CC BY
54
УДК 581.133.1.557
РЕАЛІЗАЦІЯ АЗОТФІКСУВАЛЬНОГО ПОТЕНЦІАЛУ TN5-МУТАНТІВ Bradyrhizobium japonicum У СИМБІОЗІ З РОСЛИНАМИ СОЇ
Н.А. Воробей
С. Я. Коць Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ
П. М. Маменко
Е-mail: [email protected]
Отримано 29.01.2013
У результаті проведених досліджень серед Тп5-мутантів Bradyrhizobium japonicum селекціоновано бульбочкові бактерії, які відрізнялися за інтенсивністю та динамікою нітрогеназної активності в симбіозі з рослинами сої. Інсерційну природу мутацій, що призводили до появи КmR-форм B. japo-nicum зі зміненими симбіотичними властивостями, доведено з використанням полімеразної ланцюгової реакції. В умовах вегетаційних та дрібноділянкових дослідів Тп5-мутанти B. aponicum проаналізовано за симбіотичними показниками у різні фази онтогенезу сої сортів Аннушка, Васильківська, Мар’яна та Колбі, які належать до трьох груп сортової стиглості. Встановлено, що динаміка та інтенсивність асиміляції N2 кореневими бульбочками сої залежала від генотипу мікросимбіонта, сорту та фази розвитку рослини-хазяїна. Тп5-мутанти B. japonicum, одержані із застосуванням плазміди pSUP5011::Tn5mob, були ефективнішими у симбіозі з ранньостиглими сортами сої Аннушка та Васильківська, а з використанням pSUP2021::Tn5 — із сортами сої Мар’яна та Колбі, вегетаційний період яких є більш тривалим. За результатами досліджень також відібрано Тп5-мутанти B. japonicum Т66, Т21-2, В-18 і В-20 із розширеним спектром комплементарності, які забезпечували інтенсивнішу азотфіксацію сої різних сортів у фазах бутонізації та бутонізації-початку цвітіння, що зумовлювало збільшення урожаю зерна порівняно із застосуванням штамів 646 та 634б. Розглядається стратегія створення полікомпонентних інокулянтів для сортів сої, що належать до різних груп стиглості на основі штамів ризобій із різною інтенсивністю та динамікою азотфіксувальної активності.
Ключові слова: Glycine max, бобово-ризобіальний симбіоз, Bradyrhizobium japonicum, Тп5-мутанти.
Азотфіксувальний потенціал бобово-ризобіальних систем генетично детермінований і визначається комплементарністю генотипів фіто- і ризобіосимбіонтів [1-3]. У його основі лежить здатність бульбочкових бактерій відновлювати атмосферний азот до амонію і забезпечувати ним рослину-хазяїна, що є істотним джерелом її азотного живлення. Не є винятком у цьому відношенні й симбіоз Glycine max — Bradyrhizobium japonicum. Незважаючи на те, що сою порівняно недавно інтродуковано в Україні [4], її широко впроваджують у сільськогосподарське виробництво в різних ґрунтово-кліматичних зонах. У більшості ґрунтів зазвичай відсутні специфічні для сої бульбочкові бактерії, проте в місцях систематичного вирощування цієї культури формуються інтроду-ковані осередки ґрунтових популяцій відповідних ризобій [5]. Для утворення азот-фіксувального симбіозу сої із бульбочкови-
ми бактеріями насіння перед посівом обробляють препаратами високоефективних штамів B. japonicum, що сприяє підвищенню врожаю рослин, вмісту протеїну в зерні, знижує собівартість продукції [6, 7]. Якість бактеріальних препаратів постійно удосконалюється модернізацією технології виробництва і заміною виробничих штамів ризо-бій на більш конкурентоздатні та ефективні у симбіозі з культивованими сортами сої [8, 9]. На цей час дослідницькі центри мають великі колекції бульбочкових бактерій сої, які постійно поповнюються [10]. Нові штами B. japonicum, одержані методом традиційної селекції, нерідко не забезпечують суттєвих переваг над існуючими виробничими [11], проте мають високий адаптивний потенціал, набутий внаслідок тривалого сапрофітного існування в ґрунтах. Їх доцільно використовувати як штами-реципієнти під час гібридизації та інсерційного мутаге-
незу з метою розширення генетичного фонду та відбору бульбочкових бактерій з поліпшеними господарсько-цінними властивостями [12-20].
Варіювання інтенсивності азотфіксації бобово-ризобіальних систем зумовлено переважно сортовими особливостями рослини-хазяїна, що призводить до відповідних коливань урожайності сої. Водночас різні штами ризобій одного виду у разі випробування на одному сорті рослини-хазяїна можуть суттєво відрізнятися за азотфіксувальною активністю [3, 21]. Тому в основу заходів із оптимі-зації симбіотичної азотфіксації має бути покладено координовану селекцію обох партнерів симбіозу: бактерій із високою азотфік-сувальною активністю та бобових рослин, які раціонально витрачають продукти фотосинтезу на енергоємну реакцію відновлення молекулярного азоту до іону амонію та ефективно його асимілюють [22]. Це, по суті, біо-технологічна проблема, оскільки така селекція передбачає модифікацію генетичного апарату як бактерій, так і рослин методами молекулярної генетики та генної інженерії.
