CC BY
94
Том 152, кн. 1
Естественные науки
2010
УДК 573.663
РЕФЕРЕНС-ПЛАЗМИДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОПИЙНОСТИ ПЛАЗМИД, СОДЕРЖАЩИХ BLA-ГЕН
Е.В. Крякунова, Р. Г. Хамидуллина, Б.И. Барабанщиков, О.А. Гимадутдинов
Аннотация
В настоящей работе было проведено клонирование гена ß-лактамазы в плазмиду pETcocoCm, обладающую способностью изменять свою копийность в зависимости от состава питательной среды. Был определен уровень устойчивости к ампициллину в рекомбинантном штамме E. coli DH5a pETcocoCmAmp в зависимости от углеводного субстрата. Выявлена корреляция между уровнем устойчивости к ампициллину, количеством ß-лактамазы и копийностью плазмиды pETcocoCmAmp в рекомбинантном штамме E. coli DH5a в зависимости от углеводного субстрата.
Ключевые слова: контроль экспрессии, плазмида, копийность плазмиды, ß-лакта-маза, регуляция репликации.
Введение
В последнее время одним из направлений генной инженерии является создание векторов для экспрессии генов, кодирующих биополимеры, которые могут быть токсичными для клеток-хозяев. Такие векторы должны обладать способностью как регулировать экспрессию клонированных генов, так и изменять свою копийность в зависимости от состава питательной среды [1].
В настоящий момент широко используются плазмидные векторы, копий-ность которых регулируется за счет присутствия или отсутствия углеводных субстратов, в частности глюкозы и арабинозы. pETcocoCm - векторная система с уникальной регуляцией копийности плазмиды от одной до 40 копий на клетку в зависимости от содержания в среде углеводного субстрата [2].
Так, при наличии в питательной среде глюкозы в клетке содержится 1 копия плазмиды, репликация которой инициируется с участка oriS и контролируется конститутивными генами repE, parA, parB, parC и araC. Продукт гена araC, белок-репрессор AraC, блокирует репликацию плазмиды с участка oriV.
Увеличение числа копий плазмиды осуществляется с помощью индуктора -арабинозы, которая инактивирует белок-репрессор AraC, что, в свою очередь, ведет к снятию блока репликации с участка oriV и экспрессии гена-репликатора trfA. Основные преимущества двойного контроля экспрессии генов плазмиды заключаются в том, что в неиндуцированном состоянии экспрессия генов очень низка, именно это позволяет сохранять гены, кодирующие токсичные продукты в клетках хозяина. Одна из причин эффективной работы данного контроля связана
с копийностью плазмид, поскольку количество синтезируемого клеткой продукта часто зависит от дозы его гена [3].
Если бы плазмида pETcocoCm содержала ген Р-лактамазы (bla), для которого существует прямая корреляция между дозой гена и количеством синтезируемого фермента [4], то такая плазмида могла бы использоваться в качестве референс-плазмиды для косвенного определения копийности других плазмид.
Целью настоящей работы явилось создание вектора, который можно было бы использовать в качестве референс-плазмиды для косвенного определения копийности плазмид, содержащих bla-ген.
1. Материалы и методы
1.1. Объекты исследования. Были использованы штаммы Escherichia coli DH5a и LK111X и плазмиды: pBluescriptSK (рис. 1, а), pETcocoCm (рис. 1, б).
a) б)
Рис. 1. Конструкция плазмид: а) pBluescriptSK, б) pETcocoCm
1.2. Питательные среды: LB-бульон (Luria-Bertani) и LB-агар [5]. Для создания селективных условий при культивировании рекомбинантных штаммов в LB-среду вносили ампициллин в концентрации 50 мкг/мл.
1.3. Получение компетентных клеток. Компетентные клетки бесплазмид-ного штамма E. coli DH5a получали по методике Чанга и др. [6].
1.4. Трансформация клеток heat shock методом. Для трансформации использовали компетентные клетки E. coli бесплазмидного штамма DH5a и плазмида pETcocoAmpCm [7].
1.5. Выделение плазмидной ДНК. В LB-бульон, содержащий ампициллин (50 мкг/мл) и глюкозу в следующей концентрации: 0.2% (проба 1); 0.5% (проба 2); 0.2% (проба 3), вносили культуру клеток Escherichia coli DH5a с плазми-дой pETcocoAmp и инкубировали при 37 °С в течение ночи. Оптическую плотность всех образцов доводили до А590 = 0.05, затем в пробы добавляли глюкозу в следующей концентрации: 0.2% (проба 1); 0.5% (проба 2) и не добавляли (проба 3).
