CC BY
9
Вестник Пермского университета. Серия Биология. 2022. Вып. 1. С. 35-41. Bulletin of Perm University. Biology. 2022. Iss. 1. P. 35-41.
МИКРОБИОЛОГИЯ
Научная статья УДК 579.22
doi: 10.17072/1994-9952-2022-1-35-41
Real-time мониторинг физиологических параметров для изучения раннего ответа бактерий Escherichia coli
на пероксидный стресс
А. В. Тюленев1Н, Г. В. Смирнова2, А. О. Габова3, Г. А. Триандафилова4, О. Н. Октябрьский5
1 2 4 5 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН - филиал ПФИЦ УрО РАН, Пермь, Россия 3 Пермский национальный исследовательский политехнический университет, Пермь, Россия Автор, ответственный за переписку: Алексей Валерьевич Тюленев, Leksey333@yandex.ru
Аннотация. Исследовался ответ аэробно растущих культур Escherichia coli на пероксидный стресс с применением синхронного мониторинга в реальном времени таких параметров, как pO2 (парциальное давление кислорода), рН, Eh (редокс-потенциал культуры), экстраклеточные уровни ионов K+ и S2-, в комбинации с традиционными физиолого-биохимическими и генетическими методами. Установлено, что при раннем ответе на пероксидный стресс наблюдается резкое повышение pO2 в среде, вызванное деструкцией H2O2 эндогенными каталазами. При действии 100 цМ H2O2 обратимое падение скорости роста сопровождалось возрастанием экстра- и внутриклеточного глутатиона и кратковременным увеличением продукции сульфида. Обработка высокой дозой H2O2 (10 mM) приводила к ингибированию роста и снижению колониеобразующей способности (CFU), наиболее выраженных у мутантов по синтезу глутатиона. Одновременно у 8% клеток снижался мембранный потенциал, наблюдался выход части калия в среду, и возрастала экспрессия гена sulA, входящего в состав SOS-регулона. В совокупности, применение комплексного подхода позволило выявить тесную связь между ростовыми параметрами (удельная скорость роста и выживаемость), дыхательной активностью, продукцией сульфида, а также способностью бактерий к поддержанию мембранного потенциала и градиента ионов калия.
Ключевые слова: физиологические (интегральные) параметры культуры, электрохимические сенсоры, мониторинг в реальном времени, бактерии Escherichia coli, пероксидный стресс
Для цитирования: Real-time мониторинг физиологических параметров для изучения раннего ответа бактерий Escherichia coli на пероксидный стресс / А. В. Тюленев, Г. В. Смирнова, А. О. Габова, Г. А. Триандафилова, О. Н. Октябрьский // Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2022. Вып. 1. С. 35-41. http://dx.doi.org/10.17072/1994-9952-2022-1-35-41.
Благодарности: работа выполнена в рамках государственного задания, номер госрегистрации темы: АААА-А19-119112290009-1, грантов президента РФ МК-420.2020.4, РФФИ-Урал 19-44-590009, РФФИ 20-34-90016.
MICROBIOLOGY
Original article
Real-time monitoring of physiological parameters in the study of Escherichia coli early response to peroxide stress
A. V. Tyulenev1H, G. V. Smirnova2, A. O. Gabova3, G. A. Triandafilova4,
0. N. Oktyabrsky5
1, 2, 4, 5 Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch of RAS, Perm, Russia 3 Perm National Research Polytechnic University, Perm, Russia
Corresponding author: Aleksey V. Tyulenev, Leksey333@yandex.ru
Abstract. The response of aerobically growing Escherichia coli cultures to peroxide stress was studied using synchronous real-time monitoring of parameters pO2 (oxygen partial pressure), pH, Eh (redox potential of the culture), extracellular levels of K+ and S2-, in combination with traditional physiological, biochemical and genetic methods. A sharp increase in pO2 level in the medium caused by the destruction of H2O2 by endogenous cat-alases was observed in the early response to peroxide stress. The addition of 100 цМ H2O2 provoked a reversible
© Тюленев А. В., Смирнова Г. В., Габова А. О., Триандафилова Г. А., Октябрьский О. Н., 2022
decrease in the specific growth rate, accompanied by an increase of extra- and intracellular glutathione and a short-term increase in sulfide production. Treatment with a high dose of H2O2 (10 mM) led to growth inhibition and a CFU loss, most pronounced in glutathione synthesis mutants. Simultaneously, in 8% of cells, the membrane potential decreased, a part of potassium was released into the medium, and the expression of the sulA gene, which is part of the SOS-regulon, increased. Application of an integrated approach to the study of stress revealed a close relationship between growth parameters (specific growth rate and survival), respiratory activity, sulfide production, and the ability of E. coli cells to maintain the membrane potential and K+ gradient.