Метою роботи було вивчення симбіотичної азотфіксації сої та Tnб-мутантів Bradyrhizobium japonicum із використанням різних сортів рослини-хазяїна та можливості її інтенсифікації добором комплементарних генотипів макро- і мікросимбіонта.
Матеріали і методи
Досліди проводили із соєю Glycine max (L.) Merr. сортів, які належать до різних груп стиглості: ультрашвидкостиглий (вегетаційний період 75-80 днів) — сорт Аннушка — національний стандарт швидкостиглої групи сортів сої; середньоранній (вегетаційний період 101-119 днів) — сорт Васильківська; середньостиглі (вегетаційний період 130-135 днів) — сорти Мар’яна та Колбі. Сорти Аннушка — селекції ЧП НССФ «Соєвий вік», Мар’яна та Васильківська — спільної селекції Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, Селекційно-генетичного інституту НАА та Інституту землеробства НАА України, Колбі — канадської селекції Хайленд Сидс Томпсон ЛТД.
Насіння сої інокулювали бульбочковими бактеріями B. japonicum із колекції азотфік-сувальних мікроорганізмів Інституту фізіології рослин і генетики НАН України — високоефективними штамами 634б, 646 та Tnб-мутантами, які одержано внаслідок транспозонового мутагенезу штаму 646
B. japonicum, з використанням плазмід-век-
торів, що здатні переносити транспозон Tn5 до ризобіальної клітини: pSUP2021::Tn5 — Т66, Т3-11, Т21-2, Т9-2 і Т17-2 та
pSUP5011::Tn5mob — В-2, В-16, В-18, В-20, В-21 [12-14]. Мутанти відібрано за здатністю до репродукції на середовищі TY [23], збагаченому антибіотиками сульфатом канаміцину (Km) і сульфатом стрептоміцину (Str), кінцевою концентрацією відповідно 200 і 500 мкг/мл. Бульбочкові бактерії вирощували на манітно-дріжджовому агарі (МДА) [24] при 28 °С протягом 7-8 діб, кишкову паличку E. coli S17-1 — на середовищі LB [23] за 37 °С 1 добу.
ПЛР-аналіз проводили на ампліфікаторі Proteus (Великобританія), як описано раніше [25]. Праймери для ПЛР сконструювали за допомогою програми Primer-3 на структурну послідовність ділянки гена неоміцин-фосфотрансферази Tn5 завдовжки 517 нук-леотидних пар [21, 25, 26]. Продукти ПЛР аналізували за допомогою електрофорезу в
0,7%-му агарозному гелі [21, 26].
Для проведення вегетаційних дослідів використовували пластикові посудини на
10 кг, простерилізовані 20%-м розчином Н202. Рослини вирощували на річковому піску за 60%-ї вологості субстрату від повної вологоємності. Джерелом мінерального живлення була суміш Гельрігеля [27] з 0,25 н азоту (1 норма відповідає 708 мг Са(N03)2•4Н20 на 1 кг піску) та мікроелементами В, Мо і Fe. Насіння сої протягом 15 хв стерилізували 70%-м етанолом, промивали проточною водою та інокулювали 1 год суспензіями бульбочкових бактерій. У посудині вирощували по 8 рослин. Повторюваність варіантів у вегетаційних дослідах — 7-разова.
Дрібноділянкові польові досліди проводили на ділянці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (ґрунт сірий, супіщаний, рН 5,9-6,0, вміст гумусу 1,2-1,5%, азоту 10,4-12,6, фосфору 8,8-10,1, калію 9,4-10,2 мг / 100 г ґрунту) (рис. 1 Б, В). У рядки завдовжки 1 м висівали по 50 насінин сої, бактеризованих різними ^5-мутан-тами B. japonicum. Повторюваність варіантів у дослідах — 4-разова, розміщення — рендомізоване (рис. 1, Б, В).
Контролями слугували варіанти досліду з інокуляцією насіння сої штамами 646 (вихідний) і 634б (виробничий) B. japonicum (рис. 1, А, Б, В).
Для приготування інокуляційних суспензій біомасу бактерій змивали з поверхні агаризованого середовища водою, суспендували. Титр суспензій дорівнював 109 клі-тин/мл.
r-
Рис. 1. Рослини сої, вирощені:
в умовах вегетаційного (А) та дрібноділянкового польового (Б, В) дослідів
Азотфіксувальну активність (АфА кореневих бульбочок) визначали методом Hardy et al. [28]. Газову суміш аналізували на газовому хроматографі Agilent Technologies 6855 Network GC System USA (визначення проводили у п’ятикратній повторюваності). Статистичну обробку експериментальних даних виконували за Доспєховим [29] та з використанням програми Microsoft Excel 2010. У таблицях і на рисунках подано середні арифметичні та їхні стандартні похибки. Достовірними вважали розбіжності за Р < 0,05.
