Референтные значения состава кишечной микрофлоры у детей раннего возраста Текст научной статьи по специальности «Науки о здоровье»

И.В. НИКОЛАЕВА, В.А. АНОХИН, С.В. ХАЛИУЛЛИНА УДК б1б,34-008.87-053.з

Казанский государственный медицинский университет

Референтные значения состава кишечной микрофлоры у детей раннего возраста

I Николаева Ирина Венидиктовна

доктор медицинских наук, доцент кафедры детских инфекций

420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49а, тел. 8-960-037-70-17, e-mail: irinanikolaeva@mail.ru

Изучен качественный и количественный состав кишечной микрофлоры у 176 здоровых детей раннего возраста. У детей в возрасте старше 2 лет показатели кишечного микробиоценоза в 80% случаев соответствовали общепринятым нормативным показателям. Дети в возрасте от 1 месяца до 2 лет были часто колонизированы условно-патогенными микроорганизмами и в 22-43% случаев имели умеренный дефицит индигенных бактерий. На основании полученных данных разработаны нормативные показатели состава кишечной микрофлоры для детей раннего возраста.

Ключевые слова: дети раннего возраста, кишечная микрофлора, нормативные показатели.

I.V. NIKOLAEVA, V.A. ANOKHIN, S.V. KHALIULLINA

Kazan State Medical University

Reference values the intestinal microflora in infants

The qualitative and quantitative composition of the intestinal microflora was studied in 176 healthy infants. In children older than 2 years of data intestinal microbiota in 80% of cases were responded consistent with the generally accepted standard indicators. Children aged 1 month to 2 years were often colonized by opportunistic pathogens and in 22-43% of cases had moderate deficiency the indigenous bacteria. Based on these data the standards of performance of the intestinal microflora for young children were developed.

Keywords; young children, intestinal microflora, performance standards.

Кишечный микробиоценоз представляет одну из самых сложных групп микроорганизмов в микроэкологической системе человека и играет ключевую роль в поддержании гомеостаза его организма. Особенно важно значение микрофлоры для детей раннего возраста, поскольку в этот период происходит формирование многих органов и систем и закладывается фундамент будущего здоровья ребенка [1, 2]. В настоящее время отечественные исследователи указывают на частое несоответствие состава кишечной микрофлоры (КМФ) у детей раннего возраста рекомендуемым нормативным показателям [3, 4, 5]. В связи с этим, в практической педиатрии имеются сложности в интерпретации микробиологических исследований фекалий, что приводит к гипердиагностике дисбактериоза кишечника и необоснованной коррекции состава кишечной микрофлоры у здоровых детей [6, 7].

Целью исследования явилось определение референтных значений состава кишечной микрофлоры у детей раннего возраста.

Материалы и методы

Проведено бактериологическое исследование микрофлоры фекалий у 176 условно здоровых детей раннего возраста, из них - 86 (48,9%) мальчиков и 90 (51,1%) девочек. Для обследования отобраны дети, которые на момент обследования не имели симптомов острых заболеваний и имели нормальный стул. Дополнительными критериями включения в исследование являлись: роды естественным путем; гестационный срок при рождении 38-41 неделя, масса тела 3000-4000 г, грудное вскармливание не менее 6 месяцев, отсутствие в анамнезе антибактериальной, пробиотической терапии и ОКИ за 2 месяца до проведения исследования.

У 79 детей обследование проведено в динамике дважды в разные возрастные периоды. Всего обследовано в возрасте 1-6 месяцев - 66, 6-12 месяцев - 51, 1-2 года - 78 и 2-3 года -60 детей. Бактериологическое исследование фекалий и оценку полученных результатов проводили в соответствии с Отраслевым Стандартом «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91500.11.0004-2003, Приказ Министерства

Таблица 1.

Частота выделения индигенных бактерий у здоровых детей в количестве, соответствующем возрастной норме

Число детей абс. (%)

Микроорганизмы 1-5 мес 5-12 мес 1-2 г. 2-3 г.

n=66 n=51 n II 00 n =60

Бифидобактерии 44 36 бТ б2

(10-11 lg КОЕ/г) (бб^б^о/о) (TG,6±6,4%) (73,1±6,G%) (S6,7±3,S%)

Лактобактерии бб 4S 74 6s

(6-8 lg КОЕ/г) (S4,S±4,4%) (94,1±3,3%) (94,9±2,б%) (9б,Т±4,1%)