Keywords: physiological parameters, integral parameters of bacterial culture, electrochemical sensors, realtime monitoring, Escherichia coli, peroxide stress
For citacion: Tyulenev A. V., Smirnova G. V., Gabova A. O., Triandafilova G. A., Oktyabrsky O. N. [Realtime monitoring of physiological parameters in the study of Escherichia coli early response to peroxide stress]. Bulletin of Perm University. Biology. Iss. 1 (2022): pp. 35-41. (In Russ.). http://dx.doi.org/10.17072/1994-9952-2022-1-35-41.
Acknowledgments: the research was supported by the state assignment АААА-А19-119112290009-1, and by the grants MK-420.2020.4, Russian Foundation of Basic Research RFBR-Ural 19-44-590009, RFBR-20-34-90016.
Введение
Окислительный стресс, как неизбежное следствие аэробной жизни, является результатом воздействия активных форм кислорода (АФК) на живые организмы. АФК оказывают токсическое и мутагенное действие на все виды клеток вследствие окислительного повреждения мембранных липидов, белков и ДНК. В ходе эволюции бактерии, как и другие организмы, выработали защитные механизмы, позволяющие адаптироваться к различным типам окислительного стресса, одним из которых является пероксидный стресс. При действии на бактерии Escherichia coli пероксида водорода, адаптивный ответ связан, в первую очередь, с индуцированным синтезом большого числа белков, включая каталазы. Синтез этих белков кодируется генами, часть которых находится под контролем регулонов oxyR и SOS-ответа.
Окислительный стресс может быть следствием прямого действия экзогенных АФК, а также побочным результатом метаболической активности самих бактерий. Известно, что одним из основных внутриклеточных источников АФК является дыхательная цепь. В нормальных условиях эти АФК, благодаря активности компонентов антиоксидантной защиты, присутствуют в безопасных количествах. Однако при различных стрессовых ситуациях АФК могут накапливаться в высоких концентрациях, создающих потенциальную угрозу для выживаемости бактериальной клетки. Следует отметить, что, хотя повышение АФК при стрессах показано во многих работах, вопрос об их вкладе в стресс-индуцируемые повреждения клеточных структур остается открытым, что, во многом, связано с наличием противоречивых данных [Zhao et al., 2015]. Источниками расхождений в результатах могут быть такие факторы, как использование разных питательных сред или условий культивирования, способов отбора биоматериала, а также отсутствие контроля за изменениями таких физико-химических параметров, как условия аэрации, редокс-состояние (Eh) культуры, рН и ионный баланс. Одним из способов решения этой проблемы может быть применение системы непрерывной и синхронной регистрации указанных параметров в растущих культурах бактерий в комбинации с традиционными физиолого-биохимическим методами. Это позволяет отследить изменения параметров, происходящие в течение нескольких секунд, без отбора биоматериала - непосредственно в бактериальной культуре, что приближает получаемые данные к условиям in vivo. Ранее этот подход применялся нами при изучении ответа растущих E. coli на стрессы, индуцируемые голоданием по питательным субстратам и антибиотиками [Smirnova et al., 2017, 2018, 2019; Tyulenev et al., 2018].
Цель исследования - изучить ранний ответ аэробно растущих штаммов E. coli на пероксидный стресс с помощью системы мониторинга физиологических параметров в реальном времени на основе электрохимических сенсоров, в комплексе с традиционными физиолого-биохимическими и генетическими методами.
Материалы и методы исследования
Объект исследований. Грамотрицательные энтеробактерии Escherichia coli BW25113 (родительский тип, wt), JW2663 (AgshA), дефектный по синтезу глутатиона (GSH) из коллекции Keio (Coli Genetic Stock Center) [Baba et al., 2006]. NM3011, несущий слияние промотора гена sulA со структурным геном lacZ, сконструирован в лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов (ЛФГМ) на основе BW25113. Бактерии культивировали на минимальной среде М9 [Miller, 1972] с добавлением 0,15% глюкозы в аэробных условиях при 37°C в термостатируемом орбитальном шейкере при 150 об/мин в колбах на 250 мл.
