CC BY
17
преимуществ по сравнению с обычными материалами для ортопедических имплантатов, такими как нержавеющая сталь, титан и его сплавы, керамика и биорезорби-руемые полимеры [1,2]. Основные области применения медицинских изделий на основе магния в настоящее время включают сердечно-сосудистые стенты, штифты для фиксации костей, а также винты. Материалы для имплантатов с механическими свойствами близкими к костным, могут вовлекать окружающую костную ткань в нагрузочные процессы и тем самым снижается возможность расшатывания крепления имплантата [2]. Сплавы магния считаются перспективными заменителями постоянных имплантатов из-за их биорезорбции в физиологической среде, что исключает повторное хирургическое вмешательство.
В настоящей работе исследована биосовместимость магниевых сплавов Mg-Zn-Ca-Mn и Mg-Zn-Ga, с организмом человека для применения в качестве материала для имплантатов, используемых при остеосинтезе. Было показано, что сплавы после горячей экструзии демонстрируют хорошие механические свойства и низкую скорость коррозии в растворе Хэнкса. Для исследования концентрации элементов экстрактов использовался метод атомно-эмиссионной спектрометрии. Концентрация элементов увеличивается по линейной зависимости с увеличением времени выдержки сплава в среде DMEM/F12. Концентрации химических элементов в экстрактах, полученных из сплавов, находятся в предельно допустимых значениях для организма человека.
In vitro цитотоксичность экстрактов была исследована методом МТС-теста на клеточной линии MG63 в соответствии с ISO 10993-5. Высокая цитотоксичность достигается только для 100 % экстракта (без разбавления] причиной высокий рН клеточной среды жизнеспособность клеток снижена до 60%. В процессе раститровки 50, 25 и 12,5% клеточной среды заменялось на экстракт, что способствовало увеличению жизнеспособность клеток от 85%.
Цитотоксического действия сплавов на клетки MG63 не наблюдалось, и в сочетании с механическими и коррозионными свойствами эти сплавы подходит для применения в медицине.
Литература:
1. С.Л. Синебрюхов. Запорожский медицинский журнал. —
2013. — Т. 6. — № 81. — С. 76-79.
2. Witte F. Acta Biomatenialia. — 2010. — Vol. 6. — № 5. — P.
1680-1692.
РАЗРАБОТКА СТРАТЕГИИ ВАЛИДАЦИИ МЕТОДИКИ АВТОМАТИЧЕСКОГО ПОДСЧЕТА КЛЕТОК
Н.С. Покровский, М.А. Водякова, Е.В. Мельникова
ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России, Москва, Россия e-mail: pokrovskY.ns@gmail.com
Ключевые слова: валидация, счетчик клеток, гемоцито-метр, жизнеспособность, экспертиза качества.
Разработка и производство продуктов, содержащих в своем составе жизнеспособные клетки человека, требует поддержания определенных параметров качества и безопасности на протяжении всего процесса. К таким параметрам относятся жизнеспособность, а также минимально необходимое количество клеток. Контроль этих показателей обеспечивает точный подбор дозы для
достижения безопасности и эффективности выпускаемого продукта.
Традиционный способ подсчета клеток и оценки их жизнеспособности подразумевает использование красителей (например, трипановый синий] и гемоцито-метра. Такой метод является золотым стандартом в первую очередь из-за его низкой стоимости, универсальности и простоты. Однако использование гемоцитометра имеет существенные недостатки (особенно для масштабных производств], такие как трудоемкость и высокая длительность процесса подсчета и пробоподготовки. Кроме того, непосредственное участие оператора в процессе подсчета вносит существенный вклад в повышение коэффициента вариации, а также требует большого количества сотрудников для параллельного подсчета нескольких образцов.
Автоматические счетчики клеток (такие как Cedex (Roche, Швейцария], Countess II (Invitrogen, США], Vi-CELL XR (Beckman Coulter, США] и другие] позволяют преодолеть ограничения традиционных ручных методов, снижая трудозатраты и повышая точность подсчета путем автоматизации процесса и исключения человеческого фактора.