Инкубировали при 37 °С на качалке до А590 = 0.3-0.4, после чего в пробу 3 вносили 0.01%-ную арабинозу и все три пробы инкубировали еще 4 ч на качалке при 37 °С. Оптическую плотность всех образцов доводили до одинакового значения (А590 = 1). Выделение плазмидной ДНК проводили по стандартной методике [5].
1.6. Электрофорез в агарозном геле. Для проведения электрофореза использовалась 1%-ная агароза в трис-боратном буфере, рН 8.0 [8].
1.7. Определение уровня резистентности к антибиотику. В чашки Петри заливали LB-агар с градиентом антибиотика ампициллина [9]. Кроме того, для контроля над копийностью вектора pETcocoCmAmp добавляли 0.01%-ную L-арабинозу или 0.2%-ную и 0.5%-ную D-глюкозу. Засевали на следующий день петлей с культурой клеток по направлению к максимальной концентрации антибиотика. Инкубировали в течение ночи при 28 °С.
0.1 мл культуры в стационарной фазе роста, разведенной в физиологическом растворе (4-103 - 6-103 бактериальных клеток), высевали на LB-агар, содержащий различные концентрации ампициллина (±50 мкг/мл от точки прекращения роста на чашках). За уровень резистентности принимали минимальную концентрацию антибиотика, при которой не происходило видимого роста через 1820 ч инкубирования при 28 °С.
1.8. Определение активности Р-лактамазы. Культуру клеток выращивали в LB-бульоне в течение 18 ч при 37 °С. В качестве контроля были взяты клетки бесплазмидного штамма DH5a. Клетки осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 2 мин. Осадок ресуспендировали в 5 мл буфера TES следующего состава: 0.1 М NaCl; 10 мМ трис-HCl; 1 мМ ЭДТА; рН 7.8 и доводили оптическую плотность образцов на ФЭК до величины А530 = 0.18. Отбирали 5 мл и разрушали клетки с помощью лизоцима в концентрации 0.2 г/мл при 37 °С в течение 1 ч. Затем к полученной вязкой субстанции добавляли ДНКазу в концентрации 0.1 мкг/мл и выдерживали 30 мин при 37 °С до исчезновения вязкости.
Йодометричесоке титрование проводилось по методике, предложенной Перрет [10].
Р-лактамазную активность рассчитывали по формуле:
_ (V - V2) • к • T • 10• d
F • 60 • 2-1 (1)
где х - условные единицы активности ВНИИА; V1 - количество мл 0.01 н. раствора гипосульфита натрия, использованного для титрования в контрольном опыте; V2 - количество мл 0.01 н. раствора гипосульфита натрия, использованного для титрования исследуемого раствора; к - поправка 0.01 н. раствора гипосульфита натрия (1); Т - теоретическая активность натриевой (1667 ед./мл) или калиевой (1600 ед./мл) солей бензилпенициллина; F - количество мл 0.01 н. раствора йода, поглощаемого 1 мг бензилпенициллина (для натриевой соли -2.26, для калиевой соли - 2.15); 2 (мл) - объем испытуемого раствора; d - сте-
пень разведения основного раствора, содержащего в-лактамазу; 1 (мл) - объем раствора, взятого для определения активности; 60 (ед.) - количество пенициллина, инактивируемого 1 ед. пенициллиназы за 60 мин при 37 °С.
2. Результаты и их обсуждение
Как уже было сказано выше, двойной контроль экспрессии генов вектора pETcocoCm основан на двух альтернативных точках начала репликации oriS и oriV [3]. Этот вектор также характеризуется наличием в его составе очень сильного Р1ас-промотора, контроль которого осуществляется с помощью араби-нозы [2]. Кроме того, в состав этой плазмиды входят ген репликатора герЕ и гены рагЛБ, действующие в оп^. В плазмиде также находятся ген рагС (обеспечивает низкокопийность) и ген репликатора ПЛ, белки которого прикрепляются к повторяющимся последовательностям в 17 п.о. с 5'-конца точки оп^. Такое прикрепление ведет к образованию открытого комплекса, который стабилизируется белками ОпаЛ или Ни. ОriS является конститутивной точкой начала репликации, действующей в отсутствие условий для индукции репликации. В отличие от нее, точка оп^ представляет собой факультативную точку начала репликации, которую можно контролировать с помощью находящихся в среде углеводных субстратов [11].
