CC BY
25
УДК 576.871.155. 557
БЮТБХНОЛОПЯ СТВОРЕННЯ ЕФЕКТИВНИХ TN5-MYTAHTIB БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕР1Й КОНЮШИНИ Rhizobium leguminosarum bv. trifolii
H. А. Воробей1 11нститут ф1зюлогп рослин i генетики НАН Украши, Кт'в
B. М. Заецъ2
C. Я. Коцъ1 Институт молекулярно!" бюлогп i генетики НАН Украши, Кт'в
E-mail: [email protected]
Отримано 03.10.2011
За допомогою плазмщного вектора pSUP2021::Tn5 було проведено мутагенез штаму 348а Rhizobium leguminosarum bv. trifolii. Частота виникнення KmR-MyraHTiB за перенесения цього вектора з Escherichia coli в Rhizobium становила 1,9107. 1нсерцшну природу отриманих мутантав доведено з використанням пол1меразно! ланцюгово! реакци. За симб1отичними показниками та БГГ-фено-типом рослин конюшиии в умовах мшровегетацшного та вегетацшного дослвдв здшснено скриншг Тп5-мутант1в та ввдбрано pH3o6ii' з тдвищеним синтезом штрогенази i господарсько-цшними влас-тивостями. Тпб-мутанти Т2к, Т28к, Т72к суттево перевершували rnmi ризоби за нодуляцшною ак-тившстю. Шд час фази цвтння конюшини на коренях рослин за i'x участю утворилося в 1,4—1,7 раза больше бульбочок, як1 домшували за масою. 3 посиленням ризогенезу иадземна маса рослин зб^льшилась на 29,6—41,8%. 1нтенсифшащя ф1з1олопчних процеив у конюшини забезпечувалася зб^льшенням штрогеназно! активноста симб1отичного апарату, яка у фаз1 початку цвтння переви-щувала в середньому в 2,5 раза показники рослин, шокульованих вихщним (батьшвським) штамом 348а. Отримаш дат свщчать про можлив1сть створення високоефективних симб1отичних систем ко-нюшина — Тпб-мутанти Rhizobium leguminosarum bv. trifolii.
Ключов1 слова: транспозоновий мутагенез, Тп5-мутанти, пол1меразна ланцюгова реакщя, конюшина, симб1оз, азотфшсувальна актившсть, ефектившсть.
Багатор1чш бобов1 трави е важливими кор-мовими культурами, яш в симбюз1 з бульбоч-ковими бактер1ями здатт забезпечити сво! потреби в азота за рахунок бюлопчно! азотфжсацп [1—3]. Вони вщпрають виршаль-ну роль у скорочент дефщиту рослинного протешу, а також виконують основну функцш в бюлопзацп землеробства, справляючи вплив на родючють Грунту 1 стан довшлля [4].
Конюшина — культура з високим симбю-тичним потенщалом [5, 6]. Осшльки в Ук-ра'1ш вона вирощуеться досить давно, у Грунтах присутш диш «агресивш» популяцп бульбочкових бактерш Rhizobium legumi-nosarum Ьу. trifoШ, яш зазвичай мають низь-кий р1вень азотфшсувально! активноста [7]. Оптим1зувати азотне живлення конюшини можна бактеризащею 11 насшня високоак-тивними штамами бульбочкових бактерш.
Тривалий час генетичною базою для се-лекцп активних штам1в слугували бактерп, вид1леш з природних бюценоз1в [8-10] або одержан! за дп ф1зичних 1 х1м1чних мута-гешв [11, 12]. Використання метод1в моле-кулярно! генетики та генно! шженерп, зок-
рема пбридизацп й транспозонового мутагенезу, дало змогу значно розширити спектр спадково! мшливоста ризобш [13, 14]. Згщно з даними л1тератури застосування транспозонового мутагенезу до бульбочкових бактерш спричинюе появу широкого спектра кйтин 1з поодинокими мутащями [15-21]. Змши, що вщбуваються у геном1 мшросим-бюнта, призводять як до редукцп симбю-тичного потенщалу, так 1 до полшшення господарсько-цшних властивостей бульбочкових бактерш.
Метою роботи було отримати транспозо-нов1 мутанти бульбочкових бактерш конюшини з тдвищеною в1руленттстю, азотфшсувальною актившстю 1 створити на 1х основ! високоефективш симбютичш сис-теми конюшина — Rhizobium legumi-nosarum ЬУ. trifoШ.
Матер1али 1 методи
В експериментах використано штами бульбочкових бактерш конюшини Rhizo-bium leguminosarum ЬУ. trifoШ Б1(1000)ММ,
B1(100)E, B1(-10)E, C10, 8St, 500, 348a, 346 та штам S17-1 (pSUP2021 ::Tn5) Escherichia coli 3 колекцп азотфшсувальних мшроор-ган1зм1в 1нституту ф1зюлогп рослин i генетики HAH Украши. Плазмщний вектор pSUP2021 створено на основ! мультикопш-но1 немобШзуючо! плазмщи pBR325 E. coli з обмеженим спектром хазя!в, не здатно! до реплшацп у кл1тинах бульбочкових бакте-рш [22]. Плазмща мае фактори стшкоста до антибютишв, у тому числ1 й до канамщину (Km) у концентрацп 200 мкг/мл, цю стш-KicTb кодуе транспозон Tn5. Характеристику штаму наведено в табл. 1. Антибютики стрептомщин (Str), канамщин (Km) належать до класу амшоглшозид1в, добре роз-чинн1 у вод1 й погано — у лшщах [23].
