CC BY
35РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА ПРИ РАЗНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ ФИТОГЕМАГГЛЮТИНИНОВ, ЭКСТРАГИРОВАННЫХ ИЗ СЕМЯН PISUMSATIVUM (L., 1753)
ERYTHROCYTE AGGLUTINABILITY REACTION OF HUMAN AT DIFFERENT CONCENTRATIONS OF PHYTOHEMAGGLUTININS, WHICH EXTRACTED FROM THE SEEDS OF PISUM SATIVUM (L., 1753)
Е.И. Архипенко, Н.Б. Петрова
E.I. Arkhipenko, N.B. Petrova
Приведены данные о влиянии разных концентраций ФГА из гороха посевного (Pisum sativum (L., 1753) на реакцию агглютинации эритроцитов доноров (женщин и мужчин).
Presents data on the effects of different concentrations phytohemagglutinins from sowing pea (Pisum sativum (L., 1753) on the donor’s erythrocyte-agglutinability reaction (women and men).
Ключевые слова: эритроциты, фитогемагглютинины, реакция агглютинации эритроцитов.
Key words: erythrocytes, phytohemagglutinins erythrocyte agglutinability reaction.
Введение
Лектины - белки, которые обнаруживаются на клеточной поверхности и имеют свойство специфично и обратимо связывать углеводы или их остатки у соседних клеток [7]. Соединения, обладающие таким свойством и выделенные из растений, называются фитогемагглютининами (ФГА). ФГА обладают свойством избирательно связываться с олигосахаридными участками интегральных гликопротеидов мембраны эритроцитов. Результатом развивающегося
взаимодействия является склеивание эритроцитов друг с другом - реакция агглютинации эритроцитов (РАЭ). РАЭ может характеризовать
иммунобиологическую специфичность, структуру и качественный состав популяции эритроцитов, состояние рецепторов на мембране эритроцитов [1, 6].
С 1970-х годов для проведения РАЭ использовали раствор ФГА, который готовили из размолотых семян гороха посевного Pisum sativum (L., 1753), при смешивании с 0.9% раствором NaCl в соотношении 1:5 [2, 7, 8]. По истечении многих лет изменилась не только природа посевного материала, но и состояние здоровья человека. Очевидно, современная экологическая обстановка могла повлиять и на функциональные свойства мембраны эритроцитов, в частности их агрегационную способность.
Цель работы - оценка влияния разных концентраций раствора ФГА гороха посевного урожая 2011 г. на агрегационную способность эритроцитов человека.
Задачи:
• Оценить влияние разных концентраций ФГА (1:5, 1:7, 1:10, 1:20, 1:30) на РАЭ человека.
• Исследовать гендерные различия в РАЭ человека при разных концентрациях ФГА.
• Выяснить влияние разных концентраций гепарина на агрегационную способность эритроцитов.
• Сравнить полученные данные по агрегационной способности эритроцитов с более ранними результатами, полученными сотрудниками кафедры физиологии человека и животных СыктГУ.
Материалы и методы
Исследования проведены на базе кафедры биологии СыктГУ в весенний (март, апрель) период 2012 г. Материалом для исследования служила донорская кровь, полученная путем венопункции из локтевой вены. Забор крови осуществлял медицинский персонал Республиканской станции переливания крови. В эксперименте использовали кровь мужчин и женщин в возрасте до 35 лет. В качестве антикоагулянта применен гепарин. Исследована 31 проба крови человека. Эксперимент проведен при комнатной температуре.
Растворы ФГА готовили путем экстрагирования их из размолотых семян гороха P. sativum 0.9 % раствором NaCl в течение двух суток в холодильнике при температуре 40С [7,8]. Вес сухой навески семян относился к объему раствора NaCl как 1:5, 1:7, 1:10, 1:20, 1:30. Полученный раствор перед использованием фильтровали. Кровь набирали в эритроцитарный смеситель до метки 0.5. Остальную часть смесителя заполняли раствором ФГА. Результаты РАЭ учитывали количественно в камере Горяева на 10-й, 20-й, 30-й, 40-й мин. наблюдения. Подсчитывали количество свободных эритроцитов. Процент агглютинации эритроцитов вычисляли по отношению числа клеток, вовлеченных в агглютинацию, к их числу определявшихся в растворе 0.9% NaCl [7].