М/к стрептококк 4S 39 63 54

(7-8 lg КОЕ/г) (Т3,б±б,4%) (Тб,б±б,9%) (SG,S±4,6%) (9G±6,4%)

Энтерококк 4S 39 бб бб

(5-8 lg КОЕ/г) (Т3,б±б,4%) (Тб,б±б,9%) (S4,6±4,1%) (93,3±4,б%)

E. соИ Lac + бб 47 74 бб

(7-8 lg КОЕ/г) (S4,S±4,4%) (92,1±3,S%) (94,9± 2,б%) (93,3±4,б%)

здравоохранения РФ № 231 от 09.06.2003). Для статистической обработки результатов использована программа «Statistics 8,0». Рассчитаны следующие показатели: геометрическое среднее (G), стандартное отклонение (SD), референтный интервал, межквартильный размах. Для определения достоверности различий средних сравниваемых величин (p) в несвязанных группах использовали критерий Манна-Уитни (U-критерий). Анализ категориальных данных проводили с использованием точного критерия Фишера (F-критерий). Определение референтных значений состава кишечной микрофлоры проводили по стандартной методике с использованием метода персентилей [8].

Результаты исследований

Нормальный состав (эубиоз) кишечной микрофлоры по общепринятым нормативным показателям констатирован у детей в возрасте 1-5 месяцев - в 6 (9,1%), 5-12 месяцев -в 9 (17,6%), 1-2 лет - в 28 (35,9%) и 2-3 лет - в 48 (80%) случаях. Нормальный уровень всех индигенных бактерий выявлен в возрасте 1-5 месяцев в 37 (56,1±9,4%), 5-12 месяцев -в 33 (64,7±9,8%), 1-2 лет - в 61 (78,2±7,9 %) и 2-3 лет -в 50 (83,3±6,3%) случаев. Бифидобактерии в количестве, соответствующем общепринятой возрастной норме, обнаружены у детей в 66,6-86,7% случаев, приблизительно с равной частотой выявлялись и молочнокислые стрептококки (табл. 1). Лактобактерии, лактопозитивные Е.соИ (Е. соИ Lac +) и энтерококки в количестве, соответствующем возрастной норме, обнаружены у преобладающего большинства обследованных детей. Бактероиды обнаружены в 88% случаев у детей первого года жизни и у всех детей старше одного года.

Средний популяционный уровень бифидобактерий был максимальным у детей грудного возраста (9,4±0,7 lg КОЕ/г) с последующим недостоверным снижением у детей старше одного года (9,0-8,9 1дКОЕ/г) (U-критерий р>0,05). Среднее содержание бактероидов в разных возрастных группах соответствовало общепринятым нормам и нарастало с увеличением возраста детей от 8,5 lg КОЕ/г у детей первого года до 9,6 lg КОЕ/г - у детей старше 2 лет. Среднее содержание лактобактерий и лактозопозитивной Е.соИ в разных возрастных группах достоверно не различалось и соответствовало общепринятым нормативам.

Условно-патогенные микроорганизмы (УПМ) выделены у детей в возрасте 1-5 месяцев - в 72,7%, 6-12 месяцев -в 82,3%, 1-2 лет - в 47,4 % и 2-3 лет - в 20% случаев. Все-

го идентифицированы представители 10 родов УПМ. Во всех возрастных группах по частоте встречаемости доминировали

S.aureus, Klebsiella spp, Proteus spp., гемолизирующие E.coli (E.coli Hly +) (табл. 2.). Реже дети были колонизированы кандидами, в единичных случаях - энтеробактерами, цитробакте-рами и клостридиями. У здоровых детей не обнаружены Hafnia spp., Morganella morganii, Providencia spp., Pseudomonas spp., Acinetobacterspp. и плесеневые грибы.

Таблица 3.

Среднее содержание условно-патогенных микроорганизмов у здоровых детей

Геометрическое среднее содержание G±SD (lgКОЕ/г)

Микроорга- низмы 1-5 мес. (n=66) 5-12 мес. (n=51) 1-2 г. (n=78) 2-3 г. (n=60)

S.aureus 4,6±G.S 4,4±G,7 4,2±G,5 4,G±G,5

E.coli Hly + 6,3±G,9 б,3±1,8 6,G±G,S 5, 4±G,5

Klebsiella spp. 6,5±G,7 6,3±G,S 6,G±G,5 6,G±G,6

Proteus spp. 5,2 ±G,S 5,2 ±G,4 4,G 4,G±G,5

Enterobacter spp. б,2±1,2 5,5±G,7 4,5 -

Candida spp. 4,5±G,6 4,G±G,2 4,4±G,2 4,6±G,4

Citrobacter freundi 6,5±G,7 6,G 6,G 5,G±G,4

Clostridium spp. 4,G 5,G - 5,G

Serratia rubidaea G 5,G 5,G -

S. epidermidis 4,5±G,5 5,G 5,G -

Среднее содержание УПМ у колонизированных детей (особенно у детей первого полугодия жизни) часто превышало возрастные показатели нормы (табл. 3.).