Результати та обговорення
Інсерційну природу мутацій, які призводили до появи канаміцинстійких (Kms) бульбочкових бактерій B. japonicum зі зміненими симбіотичними властивостями, доведено методом ПЛР. Позитивним контролем була ДНК E. coli S17-1(pSUP2021::Tn5)
і E.coli S17-1(pSUP5011::Tn5mob), негативним — B. japonicum 646. На рис. 2 наведено результати продуктів ампліфікації ДНК бульбочкових бактерій сої двох ^5-мутан-тів, одержаних із застосуванням вектора pSUP2021::Tn5 (рис. 2, А) та п’яти мутантів, отриманих із використанням вектора pSUP5011::Tn5 mob (рис. 2, Б).
Результати молекулярно-генетичного аналізу ПЦР-методом з використанням праймерів до гена неоміцинфосфотрансфе-рази транспозона Tn5 підтвердили наявність фрагмента транспозона у Tnб-мутантів B. ja-po nicum, що свідчить про інтеграцію в їхній геном гена, що зумовлює стійкість до кана-міцину. Водночас встановлено, що штам-ре-ципієнт 646 B. japonicum не містить у геномі фрагмента ДНК гена стійкості до канаміци-ну транспозона Tn5.
В умовах вегетаційних та дрібноділянко-вих дослідів Tnб-мутанти B. japonicum проаналізовано за симбіотичними показниками у різні фази онтогенезу сої сортів Аннушка, Мар’яна, Васильківська та Колбі. Особливу увагу при цьому було акцентовано на реалізацію азотфіксувального потенціалу Tn5-мутантів залежно від сорту рослини-хазяї-на. У процесі досліджень виявлено активне формування симбіотичних органів на коренях усіх без винятку рослин сої, інокульованих ^5-мутантами та штамами B. japonicum 646 і 634б. Поряд із цим встановлено відмінності за кількістю та масою бульбочок між рослинами різних варіантів досліду залежно від сорту сої та генотипу мікросим-біонта (табл. 1). В інокульованих рослин сої кількість сформованих бульбочок коливалась для сортів: Аннушка — в межах 15-27, Васильківська — 9-23, Мар’яна — 27-33, Колбі — 13-29 на одному корені, що свідчить про високу вірулентність і нодуляційну активність досліджуваних Tnб-мутантів B. um.
За показником «маса сформованих бульбочок» (г/рослину) вихідний штам 646 на сої сорту Аннушка перевищували всі 10 мутантних культур B. japonicum, Васильківська — 6, Мар’яна — 6, Колбі — 8, тимчасом як над виробничим штамом мали перевагу тільки Tnб-мутанти Т66, Т9-2, Т17-2 і В-18 — на сої сорту Аннушка та Т3-11, В-2, В-20, В-
М К1 1 2 3
А ■
М К2 1 4 5 6 7 8
Щ — ШШ
Б
Рис. 2. Електрофорез в 0,7%-му агарозному гелі продуктів ампліфікації ДНК B. japonicum та E. coli з використанням праймерів до гена неоміцинфосфотрансферази Tn5:
1 — вихідний штам 646 B. japonicum;
2, 3 — Тп5-мутанти (pSUP2021::Tn5) штаму 646 — Т66 і Т21-2;
4-8 — Тп5-мутанти (pSUP5011::Tn5mob)
штаму 646 — В-2, В-16, В-18, В-20, В-21;
К — E. coli S17-1(pSUP2021::Tn5);
К2 — E. coli S17-1(pSUP5011::Tn5mob);
М — маркер молекулярних мас (DNA Ladder Mix, Fermentas)
21 — на сої сорту Васильківська. На коренях сої сортів Мар’яна та Колбі найбільшу масу бульбочок було сформовано за участю штаму 634б.
Інтенсивність азотфіксації бульбочок сої змінювалася залежно від штаму-інокулян-та, фази розвитку і сорту рослини-хазяїна. Так, у фазі бутонізації сої сорту Аннушка найбільшу АфА бульбочок зафіксовано у рослин, інокульованих мутантами Т66, 17-2, В-2, В-18 (рис. 3, А), а у фазі бутонізація-початок цвітіння — мутантами В-16, В-18, В-20 і В-21 В. іаропіоиш (рис. 3, Б).