Под ранним ответом («early response») мы указываем период от момента индукции стресса до некоторой стабилизации исследуемых параметров, продолжительностью около 120 мин. Исследование проводили в середине экспоненциальной фазы роста, в диапазоне ODeoo 0.4-0.8 и pO2 60-40%.
Ростовые характеристики. Оптическую плотность культуры определяли на фотометре КФК-3 («ЗОМЗ», Россия) при длине волны 600 нм. Удельную скорость роста (ц) рассчитывали по формуле
_ In О Д6РР СдЗ - te ОД sop (О
г*"
где OD6oo(t2) и OD6oo(ti) - оптическая плотность культуры во время t2 и ti. Определение способности к образованию колоний (КОЕ, CFU) выполняли общепринятым методом, подсчитывая число колоний, выросших на чашках Петри с твердым LB-агаром через 24 ч. после высева на агар. Образцы для определения КОЕ и других анализов отбирали без остановки перемешивания культуральной жидкости.
Real-time мониторинг с применением электрохимических сенсоров. Регистрацию изменений физиологических параметров растущих культур E. coli проводили с помощью установленных непосредственно в колбах электрохимических сенсоров. Информация, поступающая от отдельных блоков регистрации, непрерывно и синхронно обрабатывалась в режиме реального времени с применением единого аппаратно-программного комплекса. Парциальное давление кислорода (pO2) в среде определяли полярографическим методом с помощью электрода Кларка InPro 6800 (Mettler Toledo) на модифицированном контроллере BioFlo 110 (New Brunswick Scientific Co., USA). Чувствительную регистрацию pH осуществляли комбинированным рН-электродом ЭСК-10301 («Измерительные Технологии», РФ) на том же контроллере. Концентрацию экстраклеточного сульфид-иона определяли, применяя сульфид-специфичный ионоселективный сенсор XC-S2--001 (Sensor Systems Company, РФ) с рабочим диапазоном pH 612. Редокс-потенциал (Eh) регистрировали платиновым электродом ЭРП-105 («Измерительные Технологии», РФ), уровень экстраклеточных ионов калия (K+) регистрировали K+-селективным сенсором ELIS-121K («Измерительные Технологии», РФ). Потенциометрические сигналы с указанных электродов обрабатывались цифровыми pX-метрами cpX-2 (ИБП, Пущино, РФ). Синхронная обработка первичных данных, получаемых от системы сенсоров, осуществлялась по протоколам RS-232 и Modbus, с дальнейшей визуализацией на программном комплексе Advantech OPC Server v3.o [Tyulenev et al., 2oi8].
Определение изменений мембранного потенциала (МП). Применяли Лу-чувствительный флуоресцентный краситель DiBAC4(3), бис-(1,3-дибутилбарбитуратовая кислота)-триметиноксонол). Образцы клеток, иммобилизованные на агаризованой питательной среде, исследовали на флуоресцентном микроскопе Leica DM2000 (фильтр-система I3, возбуждение 450-490 нм, эмиссия 515 нм). Общее количество клеток, в том числе флюоресцирующих, подсчитывалось на определенной площади и обрабатывалось с помощью программных пакетов Leica Application Suite (v.3.4.0) и ImageJ.
Определение концентрации внутри- и экстраклеточного глутатиона (GSH). Внеклеточный глута-тион определяли в образцах объемом 2.5 мл, отобранных методом быстрой фильтрации через фильтры с размером пор 0.45 мкм. Пробы для определения внутриклеточного глутатиона отбирали путем центрифугирования (8000*g в течение 5 мин). Концентрацию GSH измеряли с использованием высокочувствительного и высокоспецифичного метода рециркуляции DTNB-глутатионредуктазы [Tietze, 1969], модифицированного, как описано ранее [Smirnova et al., 2oi2].
Определение активности ß -галактозидазы. Активность ß-галактозидазы в клетках E. coli, несущих слияние sulA::lacZ, определяли по методу Миллера [Miller, 1972].