При наличии в питательной среде глюкозы белок ЯерЕ активирует точку oriS, запуская процесс репликации, который продолжается до тех пор, пока глюкоза не закончится. При низком содержании глюкозы в среде (от 0.2% до 0.5%) белок ЯерЕ связывается с локусом сорЛАпсС, что приводит к слиянию oriS с локусом сорЛАпсС, при этом происходит ингибирование процесса репликации. Так как глюкоза легко усваивается клеткой, то при ее содержании в среде клетке не требуется увеличения активности продуктов плазмидных генов и, следовательно, увеличения числа плазмидных копий [12].
Регуляция копийности плазмиды рЕТсосоСт при наличии в питательной среде арабинозы происходит по типу ЛпаС+рБЛО. Пока в среде содержится лишь глюкоза, Р1ас-промотор, который объединен с сайтом связывания регулятора ЛпаС, находится в неактивном состоянии. В таких условиях один мономер ЛпаС присоединяется к сайту апа11, другой - к половине сайта апа02 (рис. 2, а). Поскольку эти два сайта располагаются на расстоянии 194 п.о. друг от друга, то при присоединении ЛпаС между ними формируется петля. Кроме того, не происходит связывания мономера ЛпаС с половиной сайта апа12 - посредника активации экспрессии апаБЛО-оперона [2], таким образом система экспрессии не запускается.
При появлении в среде арабинозы и в отсутствие глюкозы происходит индукция Р1ас-промотора и, соответственно, переход от низкокопийности к высо-кокопийности, поскольку арабиноза стимулирует активирующий оп^ ген №/Л. При этом копийность вектора увеличивается до 40-50 копий на клетку [11]. Тогда же белок-активатор ЛпаС связывается с арабинозой и приобретает такую конформацию, которая позволяет ему частично связаться с ДНК в области сайтов апа11 и апа12 (рис. 2, б). Уровень экспрессии генов апаБЛО-оперона в присутствии в среде арабинозы является довольно высоким (в 10000 раз выше нормы) [2], что служит основой для создания различных векторов.
пА
Рис. 2. Регуляция экспрессии генов агаБАБ-оперона посредством изменения углеводного состава среды: а) в присутствии глюкозы и в отсутствие арабинозы; б) в отсутствие глюкозы и в присутствии арабинозы
Рис. 3. Схема получения плазмиды pETcocoAmpCm
2.1. Клонирование bla-гена. Для получения референс-плазмиды pETcocoCmAmp мы провели клонирование с помощью ПЦР bla-тена из плазмиды pBluescriptSK в плазмиду pETcocoCm по сайту Bstz 171 с помощью прай-меров (на 5'-gta gta tac gcg cgg aac ccc tat ttg и на 3'-gta gta tac gta aac ttg gtc tga cag), имеющих на концах сайты рестрикции BstZ171 (рис. 3).
Рис. 4. ПЦР-продукты скрининга трансформированных клеток, несущих плазмиду pETcocoCmAmp с геном bla (6% ПААГ в ТПЕ-буфере). Маркер нуклеиновых кислот фирмы Fermentas pUC8 Mix
Полученные с помощью ПЦР фрагменты bla-гена очищались с помощью набора Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System. Плазмида pETcocoCm разрезалась по сайту рестрикции Bstz 171, в результате чего она приобретала линейную структуру. После этого очищенные фрагменты bla-гена лигирова-лись с находящейся в линейном состоянии плазмидой pETcocoCm по сайтам Bstz 171. В результате был получен вектор pETcocoAmpCm.
Полученную плазмиду pETcocoAmpCm трансформировали в клетки E. coli штамма LK111X и высевали на селективную среду, содержащую ампициллин. Далее проводился скрининг на наличие bla-гена с помощью ПЦР-реакции клонов, обладающих устойчивостью к ампициллину (рис. 4). Из отобранных резистентных к ампициллину клонов выделяли плазмиду pETcocoAmpCm и трансформировали ее в клетки E. coli штамма DH5a и высевали на селективную среду, содержащую ампициллин в концентрации 50 мкг/мл и 0.2%-ную глюкозу.
2.2. Определение уровня устойчивости к ампициллину в рекомбинант-ном штамме E. coli DH5a pETcocoCmAmp в зависимости от углеводного субстрата. Известно, что существует прямая корреляция между дозой (количеством копий) bla-гена, обуславливающего устойчивость к ампициллину, и его экспрессией, то есть обнаружена линейная зависимость между устойчивостью к ампициллину и синтезом фермента и между синтезом фермента и копийностью bla-гена [4]. Показано также, что увеличение числа копий плазмид сопровождается повышением уровня резистентности к ампициллину [14]. Таким образом, изменение уровня устойчивости к антибиотику и активности ß-лактамазы может служить косвенным доказательством изменения количества ее генов. Для подтверждения вышесказанного определяли уровень устойчивости к ампициллину в зависимости от углеводного субстрата в полученном нами реком-бинантном штамме E. coli DH5a pETcocoCmAmp. Так, при выращивании ре-комбинантного штамма на среде с 0.2%-ной глюкозой, уровень устойчивости составил 50 мкг/мл, при выращивании на среде с 0.5%-ной глюкозой уровень устойчивости был равен приблизительно 100 мкг/мл. При выращивании клеток E. coli DH5a pETcocoCmAmp на среде с арабинозой в концентрации 0.01% уровень устойчивости к ампициллину рекомбинантного штамма увеличивался до 3500 мкг/мл, что косвенно указывает на увеличение количества копий bla-гена.