Бульбочков1 6aKTepi'i вирощували на ага-ризованому середовишД 79 (г/л диет. води): K2HPO4 • H2O — 0,5; MgSO4 • 7H2O — 0,2; NaCl — 0,1; CaCO3 — слщи; др1жджовий екстракт — 2; казамшов1 кислоти або лакталь-бум1н — 0,5; машт — 10; pH середовища — 7,2-7,4, стерил1защя за 0,8 — 1 атм протя-гом 30 хв, три доби за 28 °С, E. coli S17-1 — на середовишД LB [24] за 37 °С одну добу.
Транспозоновий мутагенез. Спектр штам1в-рецитент1в обмежений особливостя-ми векторно! плазм1ди pSUP2021 ::Tn5, яка входить до складу геному E. coli S17-1. Ком-петентш штами-рецитенти мають бути чут-лив1 до 25-50 мкг/мл Km у середовишД виро-щування i резистентш до 800-1000 мкг/мл Str. Уведення транспозона Tn5 до кл1тин ри-зобш здшенено з використанням E. coliS17-1 за методикою, описаною в л1тератур1 [19, 24, 25] у нашш модифшацп. Бактер1альш куль-тури донора та рецитента зм1шували у стввщношенш 1 : 5 в 0,5 мл стерильно! води. Сум1ш кл1тин переносили на агаризова-не середовище TY [24] в чашки Петр1 та шкубували при +28 °С протягом 6 год (зва-жаючи на те, що подвоення кл1тин швидко-рослих ризоб1й в1дбуваеться за 4-6 год). Шсля цього 6aKTepi'i змивали з поверхн1 середовища стерильною водою (5 мл) i суспен-дували. Готували посл1довн110-, 100-кратн1 i т. д. розведення кон'югац1йно1 cyMirni кл1тин та вис1вали на селективш середови-
ща по 0,2 мл. Для вщбору Тп5-мутант1в се-лективним середовищем слугувало TY + 200 Km + 500 Str (мкг/мл). Контрселекщю кль тин (селекц1ю проти штаму-донора E. coli) проводили насередовишД TY + 800 мкг/мл Str.
Частоту транспозицп (V) обчислювали за сп1вв1дношенням:
К1льк1сть кл1тин в 0-розведенн1, V_ вирощених на TY + Km + Str
Шльшсть кл1тин в х-розведенн1, вирощених на TY + Str.
Видшення геномноХ ДНК. у po6otí ви-користано реактиви та ензими: трис (Tris [hydromethyl] — aminomethane), агарозу ф1рм Sigma та Serva, етиленд1амшотетраоц-тову кислоту (ЕДТА) та цетилтриетил-амон1йбром1д (ЦТАБ), проте!назу К та рибо-нуклеазу А ф1рми Sigma, додецилсульфат натр1ю (ДДС) ф1рми BDH, бромистий етид1й ф1рми Calbiochem, сол1 NaCl, MgCl2, оцтово-кислий Na та борну кислоту — в1тчизняного виробництва марок хч та осч, Taq-пoлiмepa-зу та реактиви для ПЛР — ф1рми Fermentas.
Кттини бульбочкових бактер1й в1дмива-ли вщ пол1сахарид1в i дв1ч1 промивали буфером TE (10 mM Tris-Cl, pH 8,0 1mM EDTA за допомогою центрифугування на м1кроцент-рифуз1 Eppendorf при 6 000 об/хв). В1дми-тий осад культури суспендували для л1зису кл1тин в 0,547 мл буфера TE, додавали 30-50 мкл 10% додецилсульфату Na (ДДС) та протешазу К до кшцево! концентрац11 50 мкг/мл. Л1зис проводили затемператури 37 °С упродовж 60 хв. Для додаткового л1зи-су та подальшого очищения нукле'1нових кислот до л1зату додавали 100 мкл 5М NaCl i 80 мкл 10% ЦТАБ в 0,7 М NaCl та ÍHKy6y-вали його 15-20 хв при 60 °С. Нукле'1нов1 кислоти депроте1н1зували píbhhm об'емом cyMirni хлороформ-1зоам1ловий спирт у стввщношенш 24 : 1, центрифугували при 12 000 об/хв протягом 10 хв для осад-ження денатурованих проте'1н1в та пол1саха-рид1в. Водну фазу з нукле1новими кислотами вщбирали i повторно депроте1н1зували таким самим розчином хлороформ-1зо-ам1ловий спирт, як i рашше. У водний роз-чин нукле'1нових кислот додавали РНК-азу для г1дрол1зу РНК до концентрацп 50 мкг/мл й шкубували за шмнатно! температури 20-30 хв. ДНК Í3 водно! фази осаджували piBHHM об'емом 100%-го 1зопропанолу або 2,5 об'емами 96%-го етанолу за 12 000 об/хв впродовж 10 хв, noTÍM в1дмивали 70%-м ета-нолом i розчиняли в 50 мкл буфера ТЕ. Для
Таблиця 1. Характеристика Escherichia coli S17-1
Штам, плазмвда Характеристика
E. coli S17-1 МобШзуючий штам, донор SUP-BeKTopiB
Плазмща pSUP2021 (pBR325-MobRP4)::Tn5, ApR, CmR, KmR
Тад-пол1меразно1 реакцп використовували 1 мкл розчину ДНК.