Таблица 2.

Частота выделения условно-патогенных микроорганизмов у здоровых детей г. Казани

Микроорганизмы Число детей (абс.ч.%)

1 гр 2 гр 3 гр 4 гр.

1-5 мес. (n=66) 5-12 мєс.(п=51) 1-2 г.(п=78) 2-3 г.(п=60)

Гр+ бактерии 3G (44,б±б,1%) 25 (49±7,G%) 22 (28,2±б,1%) 8 (13,3±4,4%)

S.aureus 26 (39,4±6,G%) 24 (4Т,1±б,9%) 15 (19,2±4,б%) б (1G±3,9%)

S. epidermidis> 4 lg КОЕ/г 4 (6,1 ±2,9%) 1 (2±1,9%) 1 (1,3±1,2%) G

Clostridium spp.> 3 lg КОЕ/г 2 (З±2,1%) 1 (2,G±1,9%) 2 (2,б±1,8%) 2 (3,3±2,3%)

Гр- энтеробактерии Зб (42,4±б,1%) 36 (TG,6±6,4%)* 24 (3G,S±5,2%) 8 (13,3±4,4%)

E.coli Hly + 1G (15,2±4.4%) 1G (19,б±б,б%) 8 (1G,4±3,5%) 4 (б,б±3,2%)

Klebsiella spp.> 3 lg КОЕ/г.: 16 (24,2±5,2%) 17 (33,3±6,6%) 1G (12,9±3,S%) 4 (6,6±3,2%)

Kl. pneumoniae 14 (21,2±5,G%) 15 (29,4±б,4%) 1G (12,9±3,S%) 4 (б,б±3,2%)

Kl. oxytoca 2 (3,G±2,G%) 2 (3,9±2,7%) - -

Proteus spp.> 3 lg КОЕ/г: 1G (15,2±4,4%) 7 (13,7±4,8%) 4 (5,2±2,5%) 2 (3,3±2,3%)

Proteus mirabilis 8 (12,2±4,G%) 3 (5,9±3,3%) 2 (2,б±1,8%) 2 (3,3±2,3%)

Proteus vulgaris 2 (3,G±2,G%) 4 (7,8±3,8%) 2 (2,б±1,8%) -

Enterobacter.spp.> 4 lg КОЕ/г.: 4 (б,1±2,9 %) 3(5,9±3,3%) 2 (2,б±1,8%) -

Enterobacter agglomerans 2 (3±2,G%) 3 (5,9±3,3%) 2 (2,б±1,8%) -

Enterobacter doacae 2 (3±2,G%) - - -

Citrobacter freundi > 4 lg КОЕ/г 2 (3±2,G%) 2 (3,9±2,7%) 2 (2,б±1,8%) -

Serratia spp.> 3 lg КОЕ/г 1(1,5±1,5%) 2 (3,9±2,7%) - -

Candida spp.> 3 lg КОЕ/г 8 (12,2±4,G%) 2 (3,9±2,7 %) б (б,4±2,8%) 4 (б,б±3,2%)

*Гр- (2 гр) и Гр+ (2 гр.) р=0,05 (F-критерий) * Гр- (1 гр.) и Гр- (2 гр.) р=0,02 (F-критерий)

Для получения референтных значений определено два интервала количественного содержания кишечных микроорганизмов в фекалиях - «нормальный» (2,5% процентиль - 97,5% процентиль) и «межквартильный» (25% процентиль — 75% процентиль). Поскольку «нормальный» интервал включал значения популяционного уровня УПМ, при которых возможно развитие инфекционного процесса (106-107 КОЕ/г), нами использовался межквартильный интервал - с 25% до 75%. Полученные референтные значения содержания представителей КМФ у детей раннего возраста представлены в таблице 4.