Для валидации методики автоматического подсчета клеток согласно ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик» ГФ РФ XIV необходимо определять такие параметры, как специфичность, аналитическая область, линейность, правильность и прецизионность для общего количества клеток и процента жизнеспособности. В настоящее время в научной литературе представлены единичные публикации, описывающие подходы к валидации методик подсчета клеток в автоматическом режиме с использованием счетчиков клеток. Изучив представленные литературные данные, а также нормативную документацию, в рамках этой работы была разработана стратегия валидации методики автоматического подсчета клеток, заключающаяся в разработке дизайна эксперимента, подборе стандартов, экспериментальных точек и установлении критериев приемлемости для оценки полученных результатов. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00001-22-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР 121021800098-4].
РЕГЕНЕРАТИВНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК В АСПЕКТЕ ЛЕЧЕНИЯ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОГО РУБЦА МАТКИ
А.Г. Полешко1, С.И. Михалевич2, С.А. Креер2, И.Д. Волотовский1
1 Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси, Минск, Республика Беларусь
2 Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск, Республика Беларусь
e-mail: renovacio888@yandex.ru
Ключевые слова: рубец матки, мезенхимальные стромаль-ные клетки, коллаген.
На сегодня наблюдается высокая распространенность кесарева сечения (КС) при оперативном родо-разрешении, что связано со многими факторами, в т. ч. с увеличением числа первородящих пациенток позднего
репродуктивного возраста. При этом формирование неполноценного рубца на матке после КС является актуальной проблемой современной гинекологии, которая приводит к угрозе разрыва матки во время последующей беременности, повышению вероятности невынашивания беременности, нарушению прикрепления плаценты к стенке матки, плацентарной недостаточности. В связи с этим актуальна разработка подходов к восстановлению тканей матки с формированием полноценного рубца после оперативного родоразрешения в т. ч. с использованием клеточной терапии.
Цель данного исследования — изучить иммуногисто-химические характеристики тканей матки кроликов при восстановлении после моделирования послеоперационного рубца матки на фоне введения клеточного продукта на основе мезенхимальных стромальных клеток (МСК). Предмет исследования — экспрессия коллагена (Coll) I и III типа, вносящих значительный вклад в механическую прочность ткани матки, и их соотношение по содержанию: в интактной мышечной ткани матки оно приближено к 1:1. МСК выделяли из биоптатов жировой ткани ферментативным способом по стандартной методике и культивировали в стерильных условиях при 37°С, 5% СО2, 100% влажности в ростовой среде (а-МЕМ, 10% фетальной бычьей сыворотки, 2mM глу-тамина, 1% смеси антибиотиков-антимикотиков). В эксперименте использовали жизнеспособные культивированные клетки (95-98%) 3 пассажа, имеющие фенотип CD29+/CD44+/CD90+/CD105+/CD34-/CD45-. Моделирование рубцового процесса: под действием наркоза контрольным и опытным животным в области матки, острым путём на расстоянии 1 см от места срастания маточных рогов производили два разреза через все слои размерами 1 см на правом и левом рогах матки. Раны ушивали непрерывным швом. В сформированные разрезы в матке кроликов опытной группы после ее ушивания в область потенциального формирования рубца вводили МСК. По истечении срока наблюдения (7-е, 14-е сутки и спустя 30 суток после оперативного вмешательства) животные контрольной и опытной группы выводились из эксперимента с соблюдением принципов биоэтики в соответствии со стандартами GLP и производился забор их маток. Образцы ткани фиксировали и по стандартной методике подготавливали для иммуно-гистохимического окрашивания с использованием первичных антител к Coll I, III и коммерческой системы визуализации антител «2-step plus Poly-HRP Anti Rabbit/ Mouse IgG Detection System» (Elabscience). Количественную оценку экспрессии Coll I, III выполняли путем анализа цифровых изображений с использованием алгоритма «positive pixel count» программы для морфометрии «Aperio Image Scope 12.1.0.5» и расчёта индекс экспрессии исследуемых маркеров. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 10.0. В результате исследования выявлено, что при травматическом повреждении тканей матки в эксперименте развивается нарушение их морфологии, развивается дезорганизация, дискомплексация слоев. При этом восстановительный процесс в тканях матки животных, которым вводили МСК в место формирования потенциального рубца, был более полноценным, по сравнению с таковым в случае без введения клеток, соотношение Coll I и III было близко к 1:1. Можно сделать вывод, что применение МСК у животных в эксперименте по формированию модели рубцовых процессов позволяет оптимизировать регенерацию тканей матки, ускорить сроки и повысить эффективность ее восстановления.