Слід зазначити, що бульбочки на сої сорту Аннушка, утворені мутантом В-18, виявляли стабільно вищий рівень азотфіксації у фазах бутонізації та бутоніза-ції-початку цвітіння рослин порівняно з використанням контрольних штамів на тому самому сорті. У цих фазах розвитку сої сорту Васильківська максимальну азотфік-сувальну активність бульбочкам забезпечували різні Тп5-мутанти. Зокрема, у фазі бутонізації це — В-20 і В-21, а бутоніза-ції-початку цвітіння — Т3-11 і Т21-2 В.]аро-пісит. Унаслідок формування симбіозу сої сорту Мар’яна із Тп5-мутантами Т66, Т21-2,
646 6346 Т66 ТЗ-ІI Т2І-2 Т9-2 ТІ7-2 В-2 В-16 В-18 В-20 В-21
Штам, Tn5-мутант
□ сортАннушка :: сортВасильківська J сорт Мар’яна и сорт Колбі
Б
i-Q "
^ З
•a S ■■
и £
§ І "
§ ц ■■
СС w
к ^ 5
Я W
i-Q ^
$ К
и ^
•S ч
£§
§ І я
646 6346 Т66 ТЗ-11 Т2І-2 Vi-2 ТІ7-2 В-2 В-16
Штам, Тп5-мутант
Рис. 3. Азотфіксувальна активність кореневих бульбочок сої:
А — 30-та доба (фаза бутонізації);
Б — 40-ва доба після появи сходів (фаза бутонізації-початку цвітіння) залежно від сорту рослини-хазяїна і використаних для інокуляції Тп5-мутантів В. іаропіеиш (дріб-ноділянковий польовий дослід). Достовірність розбіжностей від контрольного значення Р < 0,05
В-2 і В-18 азотфіксувальна активність бульбочок збільшилася на 27,0-50,0% у фазі бутонізації (30-та доба) і на 14,0-28,0% у фазі бутонізації-початку цвітіння (40-ва доба) порівняно із застосуванням батьківського штаму 646. Водночас, суттєву перевагу за АфА (на 20,0-35,0%) над бульбочками, утвореними штамом 634б, ці мутанти мали тільки у фазі бутонізації-початку цвітіння (як виняток, у фазі бутонізації азотфіксація бульбочок сої за участю штаму Т21-2 була більшою в 1,3 раза, ніж бульбочок штаму 634б). Слід зазначити, що показник інтенсивності азотфіксації бульбочок сої сорту Мар’яна у фазі бутонізації досягав 7,36-8,74 проти 5,13-5,81 мкмоль С2Н4 /(рослину/год) у фазі бутонізації-початку цвітіння рослин, інокульованих зазначеними мутантами.
Інокуляція сої сорту Колбі мутантами (за винятком Т17-2, В-21) призводила до збіль-
Таблиця 1. Формування симбіотичного апарату в різних сортів сої за інокуляції Тп5-мутантами бульбочкових бактерій сої (30-а доба після сходів, дрібноділянковий польовий дослід)
Варіант Сорт Аннушка Сорт Васильківська Сорт Мар’яна Сорт Колбі
а б а б а б а б
646 13,3±2,0 0,04±0,003 11,3±0,7 0,06±0,001 35,0±4,5 0,12±0,02 17,3±2,3 0,04±0,00
634б 19,3±1,8 0,12±0,01 24,0±1,5 0,06±0,008 42,0±3,2 0,28±0,04 25,7±2,7 0,19±0,02
Тп5-мутанти B. japonicum, одержані з використанням вектора рвиР2021::Тп5
Т66 27,6±1,8 0,11±0,008 14,6±0,3 0,04±0,00 28,3±4,4 0,13±0,01 27,3±1,2 0,08±0,01
Т3-11 22,0±1,2 0,08±0,006 20,0±1,5 0,07±0,003 27,0±2,0 0,05±0,01 17,0±5,8 0,07±0,03
Т21-2 26,6±2,0 0,08±0,002 21,3±2,7 0,06±0,003 30,6±1,2 0,17±0,01 26,3±2,3 0,02±0,01
Т9-2 25,0±0,6 0,16±0,003 9,60±1,4 0,02±0,00 32,0±4,7 0,15±0,03 28,7±3,0 0,10±0,00
Т17-2 25,0±1,0 0,13±0,10 18,0±3,0 0,05±0,001 32,0±5,5 0,06±0,01 17,7±3,8 0,08±0,03
Тп5-мутанти B. japonicum, одержані з використанням вектора рвиР5011::Тп5 шоЬ
В-2 24,0±1,0 0,10±0,01 18,0±1,0 0,08±0,03 28,7±5,7 0,17±0,02 29,0±3,0 0,12±0,01
В-16 15,3±5,0 0,09±0,02 14,0±0,9 0,04±0,006 31,0±7,2 0,11±0,03 26,3±2,0 0,11±0,03
В-18 22,0±1,2 0,14±0,00 15,3±1,2 0,06±0,01 33,0±5,4 0,15±0,02 17,0±1,0 0,10±0,00
В-20 20,0±2,5 0,10±0,01 23,0±3,7 0,15±0,01 27,3±5,4 0,09±0,03 21,7±2,0 0,08±0,01
В-21 18,0±1,7 0,09±0,02 21,0±2,0 0,19±0,02 26,7±1,4 0,14±0,03 13,0±0,5 0,03±0,01
Примітка: а — кількість бульбочок, шт./рослину; б — маса бульбочок, г/рослину.
шення асиміляції N бульбочками рослин у фазі бутонізації тільки порівняно з бактеризацією штамом 646. Два мутанти — В-18 і В-20 — домінували за АфА над обома контрольними штамами 646 і 634б також
1 у фазі бутонізації-початку цвітіння.
У результаті дослідження виявлено максимально продуктивні за ознакою азотфік-сувальної активності симбіотичні системи із урахуванням генетичних особливостей сортів сої та мікросимбіонтів: 1) сорту Аннушка — В-16, В-18, В-20, В-21, Т66, Т17-2; 2) сорту Васильківська — В-20, Т21-2, Т3-11;
3) сорту Мар’яна — Т66, Т21-2, В-2, В-18;
4) сорту Колбі — В-18, В-20; рівень їх асиміляції N перевищував активність симбіозів, утворених штамами 634б та 646 (рис. 3).
