CC BY
33
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ
Реактивные изменения лимфоидной ткани сальника мышей после внутрибрюшинной иммунизации эритроцитами барана
С.М.Кремли
Российский государственный медицинский университет им. Н.И.Пирогова, кафедра гистологии и эмбриологии лечебного факультета, Москва (зав. кафедрой - проф. Т.К.Дубовая)
Изучалась структура и клеточная пролиферация млечных пятен сальника мышей после внутрибрюшинной иммунизации эритроцитами барана. Результаты исследования показали, что млечные пятна являются реактивными структурами, увеличивающимися в числе и размерах после иммунизации. Динамика пролиферативной активности в млечных пятнах находится в прямой зависимости от числа иммунизаций, однако определяющую роль в изменении клеточного состава играет миграция клеток из крови. Полученные данные свидетельствуют об активном антителообразовании в млечных пятнах, направленном на защиту брюшной полости.
Ключевые слова: млечные пятна сальника, лимфоциты, кластеры, клеточная пролиферация, миграция
The reactive changes of omental lymphoid tissue of mice after intraperitoneal immunization by sheep red blood cells
S^.Kremly
N.I.Pirogov Russian State Medical University, Department of Histology and Embryology of Medical Faculty, Moscow (Head of the Department - Prof. T.K.Dubovaya)
The structure and cell proliferation of omental milky spots were analyzed in mice after intraperitoneal immunization with sheep red blood cells. Our observation revealed that milky spots are reactive structures, increasing in number and size after immunization. Dynamics of proliferative activity in the milk spots is directly proportional to the number of immunizations, but the main role in changes of the cellular composition plays the migration of cells from blood. The results of this study testify the evidence of the active antibody production in milk spots aimed at immunological protection of abdominal cavity. Key words: omental milky spots, lymphocytes, clusters, cell proliferation, migration
Лимфоидная ткань сальника используется как термин для определения части сальника, содержащего млечные пятна (МП) [1]. В онтогенезе МП развиваются как специфические структуры на 26-й неделе внутриутробного развития, а их число достигает максимума в первый год жизни, уменьшаясь с возрастом [2]. Хорошо васкуляризи-рованные МП состоят из макрофагов (70%), В-лимфоцитов (10%), Т-лимфоцитов (10%), тучных и стромальных клеток [3]. Они являются реактивной тканью, и активированные МП появляются только в условиях развития в брюшной полости патологических процессов, таких как воспаление, иммунизация, опухолевый рост [2, 4, 5]. Некоторые авторы называют МП периферическим лимфоидным органом, в котором все клетки ответственны за эффективную иммунную реакцию в ответ на внутрибрюшинное введение анти-
Для корреспонденции:
Кремли Светлана Михайловна, кандидат биологических наук, заведующая учебной лабораторией кафедры гистологии и эмбриологии Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-4000
Статья поступила 14.04. 2009 г., принята к печати 23.06.2010 г.
гена [1]. При иммунизации, кроме выработки антител, МП могут быть локальными источниками иммунных эффектор-ных клеток - перитонеальных макрофагов, проходящих все стадии дифференцировки от моноцита до зрелого макрофага, мигрирующего в брюшную полость [6]. У экспериментальных животных эмбриональный сальник является местом образования уникальных В-лимфоцитов, которые редко встречаются в крови, селезенке и лимфоузлах [7]. Была выдвинута гипотеза, рассматривающая сальник как кишечный тимус [8]. Функция МП является предметом обсуждения многими авторами, однако роль их в иммунных процессах в брюшной полости изучена недостаточно. Цель настоящей работы - исследование структуры и клеточной пролиферации МП сальника мышей после внутрибрюшинной иммунизации эритроцитами барана.
