CC BY
26
DOI: https://doi.org/10.23670/IRJ.2017.65.165 Глаголев В.И.1, Джавахия В.В.2, Попова Е.Д.3, Воинова Т.М.4
1 Аспирант, 2кандидат биологических наук, зав. лабораторией, 3инженер, 4научный сотрудник, 1 Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева
2,3Федеральное государственное учреждение Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы
биотехнологии» Российской академии наук 4ООО «Нинофарм»
РАЗРАБОТКА ВЫСОКОПРОДУКТИВНОГО ШТАММА ПРОДУЦЕНТА ИММУНОСУПРЕССАНТА
ТАКРОЛИМУС И ОПТИМИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТАЦИОННОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ЕГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Аннотация
Такролимус, относящийся к группе макролидных иммуносуперсантов, был выделен из культуральной жидкости почвенной культуры Streptomyces tsukubaensis. В настоящее время он широко используется для предотвращения отторжения трансплантатов при пересаживании органов, а также для лечения дерматозов. Цель данного исследования состояла в получении нового высокопродуктивного штамма продуцента такролимуса и оптимизации состава питательной среды для культивирования данного штамма.
Методом многоступенчатого индуцированного мутагенеза из штамма St. tsukubaensis DSM 42081 был получен новый высокопродуктивный штамм St. tsukubaensis Т44-7, продуктивность которого составила 0.22±0.07 г/л такролимуса. Далее путём добавления в питательную среду адсорбирующей синтетической смолы LPS 500 (20 г/л) и оптимизации среды, удалось повысить продуктивность нового высокопродуктивного штамма до 0.75±0.15 г/л, с помощью внесения в питательную среду гороховой муки (15 г/л) и пшеничного декстрина (60 г/л).
Ключевые слова: такролимус, Streptomyces tsukubaensis, синтетические абсорбирующие смолы, оптимизация, ферментация.
Glagolev V.I.1, Javakhia V.V.2, Popova E.D.3, Voinova T.M.4
Postgraduate student, 2PhD in Biology, Head of the laboratory, 3Engineer, 4Researcher, 1D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia 2,3Federal State Institution Federal Research Center "Fundamental Foundations of Biotechnology" of the Russian Academy of
Sciences 4LTD "Ninofarm"
DEVELOPMENT OF HIGH-PRODUCTIVE PRODUCING STRAIN OF IMMUNOSUPRESSANT TACROLIMUS AND OPTIMIZATION OF THE FERMENTATIONAL ENVIRONMENT FOR ITS CULTIVATION
Abstract
Tacrolimus, that belongs to the group of macrolide immunosupersants, was isolated from the culture fluid of the soil culture Streptomyces tsukubaensis. Currently, it is widely used to prevent the rejection of transplants during organ transplantation, as well as to treat dermatoses. The purpose of this study was to obtain a new high-productive producing strain of the tacrolimus and optimize the composition of the nutrient medium for culturing this strain.
Using the method of multistage induced mutagenesis from St. tsukubaensis DSM 42081 srain new highly productive strain St. tsukubaensis T44-7 was obtained, the tacrolimus productivity of which was 0.22 ± 0.07 g /1. Further, by adding LPS 500 (20 g /1) to the nutrient medium and optimizing the medium, the productivity of the new highly productive strain was increased to 0.75 ± 0.15 g /1, by introducing pea flour (15 g /1) into the nutrient medium and wheat dextrin (60 g /1).
Keywords: tacrolimus, Streptomyces tsukubaensis, synthetic absorbent resins, optimization, fermentation.
Различные макролидные соединения используются в качестве иммуносупрессивных агентов для профилактики о тторжения трансплантата при трансплантации органов, а также для лечения различных аутоиммунных заболеваний. Одним из широко применяемых иммуносупресантов является циклоспорин, но побочные эффекты, вызываемые этим соединением, такие как нефротоксичность, расстройства центральной нервной системы и гепатотоксичность, привели к необходимости поиска альтернативного метода лечения [1].
Такролимус (FK 506) иммуносупрессивный препарат, относящийся к группе природных макролидов. Впервые был выделен из культуральной жидкости Streptomyces tsukubaensis в Японии в 1984 году [2]. В экспериментах in vitro такролимус в 100 раз активнее подавлял пролиферацию Т-лимфоцитов по сравнению с циклоспорином [3]. В 1993 году в Японии такролимус получил первое одобрение для клинического применения для лечения и/или профилактики отторжения трансплантата у больных после пересадки почки и печени. В следующем году такролимус был так же одобрен для применения в США и Великобритании.