ПЛР-ампл1фшащю проводили на ампл1фжатор1 Proteus (Великобриташя) в 06'eMÍ 30 мкл у ПЛР-буфер1 ф1рми Fermentas, що mícthb 2 mM MgCl2 i 0,2 mM кожного dNTP. Умови проведения реакцп: початкова деиатуращя 2-3 хв за 95 °С, наступи! 25 цикл1в деиатурацп, пбридизацп та синтезу виконували вщповщно за 95 °С — 30 с, за 58 °С — 30 с та 72 °С — 45 с. Останнш синтез проводили за 72 °С 5 хв. На один зразок використовували 50 нг ДНК, 0,25 мкмоль/л кожного праймера та 1U Тад-пол1мерази.
Праймери для ПЛР сконструювали за до-помогою програми Primer-3 на структур ну послщовшсть гена неомщиифосфотрансфе-рази Tn5 завдовжки 517 нуклеотидних пар:
5' - CTGAATGAACTGCAGGACGAG — 3' прямий праймер
5' _ CAATATCACGGGTAGCCAACG — 3' зворотний праймер.
Продукти ПЛР-реакцп анал1зували за допомогою електрофорезу в 0,7%-му агароз-ному гел1 [26, 27] з бромистим етид1ем.
Первинний скриншг Tn5-MyTaHTÍB R. leguminosarum bv. trifolii за симбютичними властивостями i БГГ++-фенотипом рослии здшснювали в умовах стерильного мшрове-гетацшногодослщу [28] при 20-25 °С, 16-го-дииному фотоперюд1 й додатковому осв1тленш 40 000 лк (рис. 1, А, 1, Б).
Експерименти проведено з рослииами конюшини червоно! Trifolium pratense L. (сорт Дарунок селекцп 1нституту землероб-ства НААН Украши). В умовах вегетацшного дослщу рослини вирощували у 10-шлогра-мових посудинах Вагнера, простерил1зова-них 20%-м розчином Н202. Як субстрат використовували промитий р1чковий nicoK, збагачений мшеральною сум1шшю Гельрпе-ля [29] з 0,25 н азоту (1 нормавщповщае 708 мг Ca(NO3)2 ■ 4Н20 на 1 кг nicKy). Перед по-cíbom насшня конюшини стерил1зували 70%-м етанолом протягом 15 хв, промивали проточною водою 30 хв та вщпов1дно до схе-ми дослщу шокулювали водними суспенз1я-ми бульбочкових бактерш (109 кттин/мл) упродовж 60 хв. У посудhhí вирощували по 8 рослин в умовах 60%-'i вологоста субстрату вщ nobho'i вологоемноста й за природного ocbít-лення. Повторюватсть у вар1антах дослщу семиразова. Контролем слугували рослини, шокульоваш бульбочковими бактер1ями вихщного (батьк1вського) штаму 348а.
Ефектившсть симбюзу конюшини i Tn5-мутантав R. leguminosarum bv. trifolii оцшю-вали за шльшстю, масою кореневих бульбо-
чок, '1хньою азотфшсувальною актившстю, а також показниками надземно! маси i маси корешв рослин, накопичеиням cyxoï речо-вини. Рослини для анал1зу вщбирали у фаз1 кущшня, бутошзацп та цвтния. Штроге-назну актившсть (азотфшсащю) визначали за piBHeM ацетиленвщновлювально! актив-HocTi бульбочок ацетиленовим методом Хард1 [30, 31] i виражали в мшромолях (або наномолях) етилену, який утворився буль-бочками oflHieï рослини за 1 год (або 24 год). Газову сум1ш анал1зували на газовому хроматограф! Agilent Technologies 6855 Network GC System (визначення проводили у п'ятикратнш повторюваноста).
Статистичну обробку експеримеиталь-них даиих виконували за Доспеховим [32] i3 застосуванням програми Microsoft Excel 2003. Для показника урожайноста було ви-користаио показник HIP (иайменша icTOTHa р1зниця). У таблицях i на рисунках наведено середш арифметичш та ïx стандартш по-хибки.
Рис. 1. Первинний скриншг Тп5-мутант1в R. leguminosarum bv. trifolii за симбютичними властивостями i Eff++^eH0THn0M рослин:
А — рослини конюшини в умовах стерильного лабораторного дослвду; Б — визначення азот-фшсувально!' aKTHBHOCTi бульбочок конюшини (шкубащя рослин у середовишД 3Í bmíctom ацетилену 10% Bifl об'ему газово!' cyMirni)
Результата та обговорення
У результат! проведених експериментав з'ясовано, що штами бульбочкових бактерш R. leguminosarum bv. trifolii B-,(1000)NN, B1(100)E, B-,(-10)E, 348a, 346, C10, 8St i 500 вщр1зняються за чутлив1стю до стрептомь цину i канамщину (табл. 2). Найб1льш придатними рецитентами плазм1ди pSUP2021::Тп5 були бактерп штам1в 348а i 8St, чутлив1 до 25 мкг/мл канамщину i резистентш до 300 мг/мл стрептомщину. Ме-хашзм стшкоста бактерш полягае в ензима-тичнш шактивацп антибютика внаслщок адешлювання або фосфорилювання гщро-ксильно! групи в положены! 3-метилглюко-замшу i визначаеться трансм1сивним R-фак-тором. Зокрема, стрептомщин пригшчуе синтез протешу в клггит, у результат! пору-шуеться функщонування 30S-cy64acTHH рибосом, шдукуеться включения помилкових амшокислот до синтезованого полшептид-ного ланцюга [23]. Концентрацию антибюти-ка в середовишД вирощування, за яко! шль-KicTb бактер1альних колонш зменшувалась на 50% пор1вняно з ix шльшстю на середо-вишД без антибютишв, вважали мш1мальною пригшчувальною (МПК). За бактерюстатич-но1 дИ стрептомщин безповоротно з'еднуеть-ся з рибосомами та шактивуе ix, тому клгги-на перестае д1литись i розмножуватись [23]. Для штам1в R. leguminosarum bv. trifolii B1(1000)NN, 348a i 346 концентращя канамщину 25 мкг/мл була МПК, а 50 — бактерицидною лише для штам1в 348а i 8St. У бактер1альнш популяцп присутш окрем1 клггини, яш внаслщок випадкових мутацш вщр1зняються за властивостями вщ батьшв-СЬКИХ КЙТИН. BiflMiHHOCTi можуть виявля-тись на 6ioxiMi4HQMy, морфолопчному i куль-
туральному р1внях. Зазвичай бактер1альна популящя мае кйтини-мутанти, резистентш до менших концентрацш антибютика, шж МПК, але чутлив1 до больших. У результат! ступеневого вщбору кйтин ризобш, резисте-нтних до б1льшо! концентрацп Str пор1вняно з основною популящею, у штам1в 348а i 8St вЩбрали компетентн1 кйтини, резистентш до 800 мкг/мл Str, яш пойм використали як рецишенти плазмщи pSUP2021: :Tn5.