Інтенсивність симбіотичної азотфіксації сої сортів Аннушка, Васильківська, Мар’яна і Колбі значною мірою визначалася функціональною активністю мікросимбіонта у відповідній фазі розвитку рослини-хазяї-на. На нашу думку, здатність окремих мутантів В. іаропіеиш інтенсивніше зв’язувати атмосферний N у симбіозі з рослиною у певній фазі її розвитку можна реалізувати, якщо залучити їх як один із компонентів комплексних азотфіксувальних препаратів. Наприклад, для бактеризації сої сорту Колбі це можуть бути Тп5-мутанти В-18, В-20, Т9-
2 або Т21-2, а для сорту Васильківська —
мутанти Т3-11, Т21-2, В-20 і В-21, оскільки інтенсивність зв’язування N бульбочками, утвореними за їхньої участю, суттєво відрізняється у фазах бутонізації та бутоніза-ції-цвітіння.
Таким чином, один із шляхів посилення інтенсивності біологічної азотфіксації сої протягом фаз бутонізації та бутонізації-початку цвітіння — використання Тп5-мутантів із різним генетично-детермінова-ним рівнем активності ензиму нітрогенази, які комплементарні до відповідного сорту. Результати показують можливість розроблення комплексних бактеріальних препаратів на основі штамів бульбочкових бактерій із підвищеним рівнем реалізації азотфіксу-вальної здатності в різні фази розвитку сої та залежно від тривалості вегетаційного періоду рослини-хазяїна.
Особливості формування та функціонування симбіотичних систем сої сортів Аннушка, Васильківська, Мар’яна та Колбі за участю Тп5-мутантів В іаропіеиш зумовили різний ступінь реалізації продуктивного потенціалу рослин. Найефективнішою порівняно із застосуванням виробничого штаму В. іаропіеиш 634б виявилась інокуляція сої сорту Аннушка Тп5-мутантами В-16, В-18 і В-20 (приріст урожаю зерна становив 19,5-30,0%), сорту Васильківська — мутантами Т66, Т21-2, Т9-2, Т17-2 (8,8-29,5%),
сорту Мар’яна — мутантами Т66, Т21-2, Т17-2, В-20 (8,8-20,1%), сорту Колбі — мутантами Т66, Т21-2 Т17-2, В1-16
(8,2-12,5%) (табл. 2).
У результаті досліджень відібрано Тп5-мутанти Т66, Т21-2, В-18 і В-20 В. іаропіеиш із розширеним спектром комплементарнос-ті, які забезпечували інтенсивнішу азотфіксацію сої різних сортів у фазах бутонізації та бутонізації-початку цвітіння, що сприяло одержанню більшого урожаю зерна порівняно із застосуванням штамів 646 та 634б.
Однією з причин неповної реалізації потенціальної генетично детермінованої активності Тп5-мутантів В. іаропіеиш ймовірно є певна невідповідність між фізіологічною активністю сої, яка пов’язана із фазами розвитку, тривалістю вегетаційного періоду, сортовою стиглістю рослини-хазяї-на, і динамікою азотфіксувальної активності бульбочок, зумовленою функціонуванням нітрогенази мікросимбіонта.
Зважаючи на те, що сорти сої за тривалістю вегетаційного періоду, який коливається від 75 до 135 днів, умовно поділяють на чотири групи (за сортовою стиглістю), доцільним було б збалансувати формування і функціонування симбіотичної системи рослин, використовуючи ризобії з відповідним типом динаміки азотфіксувальної активності. Таким чином, мета подальших досліджень полягала в доборі активних штамів
В. іаропіеиш за динамікою азотфіксувальної активності до сортів сої з різною тривалістю періоду вегетації.
В умовах вегетаційного досліду для інокуляції насіння сої сортів Аннушка, Васильківська і Мар’яна використали перспективні Тп5-мутанти В. іаропіеиш — Т66(р£>ЦР2021::Тп5) і В-16, В-20(р8ИР5011::Тп5), одержані із застосуванням різних плазмід-векторів. Фази розвитку сої сортів, які належать до різних груп стиглості, відрізнялись, а тому азотфіксувальну активність бульбочок оцінювали на 22-гу, 30-ту, 40-ву, 47-му та 55-ту добу після появи сходів рослин (рис. 4). Бобово-ризобіальні системи, утворені на основі різних сортів сої за участю одного й того самого мікросимбіонта — Тп5-мутанта, відрізнялися за динамікою азотфіксувальної активності. Водночас, рослини сої певного сорту, інокульовані відмінними транспозо-новими мутантами В. іаропіеиш, різнились як за інтенсивністю, так і за динамікою АфА бульбочок.
