CC BY
12DOI 10.24412/cl-33489-2023-5-58-61 УДК 619:616.98:578.832.1:636.52/. 58:615.371 Мороз Н.В.1, кандидат ветеринарных наук, заместитель директора по производству,
Фролов С.В.2,
Кулаков В.Ю.3,
Константинов А.В.4
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ)
1 ORCID 0000-0002-9672-8594, e-mail: moroz@arriah.ru
2 ORCID 0000-0001-6802-9940, e-mail: frolov@arriah.ru
3 ORCID 0000-0002-1898-4576, e-mail: kulakov@arriah.ru
4 ORCID 0000-0003-0281-0667, e-mail: konstantinov@arriah.ru
развитие поствакцинальнои иммунной реакции у цыплят против высокопатогенного вируса гриппа птиц типа а подтипа H5N1
Аннотация. Товарные цыплята в возрасте 28 суток были привиты инактивированной эмульсионной вакциной против гриппа птиц «АвиФлуВак» производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» (изготовленной на основе антигена низкопатогенного вируса гриппа штамма «Ямал» генотипа H5N1). Птиц разделили на группы, в которых через 5,10,15,20 и 25 суток после вакцинации определяли титры антител к вирусу гриппа и проводили заражение высоко патогенным вирусом гриппа А подтипа Н5 штамма А/chicken/ Stavropol/2077-6/21 H5N1. Установили срок, когда более 95% поголовья были защищены от гибели или проявления клинических признаков болезни. Предложена регрессионная модель, демонстрирующая зависимость между оценкой титра антител и защищенностью вакцинированных птиц.
Ключевые слова: высокопатогенный грипп птиц, вакцина инактивированная против гриппа птиц (Н5), вирус гриппа А подтипа Н5, заболеваемость, антитела.
Summary. Commercial chickens at the age of 28 days were vaccinated with an AviFluVac inactivated emulsion vaccine against avian influenza produced by FGBI “ARRIAH” (based on the antigen of the low-pathogenic H5N1 avian influenza virus Yamal strain). The chickens were divided into groups and tested for anti-AI virus antibody titers 5,10,15,20 and 25 days after vaccination and then challenged with A/chicken/Stavropol/2077-6/21 strain of highly pathogenic type A subtype H5N1 avian influenza virus. Time after vaccination when more than 95% of chickens were protected from death or disease clinical signs was determined. A regression model demonstrating the relationship between the antibody titers and level of vaccinated chicken protection was proposed.
Key words: highly pathogenic avian influenza virus, inactivated vaccine against avian influenza (H5), type A subtype H5 avian influenza virus, morbidity, antibodies.
По признаку вирулентности вирус гриппа птиц (ГП) подразделяют на низкопатогенный (НПГП) и высокопатогенный (ВПГП). Заболевание, вызванное вирусом ВПГП представляет большую опасность для птицеводства во всем мире. Кроме строгих ветеринарно-санитарных мероприятий, единственным эффективным средством борьбы с ВПГП служит специфическая профилактика болезни [1; 2].
Важной характеристикой иммунологического действия вакцины является информация о динамике формирования поствакцинальной иммунной реакции как по параметру напряженности поствакцинального гуморального иммунитета, так и по показателю протективного действия препарата при контрольном заражении. Настоящая работа посвящена изучению развития гуморальной иммунной
реакции и протективной функции иммунитета у цыплят против вируса ВПГП подтипа H5N1 после прививки экспериментальной вакциной против гриппа птиц (Н5) «АвиФлуВак» производства ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Схема опыта. Использовали 100 гол коммерческих цыплят, из которых 60 голов было вакцинировано (опыт) и 40 голов содержали интактными (контроль). Через интервалы 5, 10, 15, 20 и 25 суток после вакцинации отбирали 12 вакцинированных и 8 контрольных птиц, у которых определяли титр сывороточных антител к вирусу ГП и подвергали контрольному заражению. По результатам клинических наблюдений оценивали протективную функцию поствакцинального иммунитета. Данные серологических исследований использовали для построения модели связи с клиническими показателями.
Материалы и методы.
Вакцина. Вакцина против гриппа птиц (Н5) инактивированная эмульсионная «АвиФлуВак» (экспериментальная серия, производства ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир). Препарат изготовлен на основе антигена вируса НПГП штамма «Ямал» генотипа H5N1 (30% по объему), эмульгированного в масляном адъюванте (70% по объему) Montanide ISA 70 VG (Seppic, Франция). Содержание вирусного геагглютинина (ГА) в водной фазе эмульсии составляло (9,67±0,21) log2 ГАЕ/0,05 см3.
