CC BY
11
Предлагаемый проект направлен на изучение экс-прессионного профиля и функционирования сердечного натриевого канала Nav1.5 в кардиомиоцитах, полученных путем направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) от пациента с LMNA R249Q мутацией. Изменение свойств кардиомиоцитов с мутацией изучали с помощью метода ПЦР в режиме реального времени на основные кардио-специфичные маркеры. Функционирование сердечного натриевого канала Nav 1.5 исследовали методом локальной фиксации потенциала (patch-clamp).
Мы продемонстрировали, что мутация LMNA R249Q приводит к дисрегуляции экспрессии генов в кардиоми-оциах, полученных из ИПСК: наблюлось повышение экспрессии генов, кодирующих структурные белки в карди-омиоцитах с LMNA R249; в то же время мутация LMNA R249Q приводила к подавлению экспрессии генов, кодирующих белки десмосом. Кроме того, мы показали, что кардиомиоциты, полученные из ИПСК с LMNA R249Q мутацией, характеризуются изменениями в функционировании потенциал-зависимого натриевого канала Nav1.5, что может рассматриваться как вероятный механизм развития аритмии.
Таким образом, изучение эффекта ламиновых мутаций на экспрессионный профиль и электрофизиологические свойства кардиомиоцитов представляется весьма актуальным как с точки зрения фундаментальной биологии, так и с точки зрения практического применения. Исследование поддержано грантом Президента поддержки научных школ № НШ-4664.2022.1.4.
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ
КЛЕТОК НА ПРОЦЕССЫ ОСТЕОГЕННОЙ
ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
Д.А. Переплетчикова1, Д.А. Костина1,
И.А. Хворова1, В.В. Карелкин2,
А.А. Лобов1, А.Б. Малашичева1
1 Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 РНИИТО им. Вредена, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: dasha_perepletch@mail.ru
Ключевые слова: эндотелий, мезенхимные стволовые клетки, остеогенная дифференцировка, Notch.
Известно, что процессы ангиогенеза и остеогенеза неразрывно связаны, а взаимодействие эндотелия и мезенхимы необходимо для нормальной оссификации. Однако до сих пор относительно мало известно о непосредственной роли эндотелия в процессах остеогенной дифферен-цировки и о конкретных механизмах, лежащих в ее основе.
Для изучения клеточных и молекулярных механизмов остеоиндуктивных и/или остеосупрессивных свойств эндотелия, мы провели эксперименты в остеогенных условиях в системе бесконтактного сокультивирования и при непосредственном контакте двух типов клеток: первичной культуры остеобластов и эндотелиальных клеток пупочного канатика человека. После контактного сокуль-тивирования смешанную культуру разделяли методом магнитного сортинга по эндотелиальному маркеру CD31. Далее проводили комплексный анализ изменений проте-омного и транскриптомного профилей отдельно для остеобластов и эндотелиальных клеток (ЭК) при различных условиях культивирования. Методом РВ-ПЦР, оценивали уровень экспрессии генов интереса. Эффективность остеогенной дифференцировки оценивали по уровню минерализации внеклеточного матрикса.
Было выявлено, что эндотелий одновременно обладает как остеоиндуктивными, так и остесупрессивными свойствами. Условия сокультивирования оказывали противоположные эффекты на остеогенную дифференци-ровку остеобластов — контактное культивирование усиливало, а бесконтактное подавляло. Для статистического анализа протеомных данных использовали 3073 белка для ЭК и 2966 для остеобластов. В ходе транскриптом-ного анализа получили количественную информацию о транскриптах, соответствующих 38552 генам. По результатам анализов мы выявили слабые изменения в физиологии остеобластов, но определили существенные изменения в физиологии ЭК. Так, при сравнении контрольных и экспериментальных ЭК нам удалось выявить значительные различия в экспрессии белков и транс-криптов, связанных с фокальными контактами и организацией внеклеточного матрикса. При помощи РВ-ПЦР было установлено, что при контактном и бесконтактном сокультивировании наблюдается активация экспрессии Notch-зависимых генов: HEY1, DLL4, JAG, SNAIL, SLUG и маркера остеогенной дифференцировки RUNX2.