Многолетняя клиническая практика применения препарата показала, что такролимус обеспечивает надежную профилактику острого отторжения трансплантата, в том числе резистентного к терапии кортикостероидами. Некоторые результаты клинических исследований указывают на то, что такролимус способен снизить частоту хронического отторжения, а также риск сердечнососудистых заболеваний, которые являются основными причинами утраты трансплантата на сроках более 1 года после трансплантации [4].
Помимо этого, такролимус обладает широким спектром иммуномодулирующих эффектов при различных заболеваниях кожи. В настоящее время в зарубежных исследованиях получены данные об эффективности такролимуса, кроме атопического дерматита, также при красном плоском лишае (особенно на слизистых оболочках) [5], розацеа (в том числе стероидной) [6], очаговой алопеции [7], гангренозной пиодермии [8], эритематозе [9], псориазе [10] и других кожных заболеваниях.
Условия эксперимента
Продуцент такролимуса и среда для культивирования. В качестве исходного штамма использовали штамм St. tsukubaensis DSM 42081, продуктивность которого составляла 0.1 г/л такролимуса. Для выращивания, поддержания и хранения штамма использовали агаризованную среду следующего состава (г/л): агар-агар - 20.0, мальт экстракт -
15.0, дрожжевой экстракт - 5.0, растворимый крахмал - 5.0, CaCO3 - 3.0, дистиллированная вода - до 1000 (рН - 6.87.0). Исходный штамм и полученные из него изоляты культивировали при температуре 28°С в течение 5-7 дней. На используемой агаризованной среде исходная культура St. tsukubaensis образует округлые колонии, воздушный мицелий белого цвета, споры чёрные, гладкие, профиль колонии плоский, вросший в агар, структура однородная, размер колоний 3-4 мм.
УФ-мутагенез. Мицелий 5-7-дневной культуры смывали с поверхности агаризованной среды стерильной водой и фильтровали через ватный фильтр для отделения крупных конгломератов мицелия. Затем суспензию фильтровали через стеклянный фильтр (размер пор - 100 мкм) для получения равномерной суспензии мелких фрагментов мицелия и облучали коротковолновой ультрафиолетовой (100-280 нм) лампой Short Wave Ultra-violet Mineralight (США) мощностью 12.5 Вт. Расстояние от источника облучения до обрабатываемой суспензии составляло 40 см. После облучения 0.1 мл суспензии высевали на поверхность агаризованной среды на каждую чашку Петри и инкубировали в термостате при температуре 28°С в течение 7-10 дней.
Скрининг и отбор мутантных штаммов. На первом этапе были построены кривые выживаемости колоний исходной культуры St. tsukubaensis в зависимости от времени облучения, а также определена зависимость частоты возникновения морфологических мутаций от продолжительности облучения. С учетом этих данных было определено оптимальное время облучения, дающее максимальное число морфологически изменённых изолятов, и, в то же время, обеспечивающее определенную степень выживаемости колоний. Степень выживаемости колоний определяли по соотношению выросших колоний до и после УФ-облучения. Колонии с измененной морфологией отбирали, пересевали на свежую агаризованную среду для дальнейшего культивирования в ферментативной среде и определения количественного содержания такролимуса в культуральной жидкости (КЖ) с последующим отбором наиболее продуктивных изолятов.
Ферментация. Отобранные изоляты St. tsukubaensis выращивали на ферментативной среде в колбах объемом 50 мл, содержащих 10 мл питательной среды. С помощью микробиологической петли кусочек мицелия 5 -7-дневной культуры переносили в колбы с ферментативной средой следующего состава (г/л): кукурузный декстрин - 60.0; глюкоза - 35.0; перьевая мука - 10.0; сухие дрожжи - 15.0; дрожжевой экстракт -5.0; соевое масло - 1.0; CaCO3 - 1.0; CaCl2 - 1.0; кукурузный экстракт - 5.0; солевой сток - 0.83 мкл; дистиллированная вода - до 1000 (рН - 6.8-7.0). Колбы инкубировали при температуре 26°С в течение 240-336 ч на термостатируемой качалочной установке "Inforce HT" (Дания) при 280 об/мин (эксцентриситет 2.5 см). После отбора анализируемые пробы культуральной жидкости смешивали в микропробирках с этилацетатом в соотношении 1:2 и экстрагировали при постоянном перемешивании в течении 2 часов, далее центрифугировали при 13400 об/мин в течение 5 минут. Супернатант отбирали, высушивали до полного улетучивания этилацетата, осадок смывали 1 объёмом метанола и анализировали при помощи ВЭЖХ.
