CC BY
12
УДК 616-001.41
РЕГЕНЕРАЦИЯ ИНФИЦИРОВАННОЙ КОЖНОЙ РАНЫ НА ФОНЕ ТОПИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ СОЛЯМИ N-АЦЕТИЛ^-АМИНОГЕКСАНОВОЙ КИСЛОТЫ
Блинова Е.В., Миронов М.А., Блинов Д.С.
Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва, г. Саранск, Российская Федерация
Аннотация. Цель работы - изучить ранозаживляющие эффекты двух отечественных производных N-ацетил-б-аминогексановой кислоты при инфицированных метицил-лин-резистентным штаммом Staphylococcus aureus ранах в эксперименте. Материал и методы исследования. Работа выполнена на 40 нелинейных крысах-самцах весом 2б0-300 г. У животных моделировали плоскостную инфицированную рану диаметром 10-12 мм. Изучали местное воздействие кальциевого (ЛХТ-б-17) и серебряного (ЛХТ-7-17) производных N-ацетил-б-аминогексановой кислоты в виде 1% мази при местном нанесении на область раневого дефекта на 2, 5 и 9 сутки после моделирования ран. Определяли скорость эпителизации и площадь рубца плоскостного дефекта кожи, а также интенсивность свободноради-кальной липопероксидации и концентрацию ФНО-альфа и ИЛ-10 в грануляционной ткани на б сутки после формирования раны. Результаты. Топическое воздействие кальциевой (ЛХТ-б-17) и серебряной (ЛХТ-7-17) солями N-ацетил-б-аминогексановой кислоты в виде 1% мази на 2, 5 и 9 сутки после моделирования инфицированной кожной раны у самцов крысы обладает ранозаживляющим эффектом. ЛХТ-7-17 при местном воздействии более, чем в два раза а ЛХТ-б-17 - в 1,3 раза по сравнению с контролем ускоряют эпителизацию плоскостной инфицированной раны кожи крыс, сокращают площадь рубца, что может быть обусловлено оптимизацией местных свободно-радикальных реакций и тканевой концентрации цитокинов, участвующих в регуляции воспаления и регенерации. Ключевые слова: инфицированная плоскостная рана, заживление, цитокины, свободнорадикальные реакции, производное N-ацетил-б-аминогексановой кислоты._
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-7-80-83
REGENERATION OF AN INFECTED SKIN WOUND TREATED BY TOPICAL APPLICATION OF N-ACETYL-6-AMINOHEXANOIC ACID SALTS
Blinova E. V., Mironov M.A., Blinov D.S.
National research Mordovia state university, Saransk, Russian Federation
Annotation. The aim of the study was to explore the wound healing effect of two novel compounds of N-acetyl-6-aminohexanoic acid in infected by MRS Staphylococcus aureus planar wounds in experiment. Material and methods. The study was performed in 40 nonlinear male rats weighing 260-300 g. A planar wound with 10-12 mm diameter was reproduced. Topical effect of calcium-containing (LHT-6-17) and silver-containing (LHT-7-17) derivatives of N-acetyl-6-aminohexanoic acid as 1% ointment was studied in local application to the wound defect region on days 2, 5 and 9 after wounds modeling. The epithelialization rate and the area of the scar of the planar skin defect, as well as the intensity of free radical lipoperoxidation and the concentration of TNF-alpha and IL-10 in the granulation tissue on day 6 after wound formation were studied. Results. Topical application of calcium-containing (LHT-6-17) and silver-containing (LHT-7-17) salts of N-acetyl-6-aminohexanoic acid as 1% ointment on days 2, 5 and 9 after modeling infected wound in male rats induces the wound regeneration. LHT-7-17 under local action more than twice and LHT-6-17 1.3 times more as compared to the control accelerate the epithelization of the planar infected wound of rats' skin, reduce the area of the scar, which may be due to the optimization of local free-radical reactions and tissue concentration of cytokines, involved in the regulation of inflammatory and regenerative process.
Key words: infected planar wound, healing, cytokines, free-radicals reaction, N-acetyl-6-aminohexanoic acid compounds.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Linden L. Topical preparations for wound healing / L. Linden, P. Emmans, S. Safranek // Am. Fam. Physician. - 2014. - Vol.
89, No. 12. - P. 978-979.
[2] Langford J.H. Topical antimicrobial prophylaxis in minor wounds / J.H. Langford, P. Artemi, S.I. Benrimoj // Ann. Pharma-cother. - 1997. - Vol. 31, No. 5. - P. 559-563.