Суммируя полученные результаты, можно сделать вывод о том, что эндотелий оказывает двойственное влияние на процессы остеогенной дифференцировки. Остеоиндуктивные свойства эндотелия опосредованы сигнальным путем Notch и реализуются только при наличии физического контакта с остеобластами, а остеосу-прессивные свойства связаны с действием паракринных факторов, секретируемых ЭК. При этом, сокультивирова-ние с остеобластами оказывает существенное влияние на сам эндотелий и, вероятно, на его секретомный профиль. Исследование выполнено при финансовой поддержке РНФ в рамках научного проекта № 18-14-00152.
РЕГЕНЕРАЦИЯ КОЖНЫХ ПОКРОВОВ ПОСЛЕ
ОЖОГОВЫХ ТРАВМ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ
ГИПЕРБАРИЧЕСКОЙ ОКСИГЕНАЦИИ
П.В. Перетягин, А.Г. Соловьева, Н.Л. Короткова,
Н.В. Диденко, К.Л. Беляева, В.И. Загреков
1 ФГБОУ ВО ПИМУ Минздрава России, Нижний Новгород, Россия
e-mail: peretyaginpv@gmail.com
Ключевые слова: гипербарическая оксигенация, микроциркуляция, ожоги.
Известно, что при обширных ожогах в качестве одного из основных методов лечения последствий ожогов является использование местной кожной пластики. Одним из основных условий успешного приживления трансплантата является его кровоснабжением по микрососудам [1]. Оно может быть успешно стимулировано различными физическими факторами, в том числе проведением курса гипербарической оксигенации (ГБО) [2].
Целью исследования — изучение динамики показателей микроциркуляции в кожных лоскутах при проведении процедур ГБО.
Материалы и методы. В исследование было включено 15 пациентов (38 кожных лоскутов). После операции с использованием рубцовых лоскутов оценивали состояние микроциркуляции методом лазерной допплеровской флуометрии. Всем пациентам с учетом показаний были назначены сеансы ГБО в режиме 1,3 АТА (7 процедур, время изопрессии -40 мин).
Результаты. Показано, что прирост показателя микроциркуляции в ответ на процедуру ГБО-терапии
свидетельствует о наличии достаточных резервов микроциркуляции и может быть использован как прогностический показатель выживания сомнительного участка кожного лоскута. Возрастание показателя микроциркуляции в дистальном отделе лоскута после ГБО указывает на целесообразность его применения в реконструктивной хирургии последствий ожогов для профилактики развития ишемических нарушений в рубцовом кожном лоскуте. После проведения курса ГБО-терапии послеоперационный период протекал с формированием линейного некроза, что является особенностью заживления в рубцово-измененных тканях, однако образования некрозов, повлиявших на результат оперативного лечения и потребовавших проведения повторной кожной пластики, не наблюдали.
Литература:
1. Yamazaki F., Takahara K., Sone R., Johnson J.M.J. Appl. Physiol.
2007; 103: 2026-2033.
2. Stirban A., Lentrodt S., Nandrean S. et al. Undersea and Hyperbaric Medicine. 2009; 36 (5): 381-390.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ СЕКРЕТОМА МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ РЕАКЦИИ ТРАНСПЛАНТАТ ПРОТИВ ХОЗЯИНА ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АЛЛОГЕННОГО КОСТНОГО МОЗГА
Н.А. Петинати1, Н.И. Дризе1, Г.П. Арапиди2, В.О. Шендер2, М.А. Лагарькова2, Л.А. Кузьмина1, Е.Н. Паровичникова1, В.Г. Савченко1
1 ФГБУ НЦМИ гематологии Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия
2 ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА, Москва, Россия
e-mail: loel@mail.ru
Ключевые слова: Мультипотентные мезенхимные стро-мальные клетки; трансплантация костного мозга, секретом, рецидив острого лейкоза.
Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (МСК), полученные от донора гемопоэтических стволовых клеток, вводили внутривенно пациентам после трансплантации аллогенного костного мозга в момент восстановления числа лейкоцитов до 109/л. МСК вводили для предотвращения развития острой реакции трансплантат против хозяина (РТПХ). При ретроспективном изучении эффективности введения МСК оказалось, что нет достоверных отличий в частоте развития РТПХ между группами пациентов, которым вводили и не вводили МСК. Многофакторный анализ показал, что после введения МСК достоверно увеличивается общая выживаемость пациентов и уменьшается частота рецидивов. Целью работы было проанализировать отличия в составе белков, секретируемых МСК, в зависимости от последующего развития рецидива основного заболевания у больных.