Материалы и методы
Работа выполнена на 80 интактных мышах линии СВА весом 22-30 г. Мышам делали внутрибрюшинные инъекции 4 х 108 эритроцитов барана в 0,1 мл фосфатного буферного раствора один, два и три раза с интервалами в три дня. Для
С.М.Кремли / Вестник РГМУ, 2010, №4, с. 71-73
анализа степени иммунизации использовали метод определения антителообразующих клеток в селезенке. Для изучения митотической активности за 3 часа до забоя животным внутрибрюшинно инъецировали раствор колхамина в дозе 5 мг/кг. Для оценки фракции ДНК-синтезирующих клеток за 1 час до забоя вводили ЗН-тимидин в дозе 40 МБК/г. У мышей выделяли большой сальник и фиксировали в жидкости Карнуа для получения гистологических срезов и в глютаральдегиде - для полутонких срезов. Гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином и метиловым зеленым - пиронином по Браше; полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим и исследовали под микроскопом. Электронномикроскопическое изучение ультратонких срезов проводили на электронном микроскопе ШасЫ-12. Для определения индекса к-митозов (МИ колх) и индекса меченых ядер (РИ) просматривали МП на серийных срезах. МИ колх и РИ выражали в промилле. Полученные количественные данные обрабатывали статистически по методу Фишера-Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
Основным клеточным элементом МП контрольных животных являются макрофаги, меньший процент составляют лимфоциты и ретикулярные клетки, образующие строму. В небольших скоплениях лимфоцитов видны единичные плазматические клетки. Макрофаги МП имеют разные стадии морфологического развития. В центре вокруг сосудов располагаются моноцитоподобные макрофаги округлой формы, имеющие бобовидные ядра и небольшое число лизосом. Более дифференцированные макрофаги с хорошо развитыми органеллами, лизосомами и фаголизосомами занимают периферию МП. МП снабжены хорошо развитой капиллярной сетью, необходимой для свободной рециркуляции клеточных элементов [2, 3, 6]. Средний МИ колх для всех клеток составил 0,8 ± 0,2 %о, РИ = 21,7 ± 4,3 %о.
Через 3 дня после иммунизации увеличиваются размеры и количество МП за счет увеличения в основном лимфоид-ной популяции. В центре МП периартериолярно образуются лимфоидные кластеры, не содержащие герминативных центров. Небольшие скопления плазматических клеток и пиронинофильных лимфоцитов располагаются по их пери-
Рис.1. Ультраструктура млечного пятна через 3 дня после второй иммунизации. Макрофаг с фаголизосомой в лимфоидном кластере. Ув. 3000.
ферии. Распределение макрофагов в МП такое же, как и у контрольных животных. Макрофаги, находящиеся в лимфо-идных кластерах, имеют небольшое число псевдоподий, лизосом и единичные фаголизосомы (рис. 1). Отмечается появление небольшого числа нейтрофильных и эозино-фильных лейкоцитов, увеличение количества тучных клеток. После первой иммунизации пролиферативная активность достоверно не отличается от контрольных показателей (МИ колх = 1,8 ± 0,5 %, РИ = 28 ± 3,1 %).
Через 3 дня после повторной иммунизации в МП заметно увеличивается количество лимфоцитов и лимфоидные кластеры напоминают первичные лимфоидные фолликулы без герминативных центров. По сравнению с предыдущим экспериментом увеличивается число плазматических клеток и лимфобластов, среди которых встречаются фигуры митозов. Меченые клетки не образуют скоплений, они видны как в центре, так и по периферии МП. Несмотря на то, что РН не отличается от контроля, митотическая активность возрастает: МИ колх = 4,2 ± 0,8 %, р < 0,05; РИ = 29,3 ± 5,2 %.
Третья иммунизация приводит к образованию крупных МП за счет притока большого числа лимфоцитов и моноцитов. В отличие от предыдущих иммунизаций, здесь мы видим значительные скопления плазматических клеток не только в центре МП вокруг сосудов, но и на их периферии (рис. 2). Наблюдаемые плазматические клетки имеют разную степень зрелости. Цитоплазма их заполнена концентрически расположенной эндоплазматической сетью, которая у зрелых клеток образует цистерны, заполненные белком (рис. 3). Популяция дифференцированных макрофагов с многочисленными цитоплазматическими отростками, лизо-сомами и фаголизосомами занимает периферические участки МП, располагаясь в несколько слоев под мезотели-альными клетками, иногда на их поверхности. Меченые клетки видны в центре МП и в меньшем количестве на периферии. Наряду с плазматизацией появляются МП с признаками инволюции. В этих условиях наблюдается рост проли-фативной активности: МИ колх = 12,3 ± 3,1% (р < 0,05); РИ = 47 ± 7,4 % (р < 0,05), по сравнению с контролем. МИ колх достоверно отличается и от предыдущего срока иммунизации (р < 0,05).
Полученные результаты подтверждают данные многих исследований о реактивности МП при иммунизации [1, 3, 6, 9].
Рис. 2. Скопление плазматических клеток вокруг сосудов в млечном пятне через 3 дня после третьей иммунизации. Окраска метиловым зеленым - пиронином. Ув. 600.
Реактивные изменения лимфоидной ткани сальника мышей после внутрибрюшинной иммунизации эритроцитами барана
Рис. 3. Плазматическая клетка в млечном пятне через 3 дня после третьей иммунизации. Скопление белка в расширенных цистернах эндоплазматической сети. Ув. 6000.
