CC BY
38
УДК 577.151.34
РЕФОЛДИНГ ГЕКСАГИСГИДИНСОДЕРЖАЩЕЙ ОРГАНОФОСФАТГИДРОЛАЗЫ ИЗ ТЕЛЕЦ ВКЛЮЧЕНИЯ
Д.А. Гудков, E.H. Ефремснко
(кафедра химической этимологии, химический факульпюп /e-mail: [email protected])
Mi клеток Е. coli DH 5а выделены и очищены тельца включения, содержащие органофос-фаттидро.тазу, с гекса!ИСТНДИНОВОЙ иос.тедоваге.тыюстыо на N-копце молекулы белка. При исследовании процесса с о люби ли зации телец включения были установлен!,! оптимальные условия его проведения: 6 M мочевины в фосфатно-солевом буфере с pH 7,6; 37°С; 2 ч. Проведен рефолдннг фермента из растворов солюбнлнзированпмх телец включения с использованием металл-хелатирующей хрома roi рафии. Изучен процесс активации фермента после проведения рефолдинга. Показано, что максимум активности фермента может быть достигнут после 24 ч его инкубирования при 4°С в среде с 0,05 M С03:-вонов в присутствии ионов Coï+(10"5M).
Органофосфатгидролаза {ОРН. ЕС 3.1.8.1) катализирует гидролиз фосфорорганических соединений, к числу которых относятся пестициды, широко применяемые в сельском хозяйстве, и боевые отравляющие вещества (зарин, зоман, Vx) [!, 2]. Генетическая модификация ОРН введением на N-конец молекулы белка гексаги ст иди новой Н ^-последовательности позволила существенно упростить процедуру выделения белка и получить высокоактивный фермент His6-OPH с эффективностью каталитического действия, существенно улучшенной по сравнению с нативной ОРН в отношении ряда субстратов [3]. Вместе с тем созданная для биосинтеза данного белка в клетках Е. coli высокоэффективная система экспрессии pTES-His6-OPH [4], позволившая получать высокий вы\од фермента от суммарного клеточного белка (до 45%) [3]т об ее печи ват а выход большей его доли (до 60%) в виде неактивных нерастворимых телец включения (ТВ) независимо от используемого дня трансформации штамма-хозяина.
Исследование возможности проведения рефолдин-га данного белка представляет большой интерес, так как позволяет рассчитывать на то. что последовательное выделение из клеток и очистка растворимой формы His6-OPH с последующим рефолдингом His6-ОРН из ТВ при употреблении одного и того же клеточного материала может обеспечить более полное и рационатьное использование биомассы клеток, а также суммарно увеличить выход активной рекомбинан-тной формы фермента.
Считается, что проведение рефолдинга белков, содержащих полигистидиновые последовательности, в
техническом плане имеет ряд существенных преимуществ перед белками, не содержащими такие последовательности [5]. Это обусловлено тем, что становится возможным применение металл-халатирующей хроматографии, в основе проведения которой лежит образование прочного комплекса образущегося между введенной на один из концов молекулы белка
Ш56-последовательностью и ионами металла (чаще ■2 + 2+
всего N1 или Со ), которыми заряжен хроматогра-фический носитель, предварительно модифицированный хелатирующими лигандами. Показано, что образование таких металло-комплексов возможно даже в растворах с большими концентрациями хаотропных агентов, таких как мочевина или гуанидиний гидрохлорид [6-10]. В результате молекулы фермента оказываются прочно иммобилизованными на носителе, что позволяет, во-первых, существенно упростить процедуру очистки ТВ от клеточного дебриса, а во-вторых, осуществить распределение молекул белка в объеме носителя и удерживать их на определенном расстоянии друг от друга, и тем самым снизить возможность их агрегации в процессе рефолдинга. Следует отметить, что агрегация молекул белка считающаяся негативным явлением, проявляющимся при рефолдинге, возникает в результате межмолекулярных взаимодействий гидрофобных участков белковых глобул, а также при их взаимодействии с гидрофобными компонентами клетки, которые переходят в раствор при солюбилизации ТВ [5].
В качестве носителя для металл-хелатирующей хроматографии чаще всего применяется агароза, модифицированная нитрилотриуксусной кислотой (МТА)
15 ВМУ, химия, № б
■2+
и заряженная ионами Ni [6-10j. а в качестве денатурирующих агентов - мочевина 15-10J и гуанидиний гидрохлорид [9, 10]. Оптимальные условия проведения рефолдинга не поддаются строгой систематизации и являются уникальными для каждого конкретного белка.