В работе был проанализирован секретом 5 образцов МСК, введенных пациентам у, которых впоследствии не было рецидива (МСК-к) и 5 образцов МСК, введенных пациентам, у которых впоследствии развился рецидив (МСК-Р). Секретом МСК включал белки, секре-тируемые в составе везикул и экзосом. Анализ белков проводили на масс-спектрометре TripleTOF 5600+. Для
характеристики идентифицированных белков использовали онлайн-сервис STRING-db и базу данных GO. Из 1841 проанализированных белка 443 не секретиро-вались МСК-к, 171 белок секретировали только МСК-к. Среди них белки, относящиеся к внеклеточному пространству: TCN2, NOTCH2, LIPG, CDH11, ALB, CYTL1, CTSF, CASP3, GREM2, PTTG1IP, B7RP1, CETN2, COL4A3. 450 белков слабее секретированы МСК-Р по сравнению с МСК-к. К слабо секретируемым белкам относятся 8 белков, участвующий в регуляции ответа на цитокины (GAS6, HPX, UBE2K, PAFAH1B1, DHX9, MAVS, CPNE1, SPPL2A) и в ангиогенезе. Среди них рецепторы к факторам роста PDGFRA и PDGFRB, NOTCH3-рецептор к белку NOTCH, TGFB1, участвующий в адгезии, и другие.
548 белков сильнее секретированы в МСК-Р. Среди них большой кластер объединяет связанные с адгезией клеток к субстрату, активацией, связыванием с ростовыми факторами и коллагеном.
Показано, что между секретомом МСК пациентов, у которых рецидив развился в течение полугода после их введения (ранний рецидив — МСК-РР) и пациентов, у которых рецидив развился позже 2-х лет (поздний рецидив — МСК-ПР) существует большая достоверная разница. Выявлены отличия в количестве секретируемых белков между МСК-к, МСК-РР и МСК-ПР. Несмотря на то, что МСК быстро элиминируются из организма после внутривенного введения и секретом МСК сильно варьирует у доноров, секретируемые белки влияют на дальнейшую судьбу пациента. Среди выявленных различающихся белков могут быть ключевые факторы, повлиявшие на развитие рецидива. Эти белки могли повлиять как на оставшиеся опухолевые клетки, так и на костномозговую нишу, регулирующую кроветворение и стволовые клетки опухоли. Работа была выполнена при поддержке гранта РФФИ 19-29-040-23.
ИЗУЧЕНИЕ IBA-1-ИММУНОПОЗИТИВНЫХ КЛЕТОК В СЕДАЛИЩНОМ НЕРВЕ КРЫСЫ ПОСЛЕ НАЛОЖЕНИЯ ЛИГАТУРЫ И СУБПЕРИНЕВРАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ МСК
Е.С. Петрова, Е.А. Колос
ФГБНУ Институт экспериментальной медицины, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: iempes@yandex.ru
Ключевые слова: нерв, регенерация, белок Iba-1, макрофаги, МСК.
Применение мезенхимных стволовых клеток (МСК) может способствовать регенерации нерва [1, 2]. Вопрос о влиянии экзогенных МСК на репаративные процессы, происходящие в нервном стволе в ранние сроки после травмы, мало изучен. Субпериневральная трансплантация МСК является удобной моделью для изучения межклеточных коммуникаций, происходящих в нерве после повреждения. Цель настоящей работы — исследование распределения популяции макрофагов в седалищном нерве крысы после травмы и однократной трансплантации МСК. МСК костного мозга крыс Вистар-Киото были получены в ООО «Транстехнологии» (руководитель к.б.н. Д.Г. Полынцев). Седалищные нервы крыс Вистар-Киото (n=12) повреждали (лигатура, 40 с), что приводило к развитию валлеровской дегенерации (ВД) в дистальном сегменте нерва [3]. Части животных субпериневрально вводили суспензию МСК (5х104 клеток в 5 мкл). Через 7 сут исследовали популяцию макрофагов, содержащих