[3] Dixon A.J. Randomized clinical trial of the effect of applying ointment to surgical wounds before occlusive dressing / A.J. Dixon, M.P. Dixon, J.B. Dixon // Br. J. Surg. - 2006. - Vol. 93, No. 8. - P. 937-943.
[4] Wound repair and regeneration / G.C. Gartner, C. Werner, V. Barrandon, M.T. Longaker // Nature. - 2008. - Vol. 453, No.
7103. - P. 314-321.
[5] Murine Model Imitating Chronic Wound Infections for Evaluation of Antimicrobial Photodynamic Therapy Efficacy / G. Fi-
la, K. Kasimova, Y. Arenas, J. Nakonieczna, M. Grinholc, K.P. Bielawski, L. Lilge // Front. Microbiol. - 2016. - Vol. 7. - P. 1258.
[6] Determination of effective miRNAs in wound healing in an experimental rat model / E. Coskunpiran, H. Arkan, B.G. Dede-
oglu et al. // Cell. Mol. Biol. - 2015. - Vol. 61, No. 8. - P. 89-96._
Введение. Раны, в том числе хронические, являющиеся последствием сахарного диабета, ожогов, заболеваний вен, синдрома длительного раздавливания и др., представляют большую практическую и научную проблему. Длительно персистируя, раневые дефекты формируют стойкий болевой синдром, депрессивные состояния, являются источником инфекции и обусловливают до 4% экономических затрат системы медицинской помощи в развитых странах Запада [1]. Местное воздействие на область раневого дефекта, направленное на ускорение процесса регенерации, профилактику его инфицирования, достижение оптимального косметического результата, является актуальной проблемой современной хирургии [2]. Многообразие видов ран и психосоматический статус пациентов обусловливает необходимость разработки универсальных лекарственных форм, применение которых позволяло бы достигать надежного клинического результата в кратчайшие сроки без формирования нежелательных последствий консервативного воздействия. В настоящее время в мире существует большое количество лекарственных форм для местного применения, используемых в хирургии [3, 4], однако проведенные мета-исследования доказали ограниченную эффективность и рациональность их применения в клинической практике. Вместе с тем, одним из перспективных веществ для поиска высокоактивных ранозаживляющих агентов с высоким потенциалом безопасности является N-ацетил-б-аминогексановой кислота и ее производные, показавшие обнадеживающие результаты в ряде экспериментальных и клинических исследований. В этой связи цель настоящей работы - изучить ранозаживляющие эффекты двух отечественных производных N-ацетил-6-аминогексановой кислоты при инфицированных метициллин-резистентным штаммом Staphylococcus aureus ранах в эксперименте.
Материал и методы исследования. Эксперименты выполнены на 40 белых нелинейных крысах самцах исходным весом 260-300 г, полученных из питомника «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Животные, содержались в стандартных условиях вивария Центра перспективных исследований инновационных лекарственных веществ ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарёва» при соблюдении требований Европейской конвенции по защите позвоночных животных. Крысы после моделирования патологического процесса были рандомизированы на 4 подгруппы (по
10 особей в каждой): 1-я - контрольная подгруппа (плацебо), 2-я - подгруппа сравнения (крысы с экспериментальной раной, получавшие воздействие препаратом сравнения), 3-я и 4-я - животные с раневым дефектом, получавшие местное фармакологическое воздействие исследуемыми веществами ЛХТ-6-17 и ЛХТ-7-17 соответственно.
Циркулярная рана диаметром 0,8-1,0 см воспроизводилась в стерильных условиях у наркотизированных кетамином (30 мг/кг внутрибрюшинно) крыс путем отсечения лоскута, включающего кожу и подкожную жировую клетчатку, захваченного хирургическим пинцетом, в области срединной линии спины над областью поясничного отдела позвоночника по [5]. Кожа в месте манипуляции была предварительно лишена волосяного покрова и обработана антисептиком. После чего в рану при помощи микропипетки со стерильным наконечником незамедлительно вносили 10 мкл свежей культуры метициллин-резистентного Staphylococcus aureus (штамм XEN) в концентрации 5х107/мл. Рану оставляли открытой на весь период наблюдения. На 2, 5 и 9 сутки после воспроизведения раны на нее наносили тонким слоем: животным контрольной подгруппы - стерильный вазелин, животным подгруппы сравнения - тейкопланин, животным опытных групп - 1% мазь, содержащую ЛХТ-6-17 и ЛХТ-7-17 соответственно. Каждые 4 дня площадь раны измеряли планиметрически с помощью миллиметровой бумаги, вычисляли процент сокращения раневого дефекта. На 6 сутки свежую грануляционную ткань снимали, гомогенизировали и определяли активность свободно-радикальных процессов и общую антиокислительную активность методом индуцированной хемилюминисценции [6] с использованием спектрофотометра «Emilite 1210» (США). Количественное определение цитокинов - ФНО-альфа и ИЛ-10 - в грануляционной ткани осуществляли методом ИФА с применением наборов антител производства «Cusabio Biotech Co. LTD» (США).