У результат! кон'югацп м1ж E. coli S17-1 (pSUP2021::Tn5) i штамом R. leguminosarum bv. trifolii 348a отримано 103 шсерцшш му-танти, резистентш до 200 мкг/мл канамщи-ну. У штаму 8St Тп5-мутантав одержати не вдалося. Частота виникнення Ктк-кл1тин дор1внювала 1,910-7 (табл. 3).
В умовах мшровегетацшного досл1ду симбютичний фенотип кожного мутанта ви-являли шокулящею насшня конюшини транспозоновим мутантом i спостереженням за ростом рослин та вщновленням ацетилену (рис. 1, А, Б). Щлеспрямовано 3i 103 проа-нал1зованих вобрано 11 Тп5-мутантав R. leguminosarum bv. trifolii, яш зумовлюва-ли позитивну реакщю (понад 10% в1д фенотипу вихщного штаму 348а) стосовно як росту рослин, так i вщновлення ацетилену.
За шокуляцп конюшини мутантами шль-KicTb бульбочок зб1льшилась на 12,7-118,2%, азотфшсувальна актившсть — на 13,7-85,8%, надземна маса рослин — на 20,6-40,3% пор1вняно з показниками рослин, шокульованих штамом-стандартом 348а (табл. 4). Одночасне збшьшення показнишв нодуляцп, азотфжсувально! активноста i ефективноста вщзначено тальки в окремих вар1антах дослщу. Нерщко рослини з активно фшсую-чими атмосферний азот бульбочками посту-
Таблиця 2.1нтенсившсть росту бульбочкових бактерш Rhizobium leguminosarum bv. trifolii на мшеральному синтетичному середовишд 79, збагаченому антибютиками
Штам Середови-ще 79 б/а BmIct антибютика у мшеральному живильному середовищ1 79, мкг/мл
Km Str
10 25 50 75 100 50 100 300 500 750 1000
B1(1000)NN + + + + + + + + + + + + - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
B1(-10)E + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - -
C-10 + + + + + + + + + + + + + + + - - + + + + + + + + + - - -
348а + + + + + + + + + + + - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
346 + + + + + + + + + + + + + + - - + + + + + + + + + - - -
8St + + + + + + + + + + - - - + + + + + + + + + + - - -
24GR + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
500 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - - - -
Примтка. 1нтенсивнк:ть росту бульбочкових бактерш: « + + + + » — на piBHi контролю; «+ + + » — дещо слабший; «+ + » — дуже слабкий; « + » — ледве поминий; «-» — ввдсутнш.
Таблиця 3. Tn5-MyTareHre3 бульбочкових бактерш R. leguminosarum bv. trifolii
з використанням штаму-донора
Штам-рецишент Штам-донор Чут-лив1сть до Km, мкг/мл Стшшсть до Str, мкг/мл t, год А В V Кшь- KiCTb KmR-му-тант1в
Розведення
природна набута вих1дне, 0 х, 7
R. leguminosarum bv. trifolii 348а E. coli S17-1 (pSUP2021::Tn5) 30 300 800 6 60,5±2,5 31,7±1,6 1,8910-7 103
R. leguminosarum bv. trifolii 8St E. coli S17-1 (pSUP2021::Tn5) 30 300 800 6 0 16,5±1,0 0 0
Прим1тка. t — час експозицп 3i штамом-донором, год; А — мльмсть KmR клмин на МДА+Km + Str; В — к1лькк:ть клиин на МДА+Str (загальна мльшсть ризобш); V — частота транспозицп (появи KmR-MyTaHTiB).