На ранніх етапах онтогенезу рослин (22га і 30-та доба після сходів) інтенсивність асиміляції N бульбочками сої сорту Аннушка була найбільшою у варіантах з інокуляцією насіння мутантом В-16. На пізніших етапах розвитку рослин (40-ва, 47-ма та 55-та доба) домінували за цим показником симбіотичні системи сої за участю Тп5-мутанта Т66. Таким чином, з метою посилення
Таблиця 2. Урожай (ц/га) зерна сої, інокульованої Тп5-мутантами B. japonicum
(дрібноділянковий польовий дослід)
Варіант Сорт
Аннушка Васильківська Мар’яна Колбі
B. japonicum 646 22,8±0,9 26,5±1,2 24,З±1,2 32,б±1,9
B. japonicum 634б 2З,6±0,8 29,5±1,2 24,9±0,7 З2,8±1,8
^б-мутанти B. japonicum (pSUP2021::Tn5)
T66 24,5±1,9 З2,1±2,1* 27,1±1,2 Зб,8±2,1*
T3-11 26,4±1,1* 25,4±1,З 25,8±1,З* ЗЗ,7±2,0
T21-2 27,7±1,2* ЗЗ,4±1,4* 27,2±1,З* З6,9±2,4*
T9-2 21,6±0,8 З8,2±1,2* 25,5±0,9 З2,1±1,9
T17-2 26,0±0,9* З2,7±1,2* 29,9±1,З* З5,7±1,7*
^б-мутанти B. japonicum (pSUP5011::Tn5mob)
В-2 25,2±1,2 29,З±1,2 24,9±0,8 27,4±0,9
В-16 З0,7±1,5* 20,7±0,9 21,6±1,З Зб,б±1,З*
В-18 28,4±1,2* 26,З±0,8 20,4±1,З ЗЗ,6±1,4
В-20 28,2±1,З* 29,7±1,2 29,б±1,2* ЗЗ,8±1,7
В-21 2З,0±1,1 16,2±0,4 2б,7±1,3* 28,1±1,1
* Р < 0,05 порівняно з контролем.
симбіотичної азотфіксації сої сорту Аннушка як перспективну можна розглядати комплексну інокуляцію насіння бульбочковими бактеріями В-16 + T66.
У варіантах за інокуляції сої сорту Мар’яна мутантами T66, В-16, В-20 і 634б азотфіксувальна активність бульбочок була подібною за динамікою (рис. 4, Б), але відрізнялася за інтенсивністю у певній фазі розвитку рослин. Упродовж вегетаційного періоду найбільша інтенсивність азотфіксації була притаманна бульбочкам сої сорту Мар’яна, утвореним мікросимбіонтом T66. Як перспективну для цього сорту слід розглядати композицію бульбочкових бактерій сої T66+6346.
Оптимізувати азотфіксувальний потенціал симбіотичної системи сої сорту Васильківська на початкових етапах функціонування можна, застосовуючи ^б-мутанти В-16 і В-20, які здатні забезпечити більшу азотфіксацію, ніж мікросимбіонти T66 і 634б B. japonicum. Максимальні значення показників азотфіксації бульбочок сої сорту Васильківська, утворених мутантами В-16 і В-20, зафіксовано на 22-гу та 30-ту добу вегетації рослин. Для порівняння варто зазначити, що в результаті бактеризації сої сорту Васильківська штамом 634б спостерігали збільшення асиміляції N2 бульбочками на 40-ву та 47-му добу вегетації сої (відповідно фази — початок цвітіння та початок утворення бобів). Для інокуляції насіння сої сорту Васильківська доцільно застосовувати суміші на основі бульбочкових бактерій В-16+T66, В-20+T66, а також В-16+6З4б та В-20+634б.
Отже, динаміка та інтенсивність зв’язування атмосферного азоту бобово-ризобіаль-ними системами залежить як від генотипу мікросимбіонта (у даному разі різні ^б-мутанти та штами 646 і 634б B. japonicum), так і від сорту рослини-хазяїна та її фази розвитку. Бульбочкові бактерії B. japoni-cum, одержані з використанням плазміди pSUPб011::Tnбmob, активізували симбіо-трофне живлення і забезпечували зернову продуктивність більшою мірою за інокуляції ранньостиглих сортів сої — Аннушка, Васильківська, а з допомогою вектора pSUP2021::Tnб — сортів сої Мар’яна і Колбі, вегетаційний період яких є більш тривалим.
Tаким чином, використання бульбочкових бактерій B. japonicum, одержаних транс-позоновим мутагенезом, як штамів-іноку-лянтів можна розглядати як можливі
Рис. 4. Азотфіксувальна активність симбіотичних систем сої сортів:
А — Аннушка; Б — Мар’яна; В — Васильківська за участю різних ^б-мутантів B. japonicum. Доба після появи сходів рослин: 1 — 22-га; 2 — 30-та; 3 — 40-ва; 4 — 47-ма; 5 — бб-та
напрями інтенсифікації симбіотичної азотфіксації сої. Перший (моноінокуляція) — підбір бульбочкових бактерій за відповідним типом динаміки азотфіксувальної активності до певного сорту сої з урахуванням тривалості вегетаційного періоду росли-ни-хазяїна. Другий — використання бінарних або полікомпонентних препаратів на основі культур Bradyrhizobium, які подібні за динамікою, але відрізняються за інтенсивністю азотфіксувальної активності у різних фазах розвитку рослини-хазяїна або ж поєднання інокулянтів із різним типом динаміки АфА.
ЛІТЕРАТУРА
1. Коць С. Я., Моргун В. В., Патика В .Ф. и др.
I Биологичекая фиксация азота: бобово-ризо-биальный симбиоз. — К.: Логос, 2010. — T. 1. — б08 с.