Статистический анализ данных. Каждый результат указывается как среднее значение не менее трех независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего (SEM). Достоверность разницы анализировали с помощью t-критерия Стьюдента. Значение P, равное 0.05, использовалось в качестве порога статистической значимости. Результаты анализировали с помощью пакета программ Statistica 6 (StatSoft Inc. 2001). Профили непрерывной записи представлены в виде типичных кривых из серии экспериментов.
Результаты и их обсуждение
Ответ растущих бактерий E coli на действие пероксида водорода прослеживался в течение 2-3 ч. от начала обработки культуры оксидантом.
В течение первых 90 мин. в не обработанных оксидантом культурах (контроль) удельная скорость роста (ц) составляла 0.65±0.01 у родительского штамма BW25113 и 0.67±0.02 - у штамма JW2663 (AgshA), дефицитного по синтезу глутатиона (GSH). Последующее снижение ц до 0.58±0.01 и 0.53±0.03 час-1, соответственно, совпадало с моментом исчерпания растворенного кислорода в среде у обоих штаммов.
Обработка растущих E. coli микромолярными дозами (100 цМ) H2O2 приводила к быстрому и обратимому снижению скорости роста в 1.5 раза (до 0.42±0.03 час-1) у обоих испытуемых штаммов. Восстанов-
ление ц до значений, наблюдаемых в необработанных оксидантом культурах, наступало через 30 мин. у родительского штамма и через 45 мин. - у мутантов AgshA. Добавление 2 mM H2O2 вызывало снижение ц в 5 раз (до 0.13±0.02) у BW25113 и в 15 раз (до 0.04±0.006) у AgshA. У обоих штаммов полное восстановление скорости роста отмечалось к 100-й мин. Добавление 100 цМ и 2 mM H2O2 пероксида водорода не оказывало значительного воздействия на выживаемость (CFU) обоих штаммов по сравнению с контролем. Действие 10 mM H2O2 вызывало полную остановку роста у обоих штаммов. Снижение оптической плотности культуры указывало на возможную гибель клеток. Действительно, через 180 мин. после воздействия данной концентрацией у родителя отмечалось снижение выживаемости (CFU) в 18 раз, тогда как у мутантов AgshA - на 4 порядка (в 9 550 раза) в сравнении с условиями без обработок (контролем).
Внесение пероксида водорода в среду, не содержащую клеток, не вызывало значительного отклонения от базового уровня pO2 (100%). Однако после добавления каталазы (50 U/ml) в среду с 10 mM H2O2, в результате ее ферментативной деструкции, уровень растворенного O2 в среде резко повышался более чем в 4 раза. По мере снижения концентрации оксиданта количество растворенного кислорода в среде возвращалось к базовому значению.
В культуре Е. coli, несмотря на интенсивное перемешивание среды, дыхательная активность растущих клеток приводила к постепенному снижению уровня растворенного O2 до нуля (рис. 1). Добавление 100 цМ H2O2 вызывало кратковременное увеличение pO2 на 20% у родительского штамма и на 30% - у AgshA, что указывало на ингибирование дыхательной активности клеток. Это подтверждается результатами измерения pO2 в бесклеточной среде с добавление каталазы. У обоих штаммов добавление 2 mM H2O2 вызывало преходящее повышение pO2 в 5.6 раза (с 50 до 280%), с последующим снижением до базового уровня, что отражено на рис. 1 в виде кривой непрерывной регистрации этого параметра в реальном времени. В этих условиях у мутанта AgshA ингибирование дыхания было выражено в большей степени, чем у родительского штамма. У обоих штаммов обработка растущих культур 10 mM H2O2 приводила к полному ингибиро-ванию дыхания.
Известно, что рост E. coli на минимальных средах с глюкозой сопровождается закислением среды вследствие накопления продуктов неполного окисления глюкозы. Степень снижения pH культуральной среды может косвенно указывать на интенсивность углеводного метаболизма и применяться как один из интегральных показателей физиологического состояния культуры. В наших условиях при нормальном росте у обоих штаммов регистрировалось постепенное снижение pH среды на 0.19 единиц (с 6.99 до 6.8). При росте в присутствии 100 цМ H2O2 регистрировалось снижение рН среды у родительского штамма и мутанта AgshA на 0.25 и 0.27 единиц, соответственно. При обработке 10 mM H2O2 значение pH среды оставалось неизменным в течение всего периода наблюдения, что является следствием ингибирования роста и, соответственно, метаболизма глюкозы.