Таблиця 4. Симбштичш властивоста Tn5-MyTaHTiB штаму Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 348a (мшровегетацшний дослвд)
BapiaHT Кшьгасть бульбочок Азотфжсувальна актившсть Надземна маса рослини
шт./ рослиш % нмоль С2Н4 / (рослину-24год) % мг %
R. leguminosarum bv. trifolii 348a 5,5±0,3 100,0 165,42±12,40 100,0 38,83±1,62 100,0
T1k 6,2±0,4 112,7 188,03±20,15 113,7 50,50±5,40 130,0
T2k 7,9±0,3 143,6 291,80±17,20 176,4 52,00±2,95 133,9
T25 5,6±0,2 101,2 200,41 ±16,00 121,2 46,83±2,65 120,6
T28k 9,0±0,6 163,4 307,43±23,61 185,8 54,50±2,27 140,3
T29k 7,0±0,2 127,3 242,17±16,20 146,4 38,66±1,92 99,6
T38k 5,5±0,4 100,0 136,64±11,23 82,6 47,83±2,83 123,2
T40k 6,3±0,5 114,5 189,20±12,35 114,4 48,00±5,20 123,6
T42k 7,4±0,3 134,5 173,15±10,36 104,7 47,66±3,52 122,7
T53k 9,0±8,5 163,6 148,15±15,32 99,6 35,50±3,64 91,4
T86k 11,2±0,3 203,6 174,12±17,82 105,3 40,83±2,65 105,2
T72k 12,0±0,4 218,2 278,75±20,10 168,5 52,33±2,76 134,8
палися за надземного масою рослинам 1з мен-шою штенсившстю азотфшсацп. Зб1льшення шлькоста та маси кореневих бульбочок шод1 не супроводжувалося адекватным зростан-ням загально! азотфжсувально! активность Вщомо, що внаслщок застосування мутагенезу 1 пбридизаци до бульбочкових бактерш, кйтини (штами) з одночасним посиленням азотфжсувально! активноста й ефективноста виникають рщко, проте 1х можна отримати шляхом ступеневого вщбору [28].
В умовах вегетацшного доотду продов-жували вивчати властивоста 5 Тп5-мутант1в (1з 11 ввдбраних): Т2к, Т28к, Т29к, Т40к, Т72к R. \eguminosarum bv. ьг'/ми, що домь нували над вих1дним штамом 348а за симбштичиим фенотипом в умовах мжрове-гетацшного дослщу (рис. 2). Симбштичш по-казники макросистеми досл1джували в ди-намщ1 у першд основних фаз розвитку конюшини. Встаиовлено, що вже шд час фази кущшня формуеться симбштичний апарат, який штотно вщр1зняеться за штенсившстю
фжсацп азоту залежно вщ генотипу бульбочкових бактерш. Три мжросимбюнти — 348а, Т28к 1 Т72к - виявились однаковою м1рою в1рулентними 1 суттево домшували над реш-тою мутанйв за шлькштю шщшованих бульбочок на коренях рослин (рис. 3, А) упродовж фаз кущшня та бутошзацп конюшини. Однак, вже у фаз1 цвтння у рослин, шокульованих Тп5-мутантами Т2к, Т28к 1 Т72к, шльшсть симбштичних оргашв зб1ль-шилась в 1,4—1,7 раза (рис. 3, А) й штотно домшувала за масою пор1вняно 1з симбштич-иим фенотипом штаму 348а(рис. 3, Б).
Активш Тп5-мутанти R. \eguminosarum bv. впливали на переб1г асимшяцшних
процейв у симбштичних системах конюшини 1 таею чи шшою м1рою змшювали 1хню штенсивншть. Тп5-мутанти Т2к 1 Т28к пере-вищували за азотфжсувальною актившстю контроль в 1,5 раза у фаз1 бутошзацп1 в 2,3 1 2,8 раза вщповщно тд час початкового цвтння конюшини (табл. 4). Штрогеназна активишть кореневих бульбочок за участю
Рис. 2. Вплив шокуляцп бульбочковими бактер1ями на формування 1 функщонування симбютичного апарату та ршт вегетативно!' маси (А, Б) рослин конюшини (вегетацшний дослвд)
мутанта Т72к була б1льшою в 1,6 раза в раннш перюд функщонування симбютично! системи — у фаз1 кущшня 1 в 2,4 раза — у фаз1 початку цвтння конюшини пор1вняно з бульбочками, утвореними вих1дним шта-мом 348а. Упродовж усього перюду веге-таци рослин найб1льшою штенсившстю вщновлення характеризувалися симбю-тичш системи конюшини, утвореш за учас-тю Тп5-мутант1в R. leguminosarum Ьу. trifoШ Т28к таТ72к (табл. 5).
В умовах вегетацшного доотду перед-помвна шокулящя насшня конюшини трьо-ма мутантами — Т2к, Т28к 1 Т72к — забез-печувала зб1льшення зелено! маси на
29,6-41,8% (рис. 3, В), а маси корешв — в 1,4 1 1,7 раза (рис. 3, Д) пор1вняно з контрольными рослинами. Результаты проведе-них експериментав дають змогу зробити вис-новок про перевагу бактеризацп конюшини Тп5-мутантами Т28к 1 Т72к пор1вняно з ш-шими залученими для шокуляцп ри-зоб1ями, а також вих1дним штамом 348а.