Табл. 1
Зависимость между устойчивостью клеток к ампициллину, активностью ß-лактамазы и копийностью плазмиды pETcocoAmp в рекомбинантном штамме E. coli DH5a
Углеводный субстрат Уровень резистентности к ампициллину, мкг/мл Количество ß-лактамазы (в усл. ед. ВНИИА, 2-105 кл) Количество копий bla-гена (плазмиды)
0.2%-ная D-глюкоза 50 7 ± 0.5 ~1
0.5%-ная D-глюкоза 100 15 ± 1.2 ~2
0.01%-ная L-арабиноза 3500 260 ± 7.4 ~37
2.3. Определение количества фермента ß-лактамазы и копийности плазмиды pETcocoAmp в рекомбинантном штамме E. coli DH5a в зависимости от углеводного субстрата. В ряде работ было показано, что активность ß-лак-тамазы зависит от дозы гена bla, поэтому увеличение активности фермента зависит от увеличения копийности плазмиды [4]. Из вышесказанного следует: в присутствии L-арабинозы вырабатывается большее число копий плазмиды (до 35), что увеличивает дозу гена bla с соответствующим повышением активности ß-лак-тамазы и уровня устойчивости к ампициллину. Определение количества фермента ß-лактамазы проводилось методом йодометрического титрования, основанном на способности продуктов гидролиза ß-лактамных антибиотиков восстанавливать йод до йодида, вызывая обесцвечивание йодокрахмального комплекса [15].
Из данных, представленных в табл. 1, видно, что клетки E. coli, несущие плазмиду pETcocoCmAmp, при 0.2%-ной D-глюкозе растут на среде с ампициллином в концентрации не более 50 мкг/мл и обладают наименьшей активностью ß-лактамазы (7 ед.). По сравнению с ними клетки E. coli, выращенные на 0.5%-ной D-глюкозе, более устойчивы к ампициллину (примерно в 2 раза), и, соответственно, активность ß-лактамазы у них выше примерно в 2 раза. При выращивании клеток E. coli с добавлением 0.01%-ной L-арабинозы уровень резистентности к ампициллину достигает 3500 мкг/мл, и, соответственно, количество ß-лактамазы у них также увеличивается примерно в 37 раз и составляет 260 ед. Такое изменение количества ß-лактамазы в зависимости от субстрата, по-видимому, можно объяснить изменением количества копий bla-гена.
Для подтверждения увеличения копийности плазмиды в зависимости от углеводного субстрата было проведено выделение вектора pETcocoCmAmp из одинакового количества клеток рекомбинантного штамма E. coli DH5apETcocoAmp.
Как видно из табл. 2, клетки E. coli, несущие сконструированную нами плазмиду pETcocoCmAmp, при выращивании на питательной среде с 0.2%-ной D-глюкозой содержали плазмидную ДНК в концентрации 10 нг/мкл. При выращивании с 0.5%-ной D-глюкозой количество выделенной ДНК составило 20 нг/мкл, а с 0.01%-ной L-арабинозой концентрация плазмидной ДНК увеличилась до 370 нг/мкл. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что увеличение количества плазмидной ДНК связано с увеличением ее копийности, что подтверждается и электрофоретическим анализом плазмидной ДНК pETcocoCmAmp (рис. 5).