Ранее было показано, что при некоторых стрессах, сопровождаемых быстрой остановкой роста E. coli, растущих аэробно на минеральных средах, наблюдаются скачки редокс-потенциала (Eh) в область отрицательных значений [Oktyabrskii, Smirnova, 2012]. Показано, что этот скачок сопряжен с обратимым увеличением уровня сульфида или цистеина в культуральной среде [Tyulenev et al., 2018]. Выброс H2S клетками связан с поддержанием гомеостаза цистеина в стрессовых условиях как часть защитного механизма E. coli от эндогенного окислительного стресса и может рассматриваться в качестве еще одного параметра физиологического состояния культуры [Smirnova et al., 2019].
В процессе роста обоих штаммов E. coli в отсутствие окислительного стресса Eh среды постепенно снижался от +190 мВ до -350 мВ. Переход Eh в область отрицательных значений совпадал с моментом полного исчерпания кислорода. В этих условиях уровень сульфида в среде поддерживался на низком уровне. Внесение 100 цМ H2O2 в растущую культуру вызывало быстрое обратимое падение потенциала сульфид-специфичного сенсора (pS2-), что указывает на усиление продукции H2S клетками. Через 2 мин. после добавления H2O2 в культуру родительского штамма концентрация сульфида в среде составляла
Рис. 1. Изменение парциального давления кислорода в среде (dO2) и удельной скорости роста (ц) при раннем ответе бактерий E. coli BW25113 на добавление 2 mM H2O2. Стрелкой обозначено время индукции стресса [Changes in the partial pressure of oxygen in the medium (dO2) and specific growth rate (ц) during the early response of E. coli BW25113 to the addition of 2 mM H2O2. The arrow indicates the stress-induction time]
13.8±0.12 nM. Повышенная концентрация сульфида в среде сохранялась в течение 8 мин. У мутантов AgshA продукция сульфида начиналась сразу после индукции окислительного стресса и длилась в течение 10 мин. Максимальная концентрация сульфида в среде у AgshA была в 4 раза выше (58.8±5 nM), чем в культуре родительского штамма. При действии 2 mM H2O2 обратимая аккумуляция экстраклеточного сульфида достигала 380±41 nM в клетках родительского штамма и 701±70 пМ - в культуре AgshA (рис. 2). Обработка 10 mM пероксида не вызывала значительных изменений продукции сульфида у обоих штаммов. Следует отметить, что наблюдается соответствие между изменениями Eh, концентрации экстраклеточного сульфида и pO2 в среде на раннем этапе ответа на пероксидный стресс.
Рост Е. coli в отсутствие окислительного стресса сопровождался непрерывным поглощением из среды ионов калия в количестве, пропорциональном числу клеток, о чем свидетельствовало постепенное снижение потенциала К+-специфичного электрода. Добавление 100 цМ H2O2 не влияло на накопление калия у родительского штамма, а у мутантов AgshA вызывало кратковременное торможение в течение 3 мин. Обработка 2 mM пероксида водорода приводила к значительному ингибирова-нию входа K+, длившемуся 10 мин. у родительского штамма, и 45 мин. - у AgshA. Следует отметить, что при данной концентрации окси-данта оба штамма сохраняли способность к удержанию калия. После добавления 10 mM H2O2 полное ингибирование роста и снижение CFU у обоих штаммов сопровождалось утратой части внутриклеточного калия. В нашей работе наблюдение за изменениями мембранного потенциала (МП) в растущей культуре оценивали с помощью флуоресцентного проникающего красителя DiBAC4(3). Повышение доли флуоресцирующих клеток соответствует снижению МП. В нормальных условиях количество окрашенных DiBAC4(3) клеток не превышало 1%. При действии 2 mМ H2O2 отмечено незначительное увеличение доли флюоресцирующих бактерий не более чем у 3% клеток. Существенное снижение МП наблюдалось только при обработке 10 mM H2O2, о чем свидетельствует увеличение доли флюоресцирующих клеток до 8±2%.
Ранее было обнаружено, что аэробно-растущие культуры E. coli содержат микромолярные количества глутатиона [Owens, Hartman, 1986]. В нормальных условиях у аэробно растущих E. coli на среде M9 с сульфатом, уровень экстраклеточного (GSHout) и внутриклеточного (GSHm) глутатиона находится в динамическом равновесии. При различных стрессах наблюдаются обратимые изменения соотношения GSHout/GSHin. Также известно, что присутствие глутатиона в среде и его изменения при стрессах связаны с циркуляцией глутатиона между цитоплазмой клеток и средой [Smirnova et al., 2012].