Обсуждение результатов

В настоящее время имеются убедительные доказательства важнейшей роли кишечного микробиоценоза в поддержании гомеостаза человеческого организма. Несмотря на то, что микрофлора фекалий не отражает в полной мере всю сложность состава кишечной микрофлоры, она включает большинство видов кишечных бактерий, поэтому бактериологический анализ фекалий адекватен для оценки состава кишечной микрофлоры [9].

Мы установили, что у здоровых детей в возрасте до 2 лет состав КМФ в большинстве случаев не соответствует рекомендуемым нормам. У детей старше 2 лет состав кишечного микробиоценоза в преобладающем большинстве случаев (80%) соответствуют общепринятым нормативным показателям микрофлоры взрослого человека. Отклонения от нормы у здоровых детей в основном проявлялись изолированным умеренным дефицитом облигатных бактерий (преимущественно бифидобактерий) и частым выделением УПМ. На частое выделение условно-патогенных микроорганизмов у здоровых детей грудного возраста также указывают в своих публикациях

других исследователи [3, 4, 5, 10, 11]. Всего идентифицированы представители 10 родов УПМ. По частоте в составе кишечной микрофлоры у здоровых детей первого года жизни доминировали S.aureus (39,4-56,8%) и Klebsiella spp. (32-34,5%), у детей старше 1 года - S.aureus (9-14,3%) и гемолизирующие эшерихии (9-14,3%).

Наиболее высокое содержание УПМ имели дети первого полугодия жизни. У некоторых из них гемолизирующие E.coli, Klebsiella spp., Citrobacter freundii, Enterobacter spp. выделены из фекалий в количестве 7 lg КОЕ/гр фекалий. Отсутствие симптомов кишечной инфекции при столь выраженном обсеменении кишечника грамотрицательными энтеробактериями, с нашей точки зрения, может быть связано с апатогенностью данных штаммов микроорганизмов, а также антиинфекционной активностью грудного молока. С учетом этих данных, оценка роли УПМ в развитии инфекционного процесса только по количественному содержанию микробов в фекалиях недостаточно объективна, поскольку инфекционный потенциал УПМ в значительной степени связан с наличием факторов патогенности и их способностью к синтезу органотропных токсинов [12]. У детей старше одного года мы отмечали снижение не только частоты, но и среднего содержания всех условно-патогенных микроорганизмов. Таким образом, условно-патогенные бактерии являются частыми членами кишечного микробиоценоза у здоровых детей первых двух лет жизни.

Понятие нормы в медицине всегда было предметом дискуссии. В настоящее время определение границ референтных интервалов лабораторных показателей основано на статистических подходах. По данным Р. И. Флетчер и соавт. (1998), большинство количественных биологических признаков имеют отклонения от нормального распределения и в этих случаях

Таблица 4.

Качественный и количественный состав микрофлоры толстой кишки у здоровых детей раннего возраста г. Казани (КОЕ/гр фекалий)

используется процентильное определение нормы, отражающее интервал значений между произвольно установленными нижними или верхними процентилями общего диапазона. Точка разделения, на которой заканчивается норма и начинается патология, выбирается произвольно и обычно связана с одним из трех критериев патологии: это состояние (значение лабораторного показателя) необычное с точки зрения статистики, оно проявляется в виде болезни и поддается лечению. В соответствии с данными подходами к определению референтных величин мы определили два интервала популяционного уровня индигенных и условно-патогенных кишечных микроорганизмов у детей первого и второго года жизни — «нормальный» и «межквартильный». Поскольку «нормальный» интервал (95% объема выборки) включал значения популяционного уровня УПМ, при которых возможно развитие инфекционного процесса, для определения референтных значений нами был выбран «межквартильный» интервал - с 25% по 75% процентиль. Полученные результаты свидетельствуют о том, что у здоровых детей первого года допустимо более низкое по сравнению с общепринятыми нормами содержание бифидобактерий; более высокое содержание некоторых видов грамотрицательных

условно-патогенных энтеробактерий (Klebsiella spp., Proteus spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp.), гемолизирующих E.coli, S.aureus и грибов рода Candida. У детей в возрасте от одного года до 2 лет допустим более низкий популяционный уровень бифидобактерий - 108 КОЕ/гр фекалий, незначительное содержание S.aureus и гемолизирующих E.coli (<104 КОЕ/гр). Удержание клостридии у детей первых двух лет не должно превышать 103. Для кишечного микробиоценоза здоровых детей не характерно присутствие Hafnia, Morganella, Providencia, неферментирующих бактерий (Pseudomonas, Acinetobacter и др.) и плесневых грибов. У детей старше 2 лет показатели состава кишечной микрофлоры соответствуют общепринятым нормативным показателям взрослых людей.