За даними л1тератури, в перюд бутошза-цп-початку цвтння у зеленш май бобових трав, зокрема конюшини, синтезуеться знач-ний вмют сухо! речовини та нагромаджуеться максимальна шльшсть протешу. Очевидно, в цей перюд за оптимальных умов симбюзу досягають максимуму показники шлькоста та
й о
Ю М
13
о
ю о
А К
■ 348а
□ Т2к
□ Т28к
□ Т29к
□ Т40к
□ Т72к
»-П--.1
Кущшня
■ I
Бутошзащя , Початок цвтння
м
о
а 200
, ¡50
к о V
ю 500
>4
Ч
^ г
Ю 50
Я о а
■ 348а
□ Т2к ПТ28к ИТ29к
□ Т40к
■ Т72к
Кущшня
Бутошзащя Початок цвтння
м
в
1348а
П'Г29к
■ИтП
Кущшня Бутошзащя Початок цвтння Фаза розвитку рослин
Й 5
К 4
а з
д
й
-1-
п-
Початок цвтння
Кущшня Бутошзащя
Фаза розвитку рослин
Рис. 3. Динамжа наростання кшькосл (А), маси бульбочок (Б), надземно! маси (В) 1 маси корешв (Д) конюшини, шокульовано'1 Tn5-мyтaнтaми 1вдит1позагит bv. trifolii 348а (вегетацшний дослвд)
Таблиця 5. Азотфшсувальна актившсть i врожай cyxoi надземно'1 маси конюшини, шокульовано!' ТпБ-мутантами R. leguminosarum bv. trifolii
BapiaHT Азотфшсувальна актившсть, мкмоль C2H4 / (рослину • год) Урожай, г/посудину
кущшня бутошзащя початок цвтння I ykic II ykic сумарний %
Штам 348а 0,44±0,03 1,42±0,06 1,82±0,12 12,7 10,9 23,6 100
Tn5-mytahth штаму Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 348a
Т2к 0,24±0,03 2,19±0,19 4,20±0,34 14,3 12,2 26,6* 112,7
T28k 0,40±0,04 2,22±0,62 5,13±0,68 14,7 11,9 26,6* 112,7
T29k 0,08±0,01 0,85±0,06 2,53±0,18 11,7 10,9 22,5 95,2
T40k 0,17±0,01 1,62±0,17 2,96±0,27 12,8 10,8 23,6 99,6
T72k 0,70±0,10 1,82±0,15 4,42±0,41 14,3 13,7 27,9* 118,2
HIPo,05 1,4 1,0
Примтка. * — Р1зниця достов1рна пор1вняно з шокулящею конюшини штамом Rhizobium leguminosarum bv. trifolii 348a.
маси бульбочок, атакож азотфжсувально! ак-тивност1, що сприяе оптимальному синтезу протешу. Беручи це до уваги, ми провели два укоси зелено! маси конюшини: перший — у фаз1 початку цвтння, другий — у цш самш фаз1 теля вщновлення вегетативного росту надземних оргашв теля скошування. Результата облжу надземно! маси свщчать, що теля першого скошування вщростання вегетатив-них орган1в вщбуваеться значно повшьшше, а отже й меншим е урожай другого укосу конюшини . У тдсумку з рослин, шокульованих мутантами Т2к, Т28к i Т72к, за два укоси з1брали вщповщно на 12,3, 12,8 та 18,2% бшьше врожаю пов1тряно-сухо1 надземно! маси пор1вняно з рослинами, шокульованими штамом 348а (табл. 5), що вказуе на ефек-тивн1сть фуикщонуваиня симбютичио! систе-ми конюшина — Tn5-MyTaHTH R. leguminosarum bv. trifolii.
У зв'язку з тим, що HOBi активш Tn5-My-танти е цшиим селекцшно-генетичиим ма-тер1алом, постала иеобхщшсть молекулярного анал1зу 1хнього геному на наявшсть транспозона. Для дослщження мутантав ри-зобш конюшини застосували метод пол1ме-разно! ланцюгово! реакцп (ПЛР). Як маркер выбору Tn5-MyTaHTiB за транспозонового мутагенезу бульбочкових бактерш конюшини використовували ген стшкосй до ка-намщииу. Для контролю було взято штами E. coli S17-1(pSUP2021::Tn5) — позитивиий контроль та R. leguminosarum bv. trifolii 348а — негативний контроль.
Результата ПЛР свщчать, що вихщний штам-рецишент R. leguminosarum bv. trifolii 348а не мштить у геиом1 фрагмента ДНК гена стшкоста до каиамщииу транспозона Tn5 (рис. 4).
Водночас анал1з ПЛР показав наявшсть цього фрагмента транспозона завдовжки
51 7 иуклеотидиих пар у Tn5-мyтaнтiв бульбочкових бактерш конюшини Т2к 1 Т72к. Це свщчить про штеграцш в 1хнш геном иук-леотидио! послщовноста гена неомщинфосфо-траисферази, що зумовлюе стшшсть до кана-мщину, тобто вони дшсно е Tn5-мyтaнтaми.
Отже, унаслщок транспозонового мутагенезу штаму 348а та щлеспрямованого селективного выбору за шдвищеиими симбютичиими показниками отримано ви-сокоактивш Tn5-мyтaнти & 1вдит1позагит bv. 1г!ГоШ Т2к, Т28к 1 Т72к, яш е перспек-тивними за комплексом господарсько-цшних властивостей. У результат! шокуляцп конюшини цими Tn5-мyтaнтaми утворюеться б1льша маса кореневих бульбочок, шдви-щуеться штенсившсть азотфжсацп, поси-люеться вегетативний р1ст, зб1льшуеться урожайшсть надземно! маси рослин та син-тезуеться б1льше сухо! речовини пор1вняно з шокулящею рослин виробничим штамом 348а & 1вдит1повагит bv. 1г1^Ш.