В наших условиях по мере накопления биомассы наблюдалось постепенное накопление внутриклеточного GSH и некоторое его снижение в среде. При действии 100 цМ перекиси водорода на E. coli BW25113, количество экстраклеточного глутатиона в течение 15-30 мин. возрастало в 1.5 раза, после чего постепенно снижалось до базового уровня. При обработке клеток 1 mM H2O2, также отмечалось повышение уровня GSHout в 1.8 раза, с максимумом на 45-60 мин. после индукции стресса, после чего происходило снижение до базового значения. Интересно, что в этих же условиях, уровень GSHin, напротив, возрастал в 2.1 раза в первые 15 мин., а затем поддерживался на постоянном уровне до конца эксперимента. Таким образом, при окислительном стрессе, вызванным действием H2O2, наблюдается усиление как экспорта глутатиона в среду, так и его аккумуляции в цитоплазме.
Известно, что при воздействии на бактерии E. coli пероксидом водорода адаптивный ответ связан с экспрессией SOS-регулона. Ген sulA является его частью и индуцируется при повреждении ДНК. В контрольных условиях, у E. coli NM3011, несущих слияние sulA::lacZ, экспрессия sulA находилась на постоянном уровне 170.2±9.5 ед. Миллера. Обработка 100 цМ и 1 mM H2O2 растущих клеток повышала экспрессию sulA в 1.3 и 4 раза, соответственно, по сравнению с базовым значением. Следует отметить, что снижение экспрессии sulA по времени совпадало со снижением уровня экстраклеточного глутатиона, возобновлением поглощения калия и скорости роста, что может указывать на адаптацию и восстановление нормальной жизнедеятельности клеток после воздействия данной концентрации пероксида водорода.
В настоящей работе, с использованием электрохимических сенсоров, был осуществлен комплексный real-time мониторинг важных параметров растущих культур E. coli, подвергнутых пероксидному стрессу:
900
аоо
ЛТиОй^Лл ügihi + lOO^nJ WT *ïmh/l ûgbhA+imM
Рис. 2. Продукция сульфида штаммами E. coli BW25113 (wt) и JW2663 (AgshA) после обработки 100 цМ и 2 mM H2O2
[Sulfide production of E. coli BW25113 (WT) and JW2663 (AgshA) strains after treatment with 100 цМ and 2 mM H2O2]
дыхательной активности, редокс-потенциала культуры, продукции сульфида водорода и изменения уровня экстраклеточных ионов K+. Измерения этих параметров осуществляли непрерывно в растущих культурах. Одновременно использовались традиционные микробиологические методы, предусматривающие отбор проб для определения ростовых характеристик, уровней GSH и экспрессии гена sulA.
Разработанная нами система непрерывного синхронного мониторинга позволила проследить изменения параметров, происходящие в течение нескольких секунд без отбора биоматериала, непосредственно в бактериальной культуре, что важно при исследовании быстрого ответа на пероксидный стресс. В совокупности, применение комплексного подхода позволило выявить тесную связь между такими физиологическими параметрами, как удельная скорость роста, дыхательная активность, продукция сульфида и динамика pH, с одной стороны, и способностью бактерий к поддержанию мембранного потенциала, градиента ионов калия и выживаемости, с другой.
Показано, что микромолярные количества пероксида водорода, не влияя на выживаемость как родителя, так и мутантов по синтезу глутатиона, способны вызывать кратковременное снижение скорости роста и дыхательной активности, сопровождаемые продукцией сульфида. Аналогичный феномен был ранее обнаружен при других стрессах [Smirnova et al., 2017, 2018, 2019]. Обработка 10 mM H2O2 оказывала острый токсичный эффект, приводя к полному ингибированию дыхательной активности, необратимой остановке роста и снижению CFU. Показано, что внесение высоких концентраций H2O2 может приводить к значительному изменению содержания кислорода в культуре, что, вероятно, является дополнительным стрессовым фактором на раннем этапе развития окислительного стресса.