Птица. Коммерческие цыплята яичного направления, в возрасте 28 суток, серонегативные к вирусу ГП. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с ГОСТ 33215, а также согласно требованиям Директивы 2010/63/EU по охране животных, используемых в научных целях.
Вакцинация птицы. Вакцину вводили в объеме 0,5 см3, подкожно, в дорсальную часть верхней трети шеи.
Контрольное заражение. Использовали вирус ВПГП А подтипа Н5 штамма А/chicken/ Stavropol/2077-6/21 Н5^. Заражение проводили внутримышечно в бедро в дозе 7,1 1дЭИД50 в объёме 0,5 см3. Наблюдение клинического состояния зараженной птицы продолжали в течение 10 суток.
Серологические исследования. Полученные на заданных интервалах времени пробы сывороток крови птиц исследовали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Использовали диагностические наборы для выявления антител к вирусу ГП производства ФГБУ «ВНИИЗЖ». В тестируемых образцах сывороток определяли титр антител к вирусу ГП. Положительной считали реакцию, где показатель титра имел величину 1:8 и более, т.е. 3 log
Обработка данных. В выборках варьирующих переменных в качестве структурных средних определяли медианы. Для оценивания связи изучаемых параметров использовали элементы регрессионного анализа. Вычислительные процедуры и графические построения выполняли в приложении Microsoft Excel.
Результаты. Серологические исследования. В образцах сывороток крови определяли титры антител к вирусу ГП (Т). Для каждого временного интервала в выборках из n-числа логарифмических оценок титров (log Т) находили медианы (М). Полученные результаты в графическом виде представлены на рисунке 1.
Из данных рисунка 1 следует, что при сравнении значений М в вакцинированной группе птиц, фаза наиболее активного развития иммунной реакции соответствовала интервалу 5-15 суток, где прирост оценки М15=6,5 log2 относительно М5=2 log2 составил
Рисунок 1. Результаты серологических исследований. Титры антител к вирусу ГП в РТГА через заданные интервалы времени после вакцинации.
Параметры графика: горизонтальная ось (x) -интервалы времени (Сутки); вертикальная ось (у)
- логарифмы титров (log2 Т). Даны значения тиров, установленные в группах вакцинированных (•, n=12) и контрольных (▲, n=8) птиц. Показаны линии соединения групповых медиан у вакцинированных (-) и контрольных (...) птиц. В рамках приведены координаты (x;y) медиан вакцинированных групп.
22,6 раза. Далее, каждые следующие 5 суток, значения М возрастали в 2,8 и 2 раза соответственно. При этом медианы титров антител в контрольной группе птиц за весь период наблюдений не превзошли показатель положительной реакции (исключение составил показатель титра у одной птицы зафиксированный однократно на интервале 15 суток).
Клинические исследования. На каждом временном интервале в опытной и контрольной группах оценивали клиническое состояние птиц, подвергнутых заражению. Каждые сутки оценивали количество клинически больных (d) и погибших птиц (m). Указанные величины суммировали и вычисляли текущею оценку эффекта инфекционного воздействия или суммы клинических патологий (c=d+m). По окончанию 10 суток наблюдений определяли относительный групповой показатель С = Qc)/n, где n - число птиц в группе до заражения. Полученные результаты приведены в таблице 1.
На каждом временном интервале оценивали протективное действие поствакцинального иммунитета, которое рассматривали как эффективность вакцины. Показатель эффективности (Е) вычисляли по формуле {1}.
E = (С0 - С^, {1}
где: С0 - относительный показатель клинических патологий в контроле; С1 - тоже в опыте. Показатель Е имеет размерность доли и принимает значения от 0 (эффективность препарата отсутствует) до 1 (эффективность препарата абсолютная).
Полученные оценки Е, рассчитанные по данным таблицы 3, в виде графика представлены на рисунке 2. Приведенный на рисунке 2 график демонстрирует, как происходил рост показателя эффективности вакцины.
Анализ зависимости оценок напряженности поствакцинального гуморального иммунитета и показателей эффективности вакцины. Исследовали связь между величинами M, log2 (см. таблицу 1) и значениями Е (см. данные на рисунке 2). В диапазоне от 10 до 25 суток, построили регрессионную модель, которая представлена на рисунке 3.
Таблица 1.
Результаты клинических наблюдений, проведенных после заражения вакцинированных птиц соответственно интервалам времени (J, сут) после иммунизации.