Увеличение числа и размеров МП после первой иммунизации происходит за счет роста лимфоидной и моноцитарной популяций, который не сопровождается стимуляцией их ми-тотической и ДНК-синтетической активности. В своих экспериментах Dux К. обнаружил увеличение количества лимфоцитов в 40 раз после третьей иммунизации, появление клеток, секретирующих иммуноглобулин, а также Т-клеток хелперного и цитотоксического фенотипа [1]. В проведенных нами опытах МИ колх достоверно увеличивается после повторной иммунизации, достигая максимума после третьей иммунизации. В этих условиях кроме лимфоидных клеток значительно активизируется ретикуло-эндотелиальная ткань. Увеличение МИ колх в 12 раз после третьей иммунизации отражает пролиферацию и этой ткани. Отсутствие герминативных центров в структурах, подобных лимфоид-ным фолликулам и низкая пролиферативная активность в них при иммунизации свидетельствуют о том, что увеличение лимфоидной популяции происходит не за счет активной пролиферации лимфоцитов, а является следствием притока клеток из крови и костного мозга [1, 7, 8]. Наблюдаемая после третьей иммунизации плазматизация МП, увеличение числа лимфобластов и их пролиферация указывают на антителообразование, направленное на защиту брюшной полости. Наши результаты подтверждают выводы Beelen R.H.Y. о реактивности МП, включающей различные аспекты Т- и В- клеточной функции, а также о важной роли МП в локальном иммунном ответе. Beelen не классифицирует МП как периферический лимфоидный орган, а относит их к сальнико-зависимой лимфоидной ткани [6]. Найденное
нами распределение макрофагов в МП связано со степенью их дифференцирования. Эти наблюдения согласуются с данными о перемещении макрофагов из центра МП на периферию по мере их созревания для выхода в перитоне-альную полость [2, 3, 6]. Таким образом, МП выполняют важную функцию, являясь одним из источников перитоне-альных макрофагов.
Заключение
Установлено, что размеры и число МП, а также пролифе-ративная и ДНК-синтетическая активность их клеток находятся в прямой зависимости от числа иммунизаций. МИ колх увеличивается в 4 раза после второй иммунизации и в двенадцать раз превышает показатели контроля после третьей иммунизации. Результаты исследования показали, что определяющую роль в увеличении лимфоидной популяции в МП в условиях иммунизации играет не пролиферативная активность, а клеточная миграция из крови и костного мозга. Полученные данные свидетельствуют об активном антите-лообразовании в МП, направленном на защиту брюшной полости. Это позволяет классифицировать МП как лимфо-идную ткань сальника, принимающую участие во внутрипе-ритонеальных иммунных реакциях.
Литература
1. Dux K., Rouse R.V., Kyewski B. Composition of the lymphoid all populations from omental milky spots during the immune response in C57 BL /Ka mice // Eur. J. Ymminol. - 1986. - V.16. - P. 1029-1032.
2. Krist L.F.G., Koenen H., Calame W. Ontogeny of milky spots in the Human Greater Omentum: an Immunochemical study // Anat. Rec. - 1997. - V.249. - P.399-404.
3. Platell C., Cooper D., Papadimitriou Y. M. et al. The omentum // J. Gastroenterol. -2000. - V.6. - P. 169-176.
4. Кремли С.М., Мамонтов С.Г. Действие биологически активного полисахарида и гидрокортизона на клеточную пролиферацию и морфологию млечных пятен сальника крыс // Вестн. РГМУ - 2006. - Т.48. - №1. - С.53-56.
5. Кремли С.М., Захаров В.Б., Мамонтов С.Г. Реакция млечных пятен сальника мышей на имплантацию опухолевых клеток в брюшную полость // Вестн. РГМУ - 2007. - Т.56. - №3. - С.50-55.
6. Beelen R.H.Y., Fluitsma D.M., Hoefsmit E.C.M. The cellular composition of omentum milky spots and ultrastructure of milky spot macrophages and reticulum cells // J. Reticuloendothel. Soc. - 1980. - V.28. - №6. - P.585-600.
7. Solvanson N., Kearney F. The human fetal omentum: a site of B-cell generation // J. Exp. Med. - 1992. - V.175. - P.397-404.
8. Koten Y.W., Otter W. Are omental milky spots an intestinal thymus // Zancet. -1991. - V.338. - P.1189-1190.
9. Beelen R.H., Oosterling S.Y., van Egmong M. et al. Omental milky spots in peritoneal pathophysiology // Perit. Dial. Ynt. - 2005. - V.25. - №1. - P.30-22.