В настоящей работе ятя иммобилизации His6-OPH использован полученный при замораживании псшимери-зующейся системы (крио-ПААГ) полиакриламидный
гель, модифицированный остатками иминодауксусной
"2+
кислоты (IDA) jlí,!2] и заряженный ионами Со (Со -ША-крио-ПААГ) [13]. Выбор данного носителя дтя проведения рефолдинга His6-OPH обусловлен тем, что крио-ПААГ обладает существенно большим размером пор по сравнению с агарозой [11,12]. что должно способствовать улучшенному пространственному разделению молекул белка по сравнению с низкопористыми носителями на основе агарозы.
Сохранение вторичной структуры белка в процессе его денатурации является важным фактором с точки зрения эффективности рефолдинга, так как это связано с функциональной способностью молекулы ренату -рировать в правильном направлении [14]. В качестве хаогропного агента использов&ти только мочевину, поскольку известно, что использование гуанидиния гидрохлорида для денатурации нативной ОРН приводит к необратимым изменениям во вторичной структуре фермента [15].
Помимо денатурирующего агента на эффективность рефолдинга влияет рН среды [14]. Согласно литературным данным |16|, полученным методом кругового дихроизма, вторичная структура нативной ОРН в значительной степени зависит от рН раствора Показано, что фермент принимает правильную кон-формацию при рН 7,6, что соответствует его изоэлек-трической точке. При этом значении рН проводили процессы денатурации и рефолдинга.
Цель данной работы заключалась в том, чтобы продемонстрировать принципиатьную возможность рефолдинга His,--ОРН из ТВ и исследовать влияние условий его проведения на выход активной формы фермента из клеточной биомассы. Следует отметить, что ранее рефолдинг органофосфатгидролазы никем не проводился.
Экспериментальная часть
В работе использован! параоксон (диэтил л-нитро-фенилфосфат), 2-[1М-циклогексиламино]этансульфоно-вую кислоту (CHES, pKf; 9,3), имидазол, хлорид кобальта шестиводный. глицерин, бромфеноловый синий, кумасси бриллиантовый синий R-250, натриевая соль
ампициллина, яичный альбумин, додецилсульфат натрия - препараты фирмы "Sigma" (США); триптон, дрожжевой экстракт фирмы "Щ®" (США): акрила-мид, бисакриламид фирмы "Merck" (Германия), изопропид-2-Б-тио-галакгопиранозид (ИПТГ). маркеры для белкового электрофореза - набор белков с молекулярными массами 21,5; 31,0; 45,0; 66,2; 94,6 кДа фирмы "Fermentas" (Литва), N,N,N'N'-TeT-раметилэтилендиамин, персульфат аммония фирмы "Bio-Rad" (США). В качестве носителя для аффин-
ч ЭН-
НОЙ хроматографии использовали Со -IDA-крио-
ПААГ. предоставленный компанией "Protiste" (Швеция). Все остальные использованные в работе реактивы марки "ч.д.а." были приобретены в фирмах "Лабтехника" и "Химмед" (Россия).
Для получения ТВ использовали трансформированные плазмидой pTES-His6-OPH [4] клетки Е. coli DH5a, которые культивировали при 37°С в питательной среде следующего состава: триптон (12.0 г/л), дрожжевой экстракт (24,0 г/л), глицерин (4,0 мл/л), КН2Р04 (6,95 г/л), К2НР04хЗН20 (12,54 г/л), pH среды 7,0. Дтя индукции биосинтеза целевого белка в среду вносили ! мМ ИПТГ Через 5 ч посте индукции клетки осаждали центрифугированием (5000 g, 15 мин), ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (300 мМ NaCl, 50 мМ фосфата, pH 7,6) и подвергали дезинтеграции ультразвуком (частота 44 кГц, 6 раз по 45 с, между обработками биомасс}' выдерживали в течение 1 мин во льду). После центрифугирования (15000 g, 30 мин), осадок, содержащий ТВ, несколько раз промывали тем же фосфат-но-солевым буфером, дополнительно содержащим 1% Triton Х-100 дтя удаления остатков растворимой формы His6-OPH
Для солюбилизации ТВ использовали растворы мочевины разной концентрации, приготовленные на основе того же фосфатно-солевого буфера с добавлением 5 мМ имидазола. К навескам влажных ТВ добавляли растворы мочевины так, чтобы соотношение их масс составило 1:10. После тщательного ре-суспендирования с применением прибора "Vortex" {"Biosan", "Bio Vortex VI") проводили инкубирование полученных су спензий при 30 или 37°С при постоянном перемешивании на термостатируемом шейкере ( "Biosan ES-20", 200 об/мин). Дтя отделения нера-створившейся части ТВ использовали центрифугу "Beckman J-2-21" (США) (15000 g, 30 мин).