2. Гeнemика симбиотической азотфиксации с основами селекции I Под. ред. ^хонови-ча И. А., Проворова Н. А. — СПб.: Наука, 1998. — 194 с.
3. Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями I Под ред. Спайнка Г., Кондороши А., Хукаса П. Пер. ^хонович И. А., Проворов Н. А. — СПб., 2002. — б67 с.
4. Бабич О.А., Нємцов А. В., Пemринeнко В. Ф. Наукові основи сучасних технологій вирощування сої на насіння в умовах Лісостепу України I Зб. наук. праць Вінницького ДАУ. — Вінниця, 2000. — Вип. 7. — С. 10-13.
б. Толкачов М. З, Дїдович С. В., Aдамeнь Ф. Ф., Нeсmeрчук Н. Н. Ефективність нітрагінізації зрошуваної сої на фоні грунтової популяції Bradyrhizobium japonicum // Физиол. биохим. культ. раст. — 2001. — T. 33, № б. — С. 436-440.
6. Aдамeнь Ф. Ф. Tеоретическое обоснование минерального питания растений сои в условиях юга Украины. — Симферополь: Tаврида, 199б. — 94 с.
7. Коць С. Я. Роль біологічного азоту у підвищенні продуктивності сільськогосподарських рослин II Физиол. биохим. культ. раст. — 2001. — T 33, № 3. — С. 208-21б.
8. Антипчук А. Ф., А^рєюк Е. И., Pангeло-ва В. И. и др. Ростовая активность и технологические свойства азотфиксирующих микроорганизмов при их гетерофазном культивировании II Мікробіол. журн. — 1997. — T. б9. № 4. — С. 117-123.
9. Smith R. S. Rhizobial inoculant technology in North America II Biology of Plant-Microbe Interactions: New Bridges between Past and Future: Proccedings of the 11 International congress on Molecular Plant — Microbe Interactions. St. Peterburg. July 18-26, 2003. — St. Paul. (Minn). — 2004 — Р. 294-б96.
10. Патика В. Ф., Tолкачeв Н. З., Бутвина Ю. З. Основные направления оптимизации симбиотической азотфиксации в современном земледелии Украины II Физиол. биохим. культ. раст. — 200б. — T. 37, № б. — С. 384-393.
11. Патика В. П., Коць С. Я., Волкогон В. В. та ін. Біологічний азот. — К.: Світ, 2003. — 424 с.
12. Малiчeнко С. М., Да^нко В. К,, Василюк В. М. Tранспозоновий мутагенез штамів Bradyrhizobium japonicum II Физиол. биохим. культ. раст. — 2007. — T 39, № б. —
С. 409-418.
13. Simon R., O,Connel M., Labes M., Puhler A. Plasmid vectors for the genetic analysis and manipulations of Rhizobia and other gram-negative bacteria II Methods inenzymology. — Academ. Press Inc. — 1986. — V. 118. — P. 640-6б9.
14. Коць С. Я., Моргун В. В., Тихонович И. А. и др. Биологическая фиксация азота: Генетика азотфиксации, генетическая инженерия штаммов. — К.: Логос. — 2011. — T. 3. — 404 с.
1б. Коць С. Я., Малiчeнко С. М., Дащнко В. К. та ін. ^б-мутанти Bradyrhizobium japonicum: отримання та вивчення їхніх властивостей II Факт. експерим. евол. мікроорг. — Зб. наук. пр. — T. 7. — К.: Логос, 2009. — С. 28-32.
16. Comfort N. C. From controlling elements to transposons: Barbara McClintock and the Nobel Prize II Trends Biochem. Sci. — 2001. — V. 26. — P. 4б4-4б7.
17. Воробeй Н. А., Коць С. Я., Малiчeнко С. М., Якимчук Р. А. Дослідження симбіотичних систем сої, утворених за участю транспо-зантів Bradyrhizobium japonicum II Физиол. биохим. культ. раст. — 2006. — T. 38, № б. — С. 418-426.
18. Karr D. B,, Rong-Ti L., Reuhs B. L., Emerich D. W. Altered exopolysaccharides of Bradyrhizobium japonicum mutants correlate with impaired soybean lectin binding, but not with effective nodule formation II Planta. — 2000. — V. 211. — P. 218-226.
19. Marrogui S., Zorreguieta A., Santamari C. et al. Enhanced symbiotic performance by Rhizobium tropici glycogen synthase mutants II J. Bateriol. — 2001. — V. 183, N 3. — P. 8б4-864.
20. Prevost D., Bromfield E. S. P. Diversity of symbiotic rhizobia resident in Canadian soils
II Can. J. Soil Sci. — 2003. — V. 83, N 3. — Р. 311-319.
21. Коць С. Я., Моргун В. В., Патика В. Ф. и др. Биологическая фиксация азота: бобово-ризобиальный симбиоз: T. 1. — К.: Логос, 2019. — б08 с.
22. Chachaty E., Saulnier P. Isolation chromosomal DNA from bacteria I The Nucleic Acid Protocols Handbook (R. Rapley Ed.). — Humana Press Inc., Totowa NJ. — 2000. — P. 29-32.
23. Миллeр Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. — М.: Мир, 1976. — 39б с.
24. Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. — 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Press, 1998.
2б. Воробeй Н. А., Заєць В. М., Коць С. Я. Біотехнологія створення ефективних ^б-мутантів бульбочкових бактерій конюшини Rhizobium leguminosarum bv. trifolii II Біотехнологія. — 2012. — T. б, № 3 —
C. б3-61.
26. Reznikoff W. S. Transposon Tn5 // Annu. Rev. Genet. — 2008. — V. 42.- P. 151-158.
27. Гродзинский А. М., Гродзинский Д. М. Краткий справочник по физиологии растений. — К.: Наук. думка, 1964. — 388 с.
РЕАЛИЗАЦИЯ АЗОТФИКСИРУЮЩЕГО ПОТЕНЦИАЛА TN5-МУТAНТOВ Bradyrhizobium japonicum В СИМБИОЗЕ С РАСТЕНИЯМИ СОИ
Н.А. Воробeй, С. Я. Коць, П. Н. Мамeнко
Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев
E-mail: [email protected]
В результате проведенных исследований среди ^б-мутантов Bradyrhizobium japonicum селекционированы клубеньковые бактерии, которые отличались интенсивностью и динамикой нитрогеназной активности в симбиозе с растениями сои. Инсерционная природа мутаций, обусловливающих появление KmR-форм B. japo-nicum с измененными симбиотическими свойствами, доказана при использовании полимеразной цепной реакции. В условиях вегетационных и мелкоучастковых опытов ^б-мутанты B. japo-nicum проанализированы по симбиотическим показателям в разные фазы онтогенеза сои сортов Аннушка, Васильковская, Марьяна и Колби, которые относятся к трем группам сортовой спелости. Установлено, что динамика и интенсивность ассимиляции N2 корневыми клубеньками сои зависела от генотипа микросимбионта, сорта и фазы развития растения-хозяина. ^б-мутан-ты B. japonicum, полученные с применением плазмиды pSUP5011::Tn5mob, были более эффективны в симбиозе с раннеспелыми сортами сои Аннушка и Васильковская, а с использованием pSUP2021::Tn5 — с сортами сои Марьяна и Колби, вегетационный период которых более продолжителен. По результатам исследований также отобраны ^б-мутанты B. japonicum T66, T21-2, В-18 и В-20 с расширенным спектром ком-плементарности, обеспечивающие более интенсивную азотфиксацию сои разных сортов в фазах бутонизации и бутонизации-начала цветения, что обусловливало увеличение урожая зерна в сравнении с использованием штаммов 646 и 634б. Рассматривается стратегия создания поликомпонентных инокулянтов для сортов сои, которые принадлежат к разным группам спелости, на основе штаммов ризобий с различной интенсивностью и динамикой азотфиксирую-щей активности.
Ключевые слова: бобово-ризобиальный симбиоз, Bradyrhizobium japonicum, ^б-мутанты.
28. Hardy R. W. F, Holsten R. D, Jackson E. K., Burns R. C. The acetylene-etylene assay for N2 fixation: laboratory and field evaluation // Plant Physiol. — 1968. — V. 43, N 8. — P. 1185-1207.
29. Доспехов Б.А Методика полевого опыта. — М.: Агропромиздат, 1985. — 352 с.
REALIZATION OF NITROGEN FIXATION POTENTIAL OF TN5-MUTANTS Bradyrhizobium japonicum IN SYMBIOSIS WITH SOYBEAN PLANTS
N. A. Vorobey, S. Ya. Kots, P. M. Mamenko
Institute of Plant Physiology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine
E-mail: [email protected]_
Nodule bacteria of different rate and dynamics of nitrogenase activity in symbiosis with soybean plants were selected as the result of investigation of Bradyrhizobium japonicum Tn5-mutants. Insertion nature of mutations that lead to appearance of KmR forms of B. japonicum with changed symbiotic properties was proved by PCR- technique. Tn5-mutants of B. japonicum were analyzed for their symbiotic characteristics in vegetative and small plot experiments during different ontogenesis stages of various soybean plants (Annushka, Vasylkivska, Maryana, Colbi) that cover three cultivar maturity groups. It was established that dynamics and intensity of nitrogen assimilation in soybean root nodules depended on microsymbiont genotype, as well as culti-var and development stage of host plant. It was shown that Tn5-mutants obtained with the plasmid pSUP5011::Tn5mob were more efficient in symbiosis with early-maturing soybean cultivars Annushka and Vasylkivska, while mutants obtained with the pSUP2021::Tn5 plasmid — more efficient in symbiosis with Maryana and Colbi soybean cultivars with the prolonged vegetation period. Tn5-mutants of B. japonicum T66, T21-2, В-18 and В-20 with advanced complementarity properties, that ensure higher nitrogen fixation rates in soybean plants during budding and budding-early flowering stages resulting in yield increase as comparing to the B. japonicum strains 646 and 634b were selected. The possibilities of creation of polycomponent inoculum for soybean cultivars belonging to different maturity groups based on the rhizobia strains with various intensity and dynamics of nitrogen fixation activity are discussed.
Key words: legume-rhizobial symbiosis,
Bradyrhizobium japonicum, Tn5-mutants.