РАЗРАБОТКА БИОТКАНИ НА ОСНОВЕ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО БИОГЕЛЯ ДЛЯ ТЕРАПИИ СИНДРОМА АШЕРМАНА
Р.А. Полтавцева, А.Ю. Пульвер, Н.А. Пульвер, Е.В. Свирщевская
ФГБУ НМИЦ акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия
e-mail: rimpol@mail.ru
Ключевые слова: биогель, биоткань, синдром Ашермана, противоспаечный эффект.
Основной причиной вторичного бесплодия является механическая травма базального слоя эндометрия после родов или аборта, что в ряде случаев приводит к формированию не рассасывающихся спаек—синехий. В данной работе разработан биоматериал (Биоткань, БТ) на основе термочувствительного биополимера поли-1\1-изопропилакриламида (ПНИПААм), конъюгированного с биологическими добавками для терапии вторичного бесплодия.
В состав БТ входят белки тромбоцитарного лизата (ТЛ) плазмы крови и экстракт внеклеточного матрикса (ВКМ), выделенный из ткани эндометрия в соотношении ПНИПААм, ВКМ, ТЛ как 10:3.5:1.5. В качестве контроля использовали гель на основе коллагена. Исходный гель ПНИПААм не токсичен, что показано в экспериментах in vitro с использованием панели клеточных линий и ме-зенхимальных стволовых клеток (МСК), выделенных из эндометрия человека. Очищенный ТЛ обладал стимулирующим эффектом (на 15-20%) в культурах in vitro, после конъюгации с ПНИПААм эффект снижался, но был достоверным (5-12%). Очищенный компонент ВКМ оказывал стимулирующее влияние на МСК, полученные из эндометрия, но не влиял на пролиферацию клеточных линий. При конъюгации эффект ВКМ на МСК сохранялся (5-10%). Полученная БТ стимулировала пролиферацию, метаболическую активность клеток и повышала адгезию к белкам внеклеточного матрикса МСК. Полученная БТ сохраняла способность к застудневанию при 32 оС. Таким образом, в экспериментах in vitro показали, что БТ, сохраняла свойства термочувствительности и биоактивности.
Для анализа противоспаечного эффекта in vivo нами была разработана экспериментальная модель повреждения глубоких слоев эндометрия на маточных рогах крысы, что приводило к формированию синехий. Введение БТ в полости оперированных рогов приводило к частичному восстановлению эндометрия. Далее проводили анализ наступления беременности, для этого через 3 недели после операции самок подсаживали к самцам. Анализ наступления беременности отслеживали по весу оперированных самок. Финальные результаты оценивались по количеству родившихся крысят, с последующим патолого-анатомическим и гистологическим анализом маточных рогов. Показали количество крысят у оперированных крыс, хотя их количество было меньше нормы (2,3 ± 1,5 против 4,2 ± 2,1 на каждый маточный рог соответственно).
Таким образом, проведенные исследования позволили разработать биоткань на основе ПНИПААм, конъюгированного с биологически активными субстанциями, обладающую противоспаечной активностью, позволяющей как частично восстановить эндометрий матки, так и обеспечить имплантацию яйцеклеток. Работа выполнена по государственному заданию Министерства Здравоохранения Российской Федерации на 2020-2022 годы (№ АААА-А20-120022790039-1).