Перед нанесением солюбилизированного белка мегалл-хелатирующий носитель уравновешивали тем же буфером, в котором проводили солюбилизацию ТВ. Процесс нанесения раствора белка на хромато-
графический носитель, фолдинг His6-OPH в линейном градиенте концентрации мочевины и элюирование фолдированного белка с колонки в линейном градиенте концентраций имидазола (от 0 до 300 мМ) проводили при 4°С и скорости потока 0,5 мл/мин.
Уровень биосинтеза His6-OPH, а также гомогенность белкового препарата оценивши с помощью электрофоре™ческого анализа, который проводили в денатурирующих условиях в 12% ПААГ с использованием ячейки "Miniprotean II Bio-Rad" (США), с последующим окрашиванием Кумасси R-250.
Концентрацию белка определяли методом Бред-форд [17] с применением реагента фирмы "Bio-Rad" (США)
Активность фермента определяли спектрофотомет-рически (спектрофотометр "Agilent 8453-UV", Германия) при 25°С по накоплению продукта гидролиза 1мМ параоксона (4-нитрофенолят аниона) при 405 нм в 50 мМ карбонатном буфере (pH 10,5, е 18000 М 'см 1). Каталитическу ю реакцию инициировали внесением раствора Hisf)-OPH в кювету с бу фером и с\бстратом так. чтобы концентрация фермента
л—10 1 л—9
в реакционной среде составляла 10 —10 М.
За единицу' ферментативной активности принимали такое количество феру1ента, которое обеспечивало гидролиз 1мкмоль субстрата за 1 мин при 20°С и pH 10,5.
Расчет скоростей феруюнтативной реакции проводили по начальныУ1 линейныУ1 участкам кинетических кривых (v0 = lg ot)
Результаты и их обсуждение
Первоначально при подготовке ТВ к солюбилиза-ции необходимо было максимально избавиться от присутствия раствориуюй активной фору1ы His6-OPH во влажном осадке ТВ для более точной оценки эффективности процесса рефолдинга и расчета выхода фермента в активной форме. В связи с этим проводилась трехкратная промывка осадка ТВ фосфатно-со-левым буфером, содержащим 1% Triton Х-100. Выбор таких условий подготовки ТВ к солюбилизации был обусловлен наличием многочисленных литературнь[х данных |7, 9-10, 18-20], согласно которьш в присутствии детергента Triton Х-100 отмывка ТВ проходит наиболее эффективно. Остаточная ферментативная активность в осадке контролировалась на каждом этапе обработки ТВ.
Вместе с тем абсолютного удаления растворимой фору1ы из осадка ТВ достичь не удалось, и остаточная активность после всей процедуры оту1ывки со-ставляла 1,6х 10 " ед/мг.
Зависимость эффективности солюбилизации ТВ от условий проведения процесса. Первоначально необходимо было определить концентрацию мочевины, обеспечивающу ю максимальный переход белка из осадка ТВ в раствор. Для этого солюбилизацию ТВ проводили в растворах мочевины разной концентрации при 37°С. Эффективность процесса перехода балка в раствориму ю форму контролировали электро-форетически. Из рис. 1 видно, что при увеличении концентрации мочевины, которая применялась для обработки ТВ, наблюдалось увеличение полосы, соответствующей У1ассе целевого белка (36 кДа) от I к 3 дорожке электрофореграммы. При этом белковая полоса на 4 дорожке практически не отличалась по ширине от аналогичной полосы на 3 дорожке, что указывает на нецелесообразность увеличения концентрации используемого денатурирующего агента свыше 6 М, так как концентрация белка переходящего в растворимую форму из осадка ТВ, не увеличивается. Следует отметить, что похожие резу льтаты ранее были по,лучены для других полигистидинсодержащих белков [7, 8]. Помимо этого, согласно литературным данным по денату рации нативной ОРН в растворах мочевины с различной концентрацией 115], 8 М растворы этого денату рирующего агента полностью разрушают вторичную стру кту ру- фермента которая сохраняется более чем на 50% вплоть до концентрации 7 М. При дальнейшей оптиушзации процесса солюбилизации ТВ, учитывая полученные результаты, использовали растворы мочевины с концентрацией до 6 М.