В работе изучены кальциевая (ЛХТ-6-17) и серебряная (ЛХТ-7-17) соли N-ацетил-б-аминогексановой кислоты в виде магистральных 1% мазей производства АО «ВНЦ БАВ» (Россия). В качестве препарата сравнения применяли «Тейкопланин», лиофилизат 200 мг во флаконе, производства «Джодас Экспоим Пвт. Лтд.» (Индия), в виде магистральной 1% мази на вазелине.
Статистический анализ полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием параметрического критерия Даннета и одномерного дисперсионного анализа (ANOVA) для проверки нормальности распределения, при 5% уровне значимости с использованием пакета программ «SPSS», release 16.0 (США).
Результаты и их обсуждение. На первом этапе исследования оценили динамику сокращения размеров инфицированной раны в исследуемых группах. Площадь раны кожи крыс, получающих специфическое местное воздействие, в различные периоды наблюдения была различной, достигая статистической значимости (табл. 1). Так, в контрольной группе к 20-м суткам наблюдения у животных сохранялся раневой дефект площадью в среднем 10 мм2. Исследуемые вещества в мягкой лекарственной форме сокращали сроки эпителизации раневого дефекта, при этом параметры ранозаживляющего эффекта кальциевой и серебряной солей органической кислоты отли-
чались. Топическое воздействие веществом ЛХТ-6-17 в течение первых 16 суток не приводило к индукции репаративного эффекта, однако при сопоставлении площади раны в контроле и в группе животных на фоне вещества на 22 стуки наблюдения, отмечали значимую разницу, которая, в итоге отразилась на сокращении сроков эпителизации. Соединение ЛХТ-
7-17 же не уступало препарату сравнения тейкопла-нину, значительно сокращало сроки заживления гнойной раны.
При этом, необходимо заметить, что производные ^ацетил-6-аминогексановой кислоты оказывали также и благоприятное косметическое воздействие, уменьшая площадь формирующегося рубца. При межгрупповом сравнении нами получены достоверные результаты, свидетельствующие о более высоком темпе сокращения площади раневой поверхности на
8-20 сутки наблюдения на фоне топического использования вещества ЛХТ-7-17.
Таблица 1
Характеристика ранозаживляющего действия производных ^ацетил-6-аминогексановой кислоты
на модели инфицированной раны у крысы (М±5й)
Воздействие Площадь раны, мм2 Время эпители-зации,сут. Площадь рубца, мм2
Исход 8 сутки 12 сутки 16 сутки 20 сутки
Контроль 78+3 54+2 27+3 15+2 10+2 26,8+2,3 30+4
Тейкопланин 81+4 31+2* 11+1* 4+1* 0+0* 12,4+2,1* 18+3*
ЛХТ-6-17 79+3 49+3А 20+2А 13+3А 4+2* 20,3+1,7А 26+3
ЛХТ-7-17 77+3 38+3А* 15+3* 9+1*А 0+0* 14,0+1,5* 20+2*
Примечание. * - различия при сравнении с контролем значимы при р <0,05; А - различия при сравнении с тейкопланином значимы прир <0,05 (критерий Даннета).
Поскольку в основе повреждающих и репаратив-ных процессов в коже лежат универсальные свобод-норадикальные процессы, изучили влияние топического воздействия фармакологических агентов на ли-поперекисную и антирадикальную активность грануляционной ткани, формирующейся к 6 суткам после нанесения плоскостной инфицированной раны (табл. 2). Мы установили, что у животных контрольной группы наблюдается дисбаланс изучаемых процессов в сторону преобладания активности перекисного окисления липидов. Антиоксидантный потенциал ткани существенно снижен. На фоне местного воздействия препаратом сравнения тейкопланином регистрировали восстановление антирадикальной активности ткани, соответствующей таковой у интактных животных. Исследуемые соединения по-разному влияли на свободнорадикальные процессы в свежей грануляционной ткани: более мощным оптимизирующим воздействием обладала серебряная соль ^ацетил-6-
аминогексановой кислоты, на фоне топического воздействия которой удалось достичь результатов препарата сравнения. Кальциевая соль уступала по антиокислительной активности веществу ЛХТ-7-17.