Для статистической обработки данных использована программа Excel 2007. Вычисляли среднюю арифметическую, стандартное отклонение, доверительный интервал. Для оценки полученных результатов использован U-критерий Манна-Уитни. Разницу считали достоверной при р<0.05 [4].
Результаты и обсуждение
Оценка влияния разных концентраций ФГА на реакцию агглютинации
эритроцитов человека
Концентрация эритроцитов для мужчин (n=25) в среднем составляла 4.52х1012/л, для женщин (n=6) 3.7x 1012/л, что соответствует литературным данным.
При всех использованных в опыте концентрациях ФГА РАЭ с течением времени увеличивался (рис. 1), что согласуется с ранее полученными результатами [2, 8].
100
о4-
90
80
0 70 S
1 60
03
§ 50
ft
К
S 40 S
ё 30
10
3 20
0
■ 10 мин
■ 20 мин
■ 30 мин
■ 40 мин
1:30 1:20 1:10 1:7 1:5
концентрация ФГА
Рис. 1. Изменение РАЭ во времени при разных концентрациях ФГА
При увеличении концентрации ФГА увеличивается и агрегационная способность эритроцитов. Разница в агглютинации эритроцитов на 10-й мин. наблюдения при разных концентрациях ФГА относительно 1:5 представлена на рис. 2.
Как видно, при концентрации ФГА 1:30 агглютинация эритроцитов меньше на 30% (р<0.05), при 1:20 - на 23% (р<0.05), при 1:10 - на 13%, при 1:7 -на 7% относительно концентрации ФГА 1:5 (рис. 2).
Протекание РАЭ человека при использовании семян гороха разного происхождения
В эксперименте ФГА готовили путём экстрагирования гороха посевного, полученного из разных источников [3]. Семена одного гороха были куплены в продуктовом магазине уже в размолотом виде, т.е. он был предназначен для приема в пищу. Семена второго приобретены в магазине «Дачник». Это цельный
желтый горох фирмы «Агроальянс», предназначенный для посадки в грунт. Его перемалывание осуществляли вручную.
g- fi 80 -
О
н ^
= t-H
6
29,6*
ш
m«L,
13,1
щ
]_
1:20 1:10
конценрация ФГА
Рис. 2. Изменение РАЭ на 10-й мин. наблюдения при разных концентрациях ФГА
100 -
7,4
23,0
40 -
20
0
1:30
1:7
1:5
За 100% принята концентрация ФГА в 0.9% NaCl 1:5; * - p<0.05
В Горох из пищ. промышленности
В Горох для посадки
Рис. 3. РАЭ при использовании ФГА из семян гороха разного происхождения
На рис. 3 представлены различия РАЭ при использовании семян гороха при концентрациях ФГА 1:10, 1:7, 1:5 на 10-й и 20-й мин. наблюдения. Статистически значимых различий РАЭ при использовании разного гороха не выявлено.
Влияние разных концентраций гепарина на протекание РАЭ
В процессе проведения работы исследовано влияние разных концентраций гепарина на РАЭ. На рис. 4 представлены различия протекания РАЭ при использовании в качестве антикоагулянта гепарина с концентрациями 5000 и
2500 МЕ/мл. Анализ данных существенных различий в протекании РАЭ не выявил.
О гепарин 5000 МЕ\мл
S гепарин 2500 МЕ\мл
Рис. 4. РАЭ при использовании гепарина (в качестве антикоагулянта) в разных концентрациях
Однако отмечено, что при использовании концентрированного гепарина начиная уже с 10-й мин. наблюдения все эритроциты становились эхиноцитами (рис 5.). При использовании разбавленного гепарина единичные эхиноциты появлялись только на 40-й мин. наблюдения.