М 1 2 3 К
Рис. 4. Електрофорез в 0,7%-му агарозному гел1 продукив ПЛР-ампл1ф1кац11 ДНК бульбочкових бактерш конюшини (1—3) та E. coli S17-1 (К) з використанням праймер1в до гена неомщинфосфотрансферази Тп5: 1 — вихщний штам 348а, TnS-мутанти штаму 348а: 2 — Т2к; 3 — Т72к; М — маркер молеку-лярно! маси
Л1ТЕРАТУРА
1. Коцъ С. Я., Михалтв Л. М. Ф1з1олопя сим-6io3y та азотне живлення люцерни. — К.: Логос, 2005. — 300 с.
2. Коцъ С. Я., Петерсон Н. В. Мшеральш еле-менти i добрива в живленш рослин. — К.: Логос, 2005. — 150 с.
3. Патика В. П., Коцъ С. Я., Волкогон В. В. та in. Б1олопчний азот / Шд ред. В. Т. Пати-ки. — К.: CBiT, 2003. — 424 с.
4. Коцъ С. Я. Роль б1олопчного азоту у тдви-щенш продуктивное^ мльськогосподарсь-ких рослин // Физиол. биохим. культ. раст. — 2001. — Т. 33, № 3. — С. 208-215.
5. Новичкова Н. С., Кузнецова Л. Г., Шевелева Е. В. и др. Рост и фотосинтез клевера в отсутствии связанного азота // Там же. — 1991. — Т. 23, № 2. — С. 130-137.
6. Вахитова Л. Ф., Валиахметова Ю. 3. Сим-биотическая фиксация азота клевером луговым на черноземах северной лесостепи Зауралья / Проблемы агр. сектора Южн. Урала и пути их решения. — Челябинск: ЧГАУ, 2006. — С. 139-143.
7. Патыка В. Ф., Толкачев Н. 3., Бутеина Ю. 3. Основные направления оптимизации сим-биотической азотфиксации в современном земледелии Украины // Физиол. биохим. культ. раст.—2005.—Т. 37, № 5. — С. 384-393.
8. АнтипчукА. Ф. Экологические аспекты селекции ризобий и повышение эффективности симбиоза // Там же. — 1994. — Т. 26, № 4. — С. 315-333.
9. Prevost D, Bromfieid E. S. P. Diversity of symbiotic rhizobia resident in Canadian soils // Can. J. Soil Sci. — 2003. — V. 83, N 3. — P. 311-319.
10. Simon 7.New Rhizobium ieguminosarum bv. trifoiii isolates: Collection, identification and screening of efficiency in symbiosis with clover // Plant Soil Envir. — 2006. — V. 52, N 3. — P. 105-110.
11. Гамолин А. А., Темпер Э. E. Характеристика мутантных форм Rhizobium japonicum / Науч.-тех. бюл. Всерос. НИИ сои. — 1984. — № 13-14. — С. 37-43.
12. Фёдоров С. Н. Получение мутантов клубеньковых бактерий люцерны с изменёнными симбиотическими свойствами под действием УФ-излучения: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Л., 1987. — 16 с.
13. Rhizobiaceae. Молекулярная биологиябак-терий, взаимодействующих с растениями / Под ред. Спайнка Г., Кондороши А., Хука-са П. — Рус. переводподред. ТихоновичаИ. А., Проворова Н. А. — СПб., 2002. — 567 с.
15. Онищук О. П., Курчак О. Н., Шарипова Л. А. и др. Анализ различных типов конкурентоспособности у Tn5-MyraHTOB клубеньковых бактерий люцерны (Sinorhizobium meiiioti) // Генетика. — 2001. — Т. 37, № 11. — С. 1266-1271.
16. Мандровська Н. М., Кругова О. Д., Коцъ С. Я. Ефектившсть симб1озу рослин гороху i3 транспозантами R. leguminosarum bv. viciae 2636 // BicH. XapKiB. нац. агр. ун-ту. Cepifl бюлопя. - 2007. - Вип. 1 (10). — С. 65-70.
17. KarrD. В., Rong-TiL., ReuhsB. L., EmerichD. W. Altered exopolysaccharides of Bradyrhizo-bium japonicum mutants correlate with impaired soybean lectm bmdmg, but not with effective nodule formats // Pla^a. — 2000. — V. 211. — P. 218-226.
18. Mills D. ^ansposon mutagenesis and its potencial for studying virulence genes in plant pathogens // Annu. Rev. Phytopathol. — 1985.- V. 23. — P. 297-320.
19. МалЬченкоС. M, ДаценкоВ. К., ВасилюкВ. M. Транспозоновий мутагенез штам1в Brady-rhizobiumjaponicum // Физиол. биохим. культ. раст. — 2007. — Т. 39, № 5. — С. 409-418.
20. Затовская Т. В., Шарыпова Л. А., Селиверстова Е. В., Симаров Б. В. Мутант Тг63 по гену tolC штамма CXM1-188 Sinorhizobium meliloti не способен к формированию эффективного симбиоза с люцерной // Генетика. — 2007. — Т. 43, № 3. — С. 323-332.
21. Воробей Н. А, Коцъ С. Я., МалЬченко С. М, Яким-чукР. А Дослвдження симбютичних систем coi, утворених за участю транспозантав Bradyrhi-zobium japonicum // Физиол. биохим. культ. раст. — 2006. — Т. 38, № 5. — С. 418-426.
22. Simon R., Priefer U., Puhler A. A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering transposon mutagenesis in gram-negative bacteria // Biotechnology. — 1983. — V. 1. — P. 784-791.