Табл. 2
Концентрация плазмидной ДНК pETcocoCmAmp, выделенной из рекомбинантного штамма E. coli DH5a в зависимости от углеводного субстрата
Субстрат, % 0.2%-ная D-глюкоза, нг/мкл 0.5%-ная D-глюкоза, нг/мкл 0.01%-ная L-арабиноза, нг/мкл
Концентрация плазмидной ДНК, нг/мкл 10 20 370
1 2 3 4
Рис. 5. Электрофоррограмма плазмидной ДНК pETcocoAmp: 1 - маркер нуклеиновых кислот фирмы Fermentas 1 kb DNA Ladder; 2 - плазмидная ДНК рекомбинантного штамма E. coli DH5a pETcocoCmAmp, выросшего на среде с 0.2%-ной глюкозой; 3 -плазмидная ДНК рекомбинантного штамма E. coli DH5a pETcocoCmAmp, выросшего на среде с 0.5%-ной глюкозой; 4 - плазмидная ДНК рекомбинантного штамма E. coli DH5a pETcocoCmAmp, выросшего на среде с 0.01%-ной арабинозой
На основании полученных результатов можно заключить, что сконструированный нами вектор можно использовать в качестве референс-плазмиды для определения числа копий любых плазмид, содержащих ген bla.
Summary
E.V. Kryakunova, R.G. Khamidullina, B.I. Barabanshchikov, O.A. Gimadutdinow. Refe-rence-plasmid for Determination of Copy Number of Plasmids Containing bla-gene.
The article presents the results of the cloning of P-lactamase gene in pETcocoCm plas-mid possessing the ability to change its copy number depending on the nutrient medium composition. The level of resistance to ampicillin has been defined depending on a carbohydrate substratum in recombinant E. coli DH5a pETcocoCmAmp strain. Correlation has also been revealed between the level of ampicillin resistance, amount of P-lactamase and pETcocoCmAmp plasmid copy number depending on a carbohydrate substratum in recombinant E. coli DH5a strain.
Key words: expression control, plasmid, plasmid copy number, p-lactamase, regulation of replication.
Литература
1. Lee S.G., Liao J.C. Control of Acetate Production Rate in Escherichia coli by Regulating Expression of Single-Copy pta Using lacIQ in Multicopy Plasmid // J. Microbiol. Bio-technol. - 2008. - V. 18, No 2. - P. 334-337.
2. Friehs K. Plasmid Copy Number and Plasmid Stability // Adv. Biochem. Eng. Biotech-nol. - 2004. - V. 86. - P. 47-82.
3. Novy R., Yaeger K., Held D., Mierendorf R. Coexpression of multiple target proteins in E. coli // inNovations. - 2002. - V. 15. - P. 2-6.
4. Uhlin B., Nordström K. R-plasmid gene dosage effects in Escherichia coli K-12, copy mutants of the R-plasmid RI drd-19 // Plasmid. - 1977. - V. 1. - P. 1-7.
5. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. - N. Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. - 555 p.
6. Chung C.T., Niemala S.L., Miller R.H. One step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution // Proc. Natl. Acad. Scie. USA. - 1989. - V. 86. - P. 2172-2175.
7. Van Die I.M., Bergmans H.E.N., Hoekstra W.P.M. Transformation in Escherichia coli: studies on the role of the heat shock in induction of competence // J. Gen. Microbiol. -1983. - V. 129. - Р. 663-670.
8. Westermeier R. Elektrophorese Praktikum. - VCH, Weinheim, 1990. - 98 S.
9. Barth P.T., Richards H., Datta N. Copy number of coexisting plasmids in Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. - 1978. - V. 135. - P. 760-765.
10. Perret C.J. Iodometric assay of penicillinase // Nature (London). - 1954. - V. 174. -Р. 1012-1013.
11. Sektas M., Szybalski W. Novel single-copy pETcoco™ vector with dual controls for amplification and expression // inNovations. - 2002. - V. 14. - P. 6-8.
12. Nordström K., Dasgupta S. Copy-number control of the Escherichia coli chromosome: a plasmidologist's view // EMBO reports. - 2006. - V. 7. - P. 484-489.
13. Friehs K. Plasmid Copy Number and Plasmid Stability // Adv. Biochem. Eng. Biotech-nol. - 2004. - V. 86. - P. 47-82.
14. Ely S., Staudenbaner W.L. Regulation of plasmid DNA synthesis: isolation and characterization of copy number mutant of mini RG-5 and mini F plasmids // Mol. Gen. Genet. -1981. - V. 181. - P. 29-35.
15. Livermore D.M. Mechanisms of resistance to ß-lactam antibiotics // Scand. J. Infect. Dis. -1991. - V. 78. - Р. 7-16.
Поступила в редакцию 22.12.09
Крякунова Елена Вячеславовна - аспирант кафедры генетики Казанского государственного университета.
Хамидуллина Раиса Гусмановна - кандидат биологических наук, доцент кафедры генетики Казанского государственного университета.
Барабанщиков Борис Иванович - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой генетики Казанского государственного университета
Гимадутдинов Олег Александрович - кандидат биологических наук, доцент кафедры генетики Казанского государственного университета.
E-mail: Oleg.Gimadutdinov@ksu.ru