Предварительные эксперименты показали, что эффективность растворения ТВ зависит от многих факторов. в частности от температу ры проведения процесса времени экспонирования белка в растворе со-
кДа 66,2
45,0
31,0 21,5 14,4
Рис. 1. Электрофоре грамма, отражающая уровень растворения ТВ в зависимости откшщешрации мочевины в 50 мМ фосфатно-солевом буфере с 300 мМКаС! (рН 7,6): 1-2М;2-4М;3-6 М; 4 - 8 М; М - маркеры молекулярного веса
16 ВМУ,\имия7№6
любилизирующего агента и концентращп! хаотропного агента (в данной работе - мочевины). Для исследования влияния этих основных факторов на процесс СОЛюбилизации нерастворимой Hisf-OPH навески влажных ТВ ресуспендировали в одинаковых объемах растворов мочевины разной концентрации (2 М. 4 М и 6 М), при этом время экспонирования суспензии ТВ при 30 или 37°С варьировали от 2 до 14 ч. Анализ эффективности солюбилизации ТВ проводили электрофоретически. Согласно полученным результатам (рис. 2), при увеличении концентрации мочевины, а также температу ры процесса солюбилизации ТВ доля белка, переходившего в растворимую форму, увеличивалась. Об этом с видел ел ьств о вал а нарастающая толщина полосы в области 36 кДа Было показано, что при длительности процесса солюбилизации свыше 2 ч содержание His6-OPH в растворе остается неизменным.
В результате проведенных экспериментов было установлено, что благоприятными условиями для солюбилизации нерастворимой формы His6-OPH являются: 6 М мочевина. 37°С и время экспозиции ТВ в мочевине 2 ч.
Проведение рефолдинга на метапл-хелатирую-щем носителе. Известно, что ренатурация in vitro протекает по пути, в основном повторяющему природный, но в искусственной среде путь может разветвляться. приводя в итоге к неправильному сворачиванию полипептидных цепей. Правильное протекание процесса зависит от условий среды, которые не должны препятствовать реализации нативной структуры белка. Состав, температура, рН среды, концен-
М кДа 66,2
Рис. 2. Электрофореграмма, отражающая эффективность растворения ТВ к зависимости от используемой концентрации мочевины в 50 мМ фосфатно-солевом буфере с 300 мМ NaCl (рН 7,6), температуры и времени инкубирования: I - 2 М, 30°С, 2ч;2-2М, 30°С, 14 ч; 3 - 4М, 30°С, 2ч;4-4М, 30°С, 36 ч, 5-4 М, 37°С, 2 ч; 6 - 6 М. 37°С, 2 ч, 7 - 6М; 37°С, 10 % М - маркеры молекулярного веса
трация белка и денатурирующего агента оказывают существенное влияние на рефолдинг белка [14]. От этих параметров зависит общий заряд и степень гидратации молекулы, величина и соотношение ее заряженных участков, степень их взаимодействия, что определяет ее кон формацию, которая в гораздо большей степени зависит от свойств среды перед ренату-рацией, чем нативная. Кроме того, ТВ содержат целевой продукт в комплексе с липидными компонентами клетки, нуклеиновыми кислотами и клеточными белками. Эти компоненты могут препятствовать приобретению белковой молекулой нативной пространственной структуры. Освобождение от этих примесей является необходимым условием успешной ренатура-ции [141.
Опираясь на результаты, полученные в результате предыдущих экспериментов и анализа литературных данных, начальные условия проведения рефолдинга было решено сделать следующими: 50 мМ фосфатый буфер. рН 7,6, 300 мМ №С!. 6 или 4 М мочевина 5 мМ имидазол, 20 или 4°С, Присутствие имидазола в буфере было необходимо для того, чтобы снизить неспецифическое связывание примесных компонентов, возможно, присутствовавших в солюбилизированных ТВ. с хроматографическим носителем.
Поскольку при понижении температуры процесса рефолдинга разница между минимумами энергии, соответствующими промежуточным состояниям молекулы балка, образующимся в ходе рефолдинга увеличивается, тем самым повышая вероятность попадания белковой глобулы в глобальный минимум, соответствующий нативной конформации. то было решено проводить рефолдинг Изб-ОРН при 4°С.