23. Ланчини Д., Паренти Ф. Антиб1отики / Пер. с англ. Ю. В. Дудника. — М.: Мир, 1985. — 265 c.
24. Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. — Cold Spring Harbor Lab. Press, 1998.
25. Simon R., OConnel M., Labes M., Puhler A. Plasmid vectors for the genetic analysis and manipulations of Rhizobia and other gramnegative bacteria // Meth. Enzymol. / Academic Press Inc. — 1986. — V. 118. — P. 640-659.
26. Chachaty E., Saulnier P. Isolation chromosomal DNA from bacteria / Nucleic Acid Protocols Handbook (Edited by R. Rap-ley). — Humana Press Inc., ^towa NJ, 2000.— P. 29-32.
27. Reznikoff W. S. ^ansposon Тп5 // Annu. Rev. Genet. — 2008. — V. 42. — P. 151-158.
28. Федоров С. H, Фокина И. Г., Симаров Б. В. Оценка симбиотических свойств клубеньковых бактерий люцерны в лабораторных условиях // С.-х. биол. — 1986. — № 1. — С. 112-118.
29. Гродзинский А. М., Гродзинский Д. М. Краткий справочник по физиологии растений. — К.: Наук. думка, 1964. — 388 с.
30. КрикунецъВ. М. Ацетиленвщновний метод у дослщженнях з ф1з1ологп бобово-ри-зоб1ального симбшзу // Физиол. биохим. культ. раст. — 1993. — Т. 25, № 5. — С. 419-430.
31. Hardy R. W. F, Holsten R. D, Jackson E. K, Burns R. C. The acetylene-ethylene assay for
БИОТЕХНОЛОГИЯ СОЗДАНИЯ ЭФФЕКТИВНЫХ TN5 -МУТАНТОВ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ КЛЕВЕРА Rhizobium leguminosarum bv. trifolii
H. А. Воробей?
B. M. Заец2
C. Я. Коць1
1 Институт физиологии растений и генетики HAH Украины, Киев 2Институт молекулярной биологии и генетики HAH Украины, Киев
E-mail: [email protected]
С помощью плазмидного вектора pSUP2021 ::Tn5 осуществлен мутагенез штамма 348а Rhizobium leguminosarum bv. trifolii. Частота образования Ктк-мутантов при перенесении этого вектора из Escherichia coli в Rhizobium составляла 1,9-10-7. Инсерционная природа полученных мутантов установлена при использовании полимеразной цепной реакции. За симбиотическими показателями и Eff++^eH0THn0M растений клевера в условиях микровегетационного и вегетационного опытов проведен скрининг Тп5-мутантов и отобраны ризобии с повышенным синтезом нитроге-назы и хозяйственно-ценными свойствами. Тп5-мутанты Т2к, Т28к, Т72к существенно превосходили остальные ризобии за нодуляци-онной активностью. В фазе цветения клевера на корнях растений при их участии образовалось в 1,4—1,7 раза больше клубеньков, доминирующих за массой. При усилении ризогене-за надземная масса растений увеличилась на 29,6—41,8%. Интенсификация физиологических процессов у клевера обеспечивалась увеличением нитрогеназной активности симбио-тического аппарата, которая в фазе цветения превосходила в среднем в 2,5 раза показатели растений, инокулированных исходным (роди-тельським) штаммом 348а. Полученные данные указывают на возможность создания высокоэффективных симбиотических систем клевер — Тп5-мутанты Rhizobium leguminosarum bv. trifolii
Ключевые слова: транспозоновый мутагенез, Тп5-мутанты, полимеразная цепная реакция, клевер, симбиоз, азотфиксирующая активность, эффективность.
N2-fixation: Laboratory and field evaluation // Plant Physiol. — 1968. — V. 43, N 8. — P. 1185-1207.
32. Доспехов Б. А. Методика полевого опыта. — М.: Агропромиздат, 1985. — 352 с.
BIOTECHNOLOGY OF EFFECTIVE TN5-MUTANTS CREATION OF CLOVER NODULE BACTERIA Rhizobium leguminosarum bv. trifolii
N. A. Vorobey' V. M. Zayets2 S. Ya. KotS
1Institute of Plant Physiology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: [email protected]
Plazmid vector pSUP2021::Tn5 for transpo-son mutagenesis in Rhizobium leguminosarum bv. trifolii strain 348a was used. The frequency of KmR-mutants formation after transfer this vector from Escherichia coli to Rhizobium was 1.9 • 107. The presence of Tn5 in mutants DNA was verified using polymerase chain reaction. By the symbiotic traits and Eff+-phenotype of clover plants the Tn5-mutants strains were screened in vegetative and field conditions and rhizobia with increased synthesis of nitrogenase and economical valuable properties were selected. Tn5-mutants T2k, T28k, T72k were significantly higher than other rhizobia by the nodula-tion activity. In the phase of clover flowering on roots of plants through their involvement it was formed 1.4—1.7 times as much nodules which dominated by mass. Aboveground plant weight increased by 29,6—41,8% at strengthening ryzo-henezis. Intensification of physiological processes in clover ensured by increase of nitrogenase activity of symbiotic system which in the early flowering phase exceeded at an average of 2.5 times the results of plants inoculated by the original (parent) strain 348a. Obtained data indicate the possibility of creating highly efficient symbiotic systems clover — Tn5-mutants Rhizobium leguminosarum bv. trifolii.
Key words: transposone mutagenesis, Tn5-mutants, polymerase chain reaction, clover, symbiosis, nitrogen-fixing activity, efficiency.
