baranovii с белыми цветами встречаются в природе очень редко, а семенное размножение гибридных растений оказывается, как правило, малоэффективным из-за стерильности или недоразвитости их семян.
Таким образом, в ходе наших экспериментов установлено влияние природы и концентрации цитокининов на регенерацию побегов B. baranovii in vitro. Сделан вывод о более сильном стимулирующем воздействии БАП на регенерационную способность эксплантов по сравнению с К и 2-iP. Наибольшее количество побегов нормальной морфологии регенерировало в присутствии 0,5—1,0 мкМ БАП - 5-6 шт./эксплант. Сходной реакции можно было добиться и в присутствии других цитокининов. Однако для этого нужно было увеличить их
содержание в питательной среде до 2-5 мкM. C увеличением концентрации БAП до 5-10 мкM коэффициент размножения возрастал. Но при этом наблюдали такие нежелательные для клонального размножения эффекты, как видоизменение регенерирующих побегов и образование каллуса в базальной части побегов. Поэтому использование среды с 10 мкM БAП, на которой экспланты проявляли максимальную регенерационную способность, для размножения B. baranovii было возможно только
в случае доращивания конгломератов побегов на среде со сниженным содержанием БAП (0,5 мкM). Ингибирующими для регенерации и роста побегов концентрациями БAП были 20,0— 40,0 мкM. Достоверных различий по темпам пролиферации побегов между генотипом 1 и генотипами 2, 3 и 4 обнаружено не было, что позволяет считать среды для пролиферации побегов универсальными, пригодными для вегетативного размножения семенного потомства растений вида В. baranovii in vitro.
Литература
1. Красная книга РСФСР. Растения: Энциклопедия / Отв. ред. АЛ. Тахтаджян и др. М., 1988.
2. Верещагина И.В. Встреча с зеленым другом. Барнаул, 1996.
3. Пяк А.И. Особенности высотного распространения Brachanthemum baranovii (Asteraceae) в связи с плейстоценовыми событиями на Алтае // Бот. жур. СПб., 1999. Т. 84. №3.
4. Семенова Г.П. Интродукция и охрана редких и исчезающих видов флоры Сибири // Сибирский экологический журнал. Новосибирск, 1997. Т. 4. №1.
5. Комарова Э.Н., Миляева Э.Л., Ахундова Д.Д. Использование метода культуры ткани in vitro в целях размножения редких и исчезающих видов растений на примере шафрана // Флора и растит. Сибири и Дальнего Вост.: Тез. докл. конф., посвящ. памяти Л.М. Черепина. Красноярск, 1991.
6. Путенихин В.П. Культура изолированных почек лиственницы Сукачева // Биология культивируемых клеток и биотехнология. М., 1991.
7. Яцына А.А., Концевая И.И. Клональное микроразмножение морошки приземистой (Rubus chamaemorus L.) // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: Тез. докл. VII Междунар. конф. М., 1997.
8. Вечернина Н.А., Таврткиладзе О.К., Шмаков А.И. К проблеме сохранения Bracanthemum baranovii (Krasch. et Poljak) Krasch.: введение в культуру in vitro // Известия АГУ. Барнаул, 1998. Вып. 1.
9. Калинина Ф.Л., Caрнaцкaя В.В., Полищук В.Е. Ыетоды культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, 1980.
10. Высоцкий В.А Культура изолированных тканей и органов плодовых растений: оздоровление и микроклональное размножение // Cельскoхoзяй-ственная биология. M., 1983. №7.
11. Упадышев Ы.Т., Высоцкий В.А Размножение ежевики и малины черной методом культуры тканей // Caдoвoдствo и виноградарство. M., 1991. №б.
12. Ыайстренко Г.Г., Гордиенко Н.Я., Тищенко СЮ. Ыорфогенез сенполий в культуре in vitro при экзогенном внесении гормонов // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда: Тез. докл. VII Ыеждунар. конф. M., 1997.
13. Байбурина Р.К. Ыикроклональное размножение взрослых гибридных деревьев Betula pendula Roth. var. carelica Merckl // Раст. ресурсы. M., 1998. Т. 34. Вып. 2.
14. Высоцкий В.A. Клональное микроразмножение растений // Культура клеток растений и биотехнология. M., 198б.
15. Qснoвы химической регуляции роста и продуктивности растений / T.C. Ыуромцев, Д.И. Чкаников, Q.H. Кулаева и др. M., 1987.
16. Cмирнoв СВ. Q гибридном происхождении Brachanthemum baranovii (Krasch. et Poljak) Krasch. (Asteraceae) // Тезисы VII Ыолодежной конференции ботаников в Caнкт-Петербyрге (15—19 мая 2000). СТб., 2000.