Профиль процесса рефолдинга Н1я6-ОРН из ТВ. солюбилизированных в фосфатно-солевом буфере, содержащем 6 М мочевины, при 4°С отражен на рис. 3. Контроль процессов нанесения и элюирования проводили электрофоретически (данные не приводятся). По уменьшению ширины полосы в области 36 кДа был сделан вывод об успешной иммобилизации препарата на носителе.
Скорость линейного градиента мочевины поддерживалась низкой (-0,15 М/ч) Согласно известным результатам [7-10], низкие скорости снижения концентраций хаотропных агентов способствуют протеканию процесса рефолдинга в правильном направлении и увеличивают выход нативной формы фермента Было установлено, что фермент элюируегся с носителя в линейном градиенте имидазола при концентрации 50— 150 мМ. Те же условия элюирования ранее были установлены для растворимой формы Мз^-ОРН [4].
2 3 я
м
о
4 Ж
г
Объем буфера, мл
Рис. 3. Хроматографический профиль, отражающий нанесение раствора ТВ, солюбипизированных и 6М мочевине, на хроматографический носитель Со2+-ГОА-криоПААГ, рефолдинг о ел к а и его элюирование. Буфер 1:50 мМфос-фашо-солевой б\ ферс 300 мМ ЫаС1 (р[! 7,6), линейный градиент мочевины 6-ОМ (/). Буфер 2: 300 50 мМ фосфат -но-солевой буфер с 300 \iMNaCl (рН 7,6). Буфер 3:50 мМ фосфатно-солевой буфер с 300 мМИаС1 (рН 7,6),
градиент имидазола 0-400 мМ (2)
Белок после рефолдинга, элюированый с металл-хелатирующего носителя, подвергали диализу против 50 мМ фосфатного буфера, содержащего 300 мМ ЫаС1 (рН 7,6). в течение 24 ч и проводили его активацию. Диализ №56-ОРН применяли для удаления имидазола из ферментного препарата, присутствие которого, согласно нашим данным, даже в незначительных концентрациях приводило к серьезным затруднениям при проведении активации фермента.
Активация фермента после рефолдинга. Активацию фермента Р^-ОРН проводили путем добавления к раствору фермента карбонатного буфера (до
' 2 +
конечной концентрации 50 мМ) и ионов Со (до 10 М), концентрация фермента при этом составляла 1,2x10 7 М.
Известно, что ОРН является металлоферментом с двумя ионами Со2 в активном центре и проявляет максимальную ферментативну ю активность в присут-
2 I
ствии ионов Со в растворе [1, 2|. Кроме того, известно. что ионы металла в активном центре ОРН координированы при у частии карбаУ! ил ированного остатка Ьуэ-169 [21]. который в апо-форме фермента не модифицирован. Также известно, что при концентрации бикарбоната от 30 до 50 мМ ускоряется процесс формирования активного центра фермента [22]. Науш показано, что в присутствии 0,05 М карбонат-ионов и ионов Со2 (10 5М) в буферах с рН 10,5 и 9,0 активность рсфолдированного фермента Р^-ОРН достигает максимума в течение 24 ч при 4°С (рис, 4).
Исследована зависимость активации фермента от рН среды. При этом использовался 50 У)М СНЕ5-буфер с 300 мМ 1МаС1 с различными значениями рН (8.0, 8,5 и 9.0). Максимум каталитической активности фермента был отмечен при рН 8,5 и 9,0 только через 10 дней после начала активации (рис.4). Таким образом, буферы, содержащие карбонат-ионы, оказались лу чшими для проведения активации исследуемого фермента.
Было у становлено, что уровень активности полученного рефолдированного белка (6200 ед/мг) и его каталитические характеристики полностью совпадают с таковыми, ранее установленными для растворимой формы Мэ^-ОРН [3].
В данной работе впервые была показана принципиальная возможность проведения рефолдинга Н1з6-ОРН из ТВ, солюбилизированных в мочевине, с использованием металп-хелатирующего носителя. Были установлены условия, максимально благоприятные для солюбилизации исследуемого белка. Проведен рефолдинг Н1б(-)-ОРН и показано получение высокоактивного белка с характерисгикауш, установленными аля растворимой фору1ы Н156-0РН.