Текущие оценки клинических патологий (c), установленные в опытной (вакцинированной) и в контрольной (не вакцинированной) группах соответственно времени после заражения (U, сут) и относительный групповой показатель (C = (£c)/n, где n - число птиц в группе до заражения)
Группа U J, сут
5 10 15 20 25
с
Опыт (n=12) 1 0 0 0 0 0
2 12 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0
4 0 3 1 1 0
5 0 3 2 0 0
6 0 2 0 0 0
7 0 0 0 0 0
8 0 0 0 0 0
9 0 0 0 0 0
10 0 0 0 0 0
C 12/12 8/12 3/12 1/12 0/12
Контроль (n=8) 1 1 2 1 3 2
2 6 6 5 5 6
3 1 1 0 0
4 0 0 0 0
5 0 0 0 0
6 0 0 0 0
C 8/8 8/8 7/8 8/8 8/8
Рисунок 2. Динамика показателей эффективности вакцины после заражения иммунизированных птиц вирусом ВПГП типа А подтипа H5N1.
Параметры графика: горизонтальная ось (x) - интервалы времени после вакцинации (Сутки); вертикальная ось (у) - показатели эффективности препарата (Е). Приведены значения Е, установленные соответственно заданным временным интервалам.
Рисунок 3. Зависимость показателей эффективности вакцины и оценок напряжённости поствакцинального гуморального иммунитета.
Параметры графика: горизонтальная ось (x)
- медианы групповых логарифмических титров антител (М, log2); вертикальная ось (у) - показатели эффективности препарата (Е). Дано положение эмпирических величин Е (О) и приведено уравнение регрессии, где ‘E - ожидаемое значение для заданного значения М. Указан коэффициент адекватности регрессионной модели R2 = 0,992.
Рисунок 3 иллюстрирует, что связь между оценками напряженности гуморального иммунитета птиц (М) и показателями эффективности вакцины (Е), в диапазоне от М = 2 до М = 9, может быть описана уравнением {2}.
'Е = 0,0958М + 0,1304 {2}.
Построенное уравнение имело высокий уровень адекватности (R2 = 0,992) и при заданном М может быть использовано для прогноза показателя ‘Е.
Обсуждение. Иммунная реакция организма птиц, как и у всех позвоночных, включает неспецифическую (воспалительную) и специфическую (системную) фазы. Первая может развиться в течение нескольких минут, вторая определяется скоростью пролиферации «доминирующих компетентных клеточных клонов», развивается в течение не менее двух - четырех недель и сопровождается ростом концентрации циркулирующих антител [3].
В отношении инфекции вируса ГП известно, что протективный эффект иммунитета зависит от величины титра специфических циркулирующих антител [4]. Полученные в настоящем исследовании оценки поствакцинальных титров сывороточных антител как по динамике достижения (от 20 до 25 сут), так и по величине (8 - 9, log2), достаточно хорошо согласуются с опубликованными данными и, даже, несколько превосходят рекомендованный OIE [3] протективный титр, который должен находиться в границах от 5 до 7 log2. В нормативных документах по использованию аналогичных по назначению коммерческих вакцин также фигурируют близкие величины [5].
Для характеристики эффективности вакцины в остром опыте нами был использован показатель Е, основанный на отношении вида (Х0 - Х1)/Х0, где Х0 и Х1 - оценки, полученные в контроле и в опыте соответственно. Этот принцип обработки данных удобен и широко используется [6; 7], поскольку позволяет получить оценку, которая зависит от результатов, установленных как в опытной, так и в контрольной группах.
Содержание гемагглютинина (ГА) в прививной дозе вакцины определяли используя величины, приведенные в соответствующих МУ [8] в
разделе контроля антигена гриппа, где указан титр 32о0о ГАЕ, которому должна соответствовать масса ГА в диапазоне (25 - 50) мкг. На этом основании считали возможным принять, что в среднем 1 мкг ГА = 32000/35 ~ 900 ГАЕ. Далее, учитывая концентрацию антигена в водной фазе эмульсии ((9,67±0,21) log2 ГАЕ/0,05 см3), пропорцию водной фазы в препарате (0,3 объема) и объем прививной дозы (0,5 см3), вычисляли массу ГА в прививном объеме вакцины, которая составила величину [(29,67)х(0,5х0,3/0,05)]/900 = 2,72 (мкг). С учетом ошибки измерения полученное значение находилось в границах 2,35 - 3,14 (мкг), что удовлетворительно согласовалось с показателями, рекомендуемыми для инактивированных вакцин против гриппа птиц [3]. Однако, учитывая, что на практике оценки концентрации ГА в вакцине имеют значительные вариации, и разные генетические группы вируса показывают не одинаковые соотношения тира ГАЕ и массы ГА [9], а также, принимая во внимание, что для более точной оценки концентрации ГА необходимо использовать эталоны [9;10], авторы рассматривали полученный результат как ориентировочный.