Рис. 5. Единичные эхиноциты на 40-й мин. Наблюдения
Исследование гендерных различий РАЭ при разных концентрациях ФГА
Агглютинация эритроцитов у женщин (n=6) меньше, чем у мужчин (n=25) (рис. 6). Причем с увеличением концентрации ФГА разница становится менее заметной. На 10 мин. наблюдения при концентрации 1:10 разница РАЭ у мужчин и женщин составляет 17% (p<0,05), при 1:7 - 5%, при 1:5 - 2%. С каждой
последующей минутой наблюдения разница в протекании РАЭ между мужчинами и женщинами уменьшается. Статистически значимых различий протекания РАЭ между женщинами и мужчинами при концентрации ФГА 1:7 и 1:5 не выявлено.
минута наблюдения
ВЖ В М
Рис. 6. Различия протекания РАЭ у женщин и мужчин
Из данных, полученных студентами и сотрудниками кафедры физиологии человека и животных СыктГУ, следует, что процент агглютинировавших эритроцитов на 10-й мин. наблюдения составляет 25-37% при концентрации 1:5 [2, 3, 8, 9, 10]. Это в 2 раза ниже наблюдаемого (73.6±6.3%) в этом исследовании в 2012 г.
Мы связываем сильную агглютинацию эритроцитов с составом гороха, из которого готовится раствор ФГА. В дальнейшем для подтверждения этой гипотезы планируется провести анализ семян используемого Pisum sativum на химический состав. Возможно, к пищевому гороху примешивается соя или фасоль, а горох для посева является не чистым сортом, а гибридом нескольких его сортов.
Выводы
1. При уменьшении концентрации ФГА агрегационная способность эритроцитов человека снижается. При ФГА в концентрации 1:5 агглютинация на 10-й мин. исследования составляет - 73.6±6.3%, при концентрации ФГА 1:30 -51.8±5.7%.
2. Не выявлено статистически значимой разницы в протекании РАЭ человека при использовании семян гороха разного происхождения (пищевой и
посевной), разных концентраций гепарина (5000 и 2500 МЕ\мл), применяемого в качестве антикоагулянта.
3. Выявлены достоверные гендерные различия в РАЭ человека при концентрации ФГА 1:10.
4. Агглютинация эритроцитов на 10-й мин. наблюдения при концентрации ФГА 1:5 в наших экспериментах выше в 2 раза, чем таковая в более ранних исследованиях, проведенных на кафедре физиологии человека и животных СыктГУ в 1998-2008 гг.
1. Гиляров М.С. Биологический энциклопедический словарь. М.: Советская энциклопедия, 1986. С. 831.
2. Изъюрова О.М. Влияние обзидана на степень реакции фитогемагглютинации эритроцитов животных и человека в зависимости от возраста и физической нагрузки : дипломная работа. Сыктывкар: СГУ, 1998.
3. Костырева Ю.В., Стрелкова М.В., Лютоева Т.А. Действие ЭС субстанции «Серпистен» на показатели периферической крови и адренореактивность человека в покое и при физической нагрузке // Тезисы VII Молодежной научной конф. ИФ КНЦ УрОРАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к кинической практике», 2009.
4. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. школа, 1980. С. 230.
5. Луцик А.Д., Денюк Е.С., Луцик М.Д. Лектины в гистологии. Львов.: Высш. школа. 1981. 142 с.
6. Мойсеенко Н.А., Иржак Л.И. Агглютинация эритроцитов кролика при напряженном эритропоэзе // Журнал общей биологии. 1971. Т.13. №6. С. 779-785.
7. Метлицкий Л.В., Озерцовская О.Л. Как растения защищаются от болезней. М.: Наука, 1985. С. 192
8. Пашнина Е.Н. Фитогемагглютинация эритроцитов человека под действием пропанолола и адреналина : курсовая работа. Сыктывкар : СГУ, 2009. 34 с.
9. Петрова Н. Б. Кислотная резистентность и агглютинабельность эритроцитов женщин с заболеваниями щитовидной железы, проживающих на Севере // матер. Всерос. научной конф. с междунар участ. «Физиолого-гигиенические проблемы экологии человека». Белгород, 2007. С. 110-112.
10. Петрова Н.Б., Пашнина Е.Н., Денисенко К.Д. Адренореактивность эритроцитов человека в разные сезоны года // В мире научных открытий. 2012, №2(26). С. 95-97.