Таким образом, с нашей точки зрения, понятие нормы включает более широкий диапазон популяционного уровня отдельных представителей кишечного микробиоценоза. В связи с разнообразием состава кишечной микрофлоры, высокой частотой выделения условно-патогенных микроорганизмов у детей первых двух лет жизни дисбактериоз кишечника в данной возрастной группе следует диагностировать и корригировать только в случаях наличия симптомов дисфункции желудочно-кишечного тракта, а также заболеваний, которые могут быть ассоциированы с нарушением состава кишечной микрофлоры.

ЛИТЕРАТУРА

1. Копанев Ю.А., Соколов А.Л. Дисбактериоз кишечника: микробиологические, иммунологические и клинические аспекты микроэ-кологических нарушений у детей. — М., 2002. — 121 с.

2. Neu J. Perinatal and neonatal manipulation of the intestinal mi-crobiome: a note of caution // Nutr. Rev. — 2007. — Vol. 65, № 6. — Р 282-285.

3. Леванова Л.А. Алешкин В.А., Воробьев A.A. и др. Становление микрофлоры кишечника у детей первого года жизни // Журнал микробиологии. — 2001. — № 4. — С. 47-50.

4. Урсова Н.И. Особенности формирования микробиоценоза у грудных детей и дисбактериоз кишечника // Педиатрия. Приложение к журналу Consilium medicum. — 2005. — Т. 7, № 2. — С. 56-59.

5. Самсыгина Г.А. Особенности становления биоценоза кишечника и кишечный дисбактериоз // Педиатрия. Приложение к журналу Consilium Medicum. — 2003. — № 2. — С. 30-33.

6. Коршунов В.М. и др. Микрофлора кишечника у детей Монголии, России, Швеции // Журнал микробиологии. — 2001. — № 2. — С. 61-64.

7. Маянский А.Н. Дисбактериоз: иллюзии и реальность // Педиатрия. — 2000. — № 4. — С. 80-88.

8. Меньшиков В.В., Пименова Л.М. Методические разработки по разработке референтных величин лабораторных показателей: методические рекомендации // М.: Минздрав СССР, 1983. — 39 с.

9. Turnbaugh P.J., Hamady M., Yatsunenko T. A core gut microbiome in obese and lean twins // Nature. — 2009. — Vol. 457, № 7228. — P. 480-484.

10. Аветисян Л.Р Эпидемиологические и микробиологические аспекты колонизации кишечника детей первого года жизни условнопатогенными микроорганизмами: дис. ... канд. мед. наук. — М., 2008. — 143 с.

11. Нилова Л.Ю. Характеристика условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза толстого кишечника: автореф. дис. ... канд. мед. наук. — СПб., 2009. — 22 с.

12. Бондаренко В.М. Роль условно-патогенных бактерий кишечника в полиорганной патологии человека. — Тверь: Триада, 2007. — 64 с.

13. Флетчер Р, Флетчер C., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология: основы доказательной медицины. — М.: МедиаСфера, 1998. — 350 с.

Микроорганизмы Интервалы значений популяционного уровня микроорганизмов (КОЕ/г)

< 1 год 1-2 года > 2 лет

Бифидобактерии 1G9-1G11 1Gs-1G1G 1Gs-1G1G

Лактобактерии 1G7 1G7 1G6-1G7

Бактероиды 1G7-1GS 1G9-1G1G 1G9-1G1G

М/к стрептококк 1G6-1G7 1G7 1G7

Энтерококк 1G6-1G7 1G7 1G7-1GS

E. саН типичные 1G7-1GS 1G7-1GS 1G7-1GS

E. ссН лактозонегативные <1G6 <1G6 < 1G 5

E. ссН гемолизирующие <1G5 <1G5 <1G5

Другие условнопатогенные энтеробактерии* <1G5 <1G4 <1G4

Неферментирующие бактерии** <1G4 <1G4 <1G4

S.aureus <1G4 <1G4 <1G3

S.epidermidis <1G5 <1G5 <1G5

Клостридии <1G4 <1G4 1G5

Дрожжеподобные грибы рода Candida <1G4 <1G4 <1G4

* - представители родов Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Citrobacter, Enterobacter

** - Pseudomonas, Acinetobacter и др.