Связь гуморального фактора и протективной функции поствакцильного иммунитета была охарактеризована уравнением {2}, которое может быть использовано на практике, для опосредованной оценки защищенности вакцинированных птиц по результатам серологического мониторинга.
Благодарность: Работа выполнена за счет средств ФГБУ «ВНИИЗЖ» в рамках тематики научно-исследовательских работ «Ветеринарное благополучие».
ЛИТЕРАТУРА
1. OIE. High Pathogenicity Avian Influenza (HPAI) - Situation report 11/04/2022. Режим доступа: https://www.woah.org/app/uploads/2022/04/ hpai-situation-report-20220411.pdf.
2. OIE. Terrestrial Animal Health 2021. Chapter 3.3.4. Avian influenza (including infection with high pathogenicity avian influenza viruses), P. 1-24. Режим доступа: https://www.woah.org/fileadmin/Home/fr/ Health_standards/tahm/3.03.04_AI.pdf.
3. Virgil E.J.C. Schijns, Saskia van de Zande, Blanca Lupiani, Sanjay M. Reddy, Chapter 20 - Practical Aspects of Poultry Vaccination, Editor(s): Karel A. Schat, Bernd Kaspers, Pete Kaiser, Avian Immunology (Second Edition), Academic Press, 2014, Pages 345-362. Режим доступа: https:// www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123969651000200.
4. Kumar M, et al. Association of serologic and protective responses of avian influenza vaccines in chickens. Avian Diseases 2007; 51: 481-483. Режим доступа: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17494614/.
5. Инструкция по применению вакцины против гриппа птиц инактивированной эмульгированной «POKROV BIO Грипп птиц» (Организация-разработчик: ОАО «Покровский завод биопрепаратов», 601125, Владимирская обл., Петушинский район, пос. Вольгинский, тел/ факс 8 (49243) 7-11-10). Режим доступа: http://www.pokrovbio.ru/doc/ instruction_gripp_ptic.pdf.
6. Методические указания МУ 3.1.3490-17 «Изучение популяционного иммунитета к гриппу у населения Российской Федерации» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 27 октября 2017 г.). Режим доступа: https://www.garant.ru/products/ipo/prime/doc/71723602/.
7. Брико Н.И. (2020) Оценка качества и эффективности иммунопрофилактики. Медицинский портал. Режим доступа: http://www.medlinks. ru/article.php?sid=91654.
8. МУ 3.3.2.1758 - 03 Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа. 5.2.2. Приготовление стандартного антигена (ГА) вируса гриппа Режим доступа: https://ohranatruda.ru/upload/iblock/131/4293851835.pdf.
9. Fulvini AA, Tuteja A, Le J, Pokorny BA, Silverman J, Bucher D. HA1 (Hemagglutinin) quantitation for influenza A H1N1 and H3N2 high yield reassortant vaccine candidate seed viruses by RP-UPLC. Vaccine. 2021 Jan 15;39(3):545-553. Режим доступа: https://www.sciencedirect.com/ science/article/pii/S0264410X20315632.
10. ФС.3.3.1.0028.15 Вакцина гриппозная инактивированная (ГФ 14) Режим доступа: https://pharmacopeia.ru/4056d6fe17a725589d18479 0cc4279a2-215.html.
СИБИРСКАЯ АГРАРНАЯ НЕДЕЛЯ
sibagroweek.ru
Международная агропромышленная выставка
8-10
НОЯБРЯ 2023
РАЗДЕЛЫ ВЫСТАВКИ:
Сельхозтехника / Запчасти / Расходные материалы Оборудование и материалы для животноводства Агрохимия / Удобрения / Семена Оборудование и материалы для переработки агропромышленной продукции
ПОСЕТИТЕ ВЕДУЩЕЕ ОТРАСЛЕВОЕ СОБЫТИЕ СИБИРИ И ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА!
ф @sibagroweek ф sibagroweek ^ +7 (383) 304-83-88 ф info@sibagroweek.ru 0+
Организатор:
I СИБИРСКАЯ ВЫСТАВОЧНАЯ I КОМПАНИЯ
Новосибирск, ул.Станционная, 104
ЭКСПОЦЕНТР