Одновременно показано, что трипептид глутатион может выполнять важную роль в защите клеток от окислительного стресса, о чем свидетельствует снижение выживаемости мутанта AgshA на 4 порядка по сравнению с родительским штаммом, а также повышенный уровень внутриклеточного и наружного GSH в условиях окислительного стресса. Повышенная продукция эндогенного сульфида мутантами AgshA позволяет предположить, что эту роль глутатион может осуществлять, участвуя в поддержании гомеостаза цистеина. В целом, штамм JW2663, лишенный способности синтезировать глутатион, по всем исследуемым параметрам оказался более восприимчивым к действию всех испытуемых концентраций H2O2.
Заключение
Real-time мониторинг раннего ответа аэробно растущих культур E. coli на пероксидный стресс выявил тесную связь между изменениями таких параметров, как удельная скорость роста, выживаемость, дыхательная активность и pH, с одной стороны, и продукция сульфида, мембранный потенциал и градиент K+, с другой. Комбинирование традиционных физиолого-биохимических методов и электрохимических сенсоров позволило выявить новые аспекты адаптации E. coli к пероксидному стрессу.
Список источников
1. Baba T. et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection // Mol. Syst. Biol. 2006. Vol. 2. P. 1-11. DOI:10.1038/msb4100050
2. Miller J.H. Experiments in molecular genetics // Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1972. 466 p.
3. Oktyabrskii O.N., Smirnova G.V. Redox potential changes in bacterial cultures under stress conditions // Microbiology (Moscow). 2012. Vol. 81, № 2. P. 131-142. DOI:10.1134/s0026261712020099
4. Owens R.A., Hartman P.E. Export of glutathione by some widely used Salmonella typhimurium and Escherichia coli strains // J. Bacteriol. 1986. Vol. 168. P. 109-114. DOI:10.1128/jb.168.1.109-114.1986
5. Smirnova G.V. et al. Transmembrane glutathione cycling in growing Escherichia coli cells // Microbiol. Res. 2012. Vol. 167. P. 166-172. DOI:10.1016/j.micres.2011.05.005
6. Smirnova G.V. et al. Ciprofloxacin provokes SOS-dependent changes in respiration and membrane potential and causes alterations in redox status of Escherichia coli. // Res. Microbiol. 2017. Vol. 168. P. 64-73. DOI:10.1016/j.resmic.2016.07.008.
7. Smirnova G.V. et al. The sharp phase of respiratory inhibition during amino acid starvation in Escherichia coli is RelA -dependent and associated with the regulation of ATP synthase activity. // Res. Microbiol. 2018. Vol. 169. P. 157-165. DOI:10.1016/j.resmic.2018.02.003
8. Smirnova G.V. et al. Cysteine homeostasis under inhibition of protein synthesis in Escherichia coli cells. // Amino Acids. 2019. Vol. 51. P. 1577-1592. DOI:10.1007/s00726-019-02795-2
9. Tietze F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues // Anal. Biochem. 1969. Vol. 27. P. 502-522. DOI: 10.1016/0003-2697(69)90064-5
10. Tyulenev A.V. et al. The role of sulfides in stress-induced changes of Eh in Escherichia coli cultures. // Bioelectrochemistry. 2018. Vol. 121. P. 11-17. DOI: 10.1016/j.bioelechem.2017.12.012
11. Zhao X. et al. Moving forward with reactive oxygen species involvement in antimicrobial lethality. // J. Antimicrob. Chemother. 2015. Vol. 70. P. 639-642. DOI:10.1093/jac/dku463
References
1. Baba T., Ara T., Hasegawa M., Takai Yu., Okumura Yo., Baba M., Datsenko K.A., Tomita M., Wanner B. L., Mori H. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. V. 2 (2006): Epub. 2006 Feb 21. DOI:10.1038/msb4100050