Таким образом, достигнутый результат в процессе проведения рефолдинга Н!56-0РН из ТВ позволил существенно увеличить общий выход активной формы Н1з6-ОРН из клеточного У1атериала, который используется для выделения растворимой форУ1ы Шз^-ОРН,
17 ВМУ, химия, № 6
А, %
Í, ч
Рис. 4. Активация 1 lis6-OPI I в присутствии ионов Со*" в различных буферах: 50 мМ CHKS (/-рН 8,0;2-рН 8,5; З-рН 9,0), 50 мМCHES с добавлением 50 мМ СО,2-, рН 9,0 (/% 50мМ COO", рН 10,5 (2О
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ефреме и ко Е, Сергеева В. //Изв. РАН. Сер. Хим. 2001.10.
С. 1743.
2. ЕфремепкоЕ., Варфоломеев С. II Успех, биол. хим. 2004.44.
С. 307.
3. ВотчицеваЮ., ЕфременкоЕ., Алиев Т., Варфоломеев С. И
Биохимия. 2006.76. С. 216.
4. Ефременко E.II., Вотчитцева Ю. А., Алиев Т.К., Варфоло-
меев С.Д. II Патент РФ на изобретение № 2255975, (10.072005).
5. Jungbauer A., Kaar IV, SchlegR. Н Сип. Opm. Biotechnol.
2004.15. С. 487.
6. Тихонов Р., Печеное С., Гуревич А., ЕсиповР., Швец В.,
ВульфсонА. //Бвоорганическаяхимия. 2001.27. С. 40.
7. Lemerciera G., Bakalaraa N.. SantareUibX. Hi. Chromatogr.
B. 2003.786. P. 305.
8. GlynouK, IoannouP., Christopottlos Th. II Protein E.\pr. Purif.
2003.27. P. 384.
9. Vincent P., Dieryck IV., Maneta-Peyret L., Morcan P., Cassagne C., SaatarelliX. //J. Chromatogr. B. 2004.808.
P. 83.
10, Refmi В.. Qi O., Beermann Br., Hinz II.-J., Steinbüchel Л И
Biocliem J 2001.358. P. 263, П. Lozinsky V., Galaev L, Plieva E, So vina I., Jungvid H., MatríassonB. //TRENDSinBiotehnol. 2003.21. P. 445.
12. Arvidsson P., Plieva F., Lozinsky V., GalaevI., MattiassonB. Hi. Chromatogr A. 2003.986. P. 275.
13. E. Efremehko, Y. Votchitseva, F. Plieva, I. Galaev, B. Mat Hassan. //Appl. Microbiol. Biotechno!. 2006.70. P. 558.
14. Вульфсон А., Тихонов P., Печеное С. II Докл. РАН. 2001. 380. С. 400.
15. GrimdeyJ., SchohzM., PaceN., WüdJ. //Biochemistry. 1997. 36. P. 14366.
16. Zheng J., Const aniine C., Rastogi V., Cheng T.-Ch., DeFrank J., LeblancR. Hi. Phys. Chern. B. 2004.108. P. 17238.
17. BradfordM. //Anal. Biochcin. 1976.72. P. 248.
18. MiddelbergA. //TRENDSinBiotehnol 2002.20. P. 437.
19.LiM„ SuZk-G., Jam-on J.-Ch. //ProteinE\pr. Purif. 2004.33. P.l.
20. VallejoL., Riñas U. //Microb. Cell Fací. 2004.3. P. 11.
21. RaushelF. II Curr. Opin. Microbiol. 2002.5. P. 288.
22. Shim II, Raushel F. И Biochemistry. 2000.39. P. 7357.
Поступила с редакцию 13.06.07
THE REFOLDING OF ORGANOPHOSPHOROUS HYDROLASE CONTAINING THE HEXAHISTIDINE TAG FROM INCLUSION BODIES
D.A. Gudkov, E.N. Efremcnko
(Division of Chemical Enzymology)
The inclusion bodies of organophosphorous hydrolase with hcxahistidinc tag at the N-terminus of protein molecule were isolated from E.coli DH5± ceils and purified. Optimal conditions for solubilization of the inclusion bodies, as it was established, were following: 6 M urea i» phosphate-saline buffer with pH 7.6; 37°C; 2h. The refolding of the enzyme from solutions of solubili/ed inclusion bodies was carried out using metal-chela ting chromatography. The enzyme activation after its refolding was studied. It was shown that maximum of catalytic activity of the enzyme can be obtained after 24h-incubation at 4°C in solutions with 0.05M CO, -ions and Co ions