При анализе тканевой концентрации провоспали-тельного (ФНО-альфа) и противовоспалительного (ИЛ-10) цитокинов в грануляционной ткани обращало на себя внимание преобладание тканевого содержания ФНО-альфа в группе крыс контрольной подгруппы, тогда как концентрация ИЛ-10 была значительно сниженной (табл. 2). Местное воздействие исследуемыми производными приводило к снижению тканевого содержания ФНО-альфа и восстановлению продукции регуляторных молекул с противовоспалительным действием (ИЛ-10), в большей степени выраженное на фоне воздействия препаратом сравнения и серебряной солью ^ацетил-6-аминогексановой кислоты.
Таблица 2
Свободнорадикальная активность и концентрация некоторых цитокинов в грануляционной ткани на 6 сутки после формирования инфицированной раны кожи крыс на фоне топического
воздействия ЛХТ-6-17 и ЛХТ-7-17 (IW±SD)
Воздействие Интенсивность ПОЛ имп./с ОАО имп./с ФНО-альфа пг/мл ИЛ-10 пг/мл
Контроль 115+4 17+3 33+2 4+1
Тейкопланин 48+3* 49+4* 13+2* 15+3*
ЛХТ-6-17 79+4*А 36+5* 24+3*А 10+2*
ЛХТ-7-17 55+3* 42+6* 15+3* 17+3*
Примечание. ПОЛ - перекисное окисление липидов; ОАО - общая антиоксидантная активность ткани; * - различия при сравнении с контролем значимы при р<0,05; А - различия при сравнении с тейкопланином значимы при р<0,05 (критерий Даннета).
Заключение. Любое нарушение барьерной функции кожи драматически повышает риск развития инфекционного процесса. Эффективным методом его профилактики является использование топических противомикробных лекарственных средств. Оптимальными характеристиками для подобного рода консервативного местного воздействия являются широкий спектр антимикробной активности, высокая способность к стимуляции регенерации, экономическая доступность лекарственной формы. В настоящей работе были изучены два перспективных вещества, являющиеся производными N-ацетил-б-аминогексановой кислоты - серебряная и кальциевые соли. В качестве модели раны была выбрана циркулярная кожная плоскостная рана, инфицированная возбудителем, наиболее часто вызывающим развитие нозокомиальных инфекций. В результате проведения работы было показано, что кальциевая и серебряная соли N-ацетил-б-аминогексановой кислоты в виде 1% мази при трехкратной аппликации на место раневого дефекта ускоряют заживление плоскостной инфицированной метициллин-резистентным золотистым стафилококком кожной раны, снижают площадь формирующегося рубца. Наибольшим ранозаживляющим эффектом, проявляющимся в значительном сокращении сроков эпителизации, является серебряная соль. При изучении некоторых важнейших механизмов влияния топического воздействия на процесс заживления раны было установлено, что в основе консервативного воздействия лежит способность веществ подавлять местные свободно-радикальные реакции, активировать антиоксидантную активность грануляци-
онной ткани, оптимизировать тканевое содержание про- и противовоспалительных регуляторных молекул - фактора некроза опухоли-альфа и ИЛ-10. При этом наиболее контрастные результаты получены при применении соединения ЛХТ-7-17, не уступающего по своим характеристикам препарату сравнения тейко-планину.
Выводы:
1. Соли ^ацетил-6-аминогексановой кислоты, в большей степени серебряная (ЛХТ-7-17), при местном воздействии более, чем в два раза по сравнению с контролем ускоряют эпителизацию плоскостной инфицированной раны кожи крыс, сокращают площадь формирующегося рубцового дефекта.
2. Установленный эффект может быть обусловлен оптимизацией местных свободно-радикальных реакций и тканевой концентрации цитокинов, участвующих в регуляции воспалительных и регенеративных процессов.
Информация о финансировании. Исследование проведено при частичной финансовой поддержке Медицинского института ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарёва».
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности. Авторы признательны руководителю отдела химии и технологии синтетических лекарственных средств АО «ВНЦ БАВ» лауреату Государственной премии РФ, д.х.н., профессору С.Я. Скачиловой за любезно предоставленные мягкие лекарственные формы исследуемых веществ.