2. Miller J.H. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1972): p. 466.
3. Oktyabrskii O. N., Smirnova G. V. Redox potential changes in bacterial cultures under stress conditions. Microbiology (Moscow). Vol. 81. No 2. (2012): pp. 131-142. DOI:10.1134/s0026261712020099
4. Owens R.A., Hartman P.E. Export of glutathione by some widely used Salmonella typhimurium and Escherichia coli strains. J. Bacteriol. V. 168 (1986): pp. 109-114. DOI: 10.1128/jb.168.1.109-114.1986
5. Smirnova G.V., Muzyka N.G., Oktyabrsky O.N. Transmembrane glutathione cycling in growing Escherichia coli cells. Microbiol. Res. V. 167 (2012): pp. 166-72. DOI: 10.1016/j.micres.2011.05.005
6. Smirnova G.V., Tyulenev A.V., Muzyka N.G., Peters M.A., Oktyabrsky O.N. Ciprofloxacin provokes SOS-dependent changes in respiration and membrane potential and causes alterations in the redox status of Escherichia coli. Res. Microbiol. V.168 (2017): pp. 64-73. DOI:10.1016/j.resmic.2016.07.008
7. Smirnova G.V., Tyulenev A.V., Muzyka N.G., Oktyabrsky O.N. The sharp phase of respiratory inhibition during amino acid starvation in Escherichia coli is RelA -dependent and associated with the regulation of ATP synthase activity. Res. Microbiol. V.169 (2018): pp. 157-165. DOI:10.1016/j.resmic.2018.02.003
8. Smirnova G.V., Tyulenev A.V., Bezmaternykh K.V., Muzyka N.G., Ushakov V.Yu., Oktyabrsky O. N. Cysteine homeostasis under inhibition of protein synthesis in Escherichia coli cells. Amino Acids. V. 51 (2019): pp. 1577-1592. DOI: 10.1007/s00726-019-02795-2
9. Tietze F. Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: applications to mammalian blood and other tissues. Anal. Biochem. V. 27 (1969): pp. 502-522. DOI: 10.1016/0003-2697(69)90064-5.
10. Tyulenev A.V., Smirnova G.V., Muzyka N.G., Ushakov V. Yu., Oktyabrsky O.N. The role of sulfides in stress-induced changes of Eh in Escherichia coli cultures. Bioelectrochemistry. V. 121 (2018): pp. 11-17. DOI: 10.1016/j.bioelechem.2017.12.012
11. Zhao X., Hong Y., Karl Drlica. Moving forward with reactive oxygen species involvement in antimicrobial lethality. J. Antimicrob. Chemother. V. 70 (2015): pp. 639-642. DOI:10.1093/jac/dku463
Статья поступила в редакцию 24.01.2022; одобрена после рецензирования 07.02.2022; принята к публикации 14.03.2022.
The article was submitted 24.01.2022; approved after reviewing 07.02.2022; accepted for publication 14.03.2022. Информация об авторах
Алексей Валерьевич Тюленев - Leksey333@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-0312-0409, канд. биол. наук.;
Галина Васильевна Смирнова - smirnova@iegm.ru, https://orcid.org/0000-0001-6116-8147, д-р биол. наук.;
Анна Олеговна Габова - ms.anya.05@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-8672-5744, студент;
Галина Андреевна Триандафилова - lindick@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-5536-8214, аспирант, лаборант;
Олег Николаевич Октябрьский - oktyabr@iegm.ru, https://orcid.org/0000-0002-9864-209x, д-р биол. наук, профессор.
Information about the authors
Aleksey V. Tyulenev - Leksey333@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-0312-0409, Cand.biol.sci.; Galina V. Smirnova - smirnova@iegm.ru, https://orcid.org/0000-0001-6116-8147, PhD, Dr.biol.sci.; Anna O. Gabova - ms.anya.05@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-8672-5744, student;
Galina A. Triandafilova - lindick@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-5536-8214, postgraduate, laboratory assistant; Oleg N. Oktyabrsky - oktyabr@iegm.ru, https://orcid.org/0000-0002-9864-209x, PhD, Dr.biol.sci, professor.
Вклад авторов:
Тюленев А. В. - анализ литературы; выполнение исследования; обработка результатов; написание исходного текста.
Смирнова Г. В. - научный консультант; концепция исследования; итоговые выводы.
Габова А. О. - выполнение исследования; обработка результатов.
Триандафилова Г. А. - обработка результатов; написание исходного текста.
Октябрьский О. Н. - научное руководство; доработка текста; итоговые выв.
Contribution of the authors:
Tyulenev A. V. - literature analysis; research execution; processing of results; writing the draft.
Smirnova G. V. - scientific consultant; research concept; final conclusions.
Gabova A. O. - research execution; processing of results.
Triandafilova G. A. - processing of results; writing the draft.
Oktyabrsky O. N. - scientific management; revision of the text; final conclusions.