Идентификация полученного мутантного штамма. Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК использовали универсальную праймерную систему: прямой праймер 5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3' и обратный праймер 5'AAGGAGGTGATCCANCCRCA3 ' [11].
Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см. Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps (Promega, США) согласно рекомендациям производителя.
Количественное определение содержания такролимуса.
Оценку количественного содержания такролимуса адсорбирующегося на смоле и в КЖ проводили методом ВЭЖХ на хроматографической системе «Agilent Technologies». Анализ проводили на колонке Nucleosil 100-5C8 (4мм х 125 мм), 215 нм, температура колонки 60°С, подвижная фаза: 74.9% ацетонитрилл, 24.95% бидистилированная вода, 0.15% уксусная кислота.
Стандарт такролимуса для проведения ВЭЖХ был приобретён в компании Sigma, St. Louis, США.
Результаты
УФ-мутагенез. На первом этапе были определены степень выживаемости и частота появления морфологически изменённых колоний под воздействием УФ-облучения. Зависимость степени выживаемости от времени УФ-облучения показана на рис. 1. Частота возникновения морфологических мутантов является косвенным признаком эффективности УФ-мутагенеза, что, в свою очередь, может коррелировать с появлением колоний с повышенной продуктивностью [12]. Максимальный уровень возникновения мутантов наблюдался при продолжительности облучения 15-20 мин; были отмечены как колонии с измененной морфологией и пигментацией мицелия, так и колонии, отличающиеся замедленным ростом\
Рис. 1 - Выживаемость и частота проявления мутаций штамма St. tsukubaensis DSM 42081 в зависимости от
продолжительности УФ-облучения
Таким образом, для отбора морфологически изменённых колоний в основном использовали экспозиции 15 и 20 мин. Количество морфологически изменённых изолятов при этом составляло примерно 6%.
Для определения возможной взаимосвязи между морфологическими характеристиками и повышенной продуктивностью колоний, все типы возникающих морфологических форм были протестированы на уровень биосинтеза такролимуса при глубинном культивировании. Были отобраны 5 различных морфологических типа колоний (табл. 1).
Таблица 1 - Связь между морфологическим типом колоний и их способностью к биосинтезу такролимуса
Морфологический тип Степень развития воздушного мицелия Цвет колоний Средний уровень продукции такролимуса, г/л
Контроль Слабо развитый Белый 0.1 ± 0.03*
1 Слабо развитый Желтый 0.07 ± 0.01
2 Сильно развитый Красный 0.22 ± 0.07
3 Хорошо развитый Светло-розовый 0.15± 0.04
4 5 Слабо развитый Хорошо развитый Слегка розоватый Желтый 0.08± 0.05 следы
Примечание: * - Здесь и далее ошибку опыта определяли, как случайную ошибку прямых измерений по формуле: Ax=(xmax-xmin)/2, где xmax и xmin - максимальное и минимальное значения из ряда полученных при повторных измерениях [13].
В ходе тестирования было выявлено, что колонии типа 2 обладали способностью к повышенному уровню биосинтеза такролимуса. Штаммы с повышенным уровнем биосинтеза отбирали для дальнейших циклов УФ -мутагенеза.
В результате ряда последовательных циклов мутагенеза с последующим скринингом колоний, в том числе колоний с морфологией 2 типа, был получен высокоактивный штамм Т 44-7, характеризующийся повышенной продуктивностью такролимуса в ферментационной среде (0.22 ± 0.07 г/л). В отличие от исходного штамма, воздушный мицелий полученного штамма имел красный пигмент.
Идентификация мутантного штамма. Для генетической идентификации полученного штамма Т 44-7 было проведено секвенирование исходного и полученного штаммов. Была определена практически полная последовательность (1479 нуклеотидов) амплификата гена, кодирующего 16S рРНК. Нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов для обоих образцов оказались идентичными между собой.
Последовательность гена 16S рРНК полученного мутантного штамма и исходного штамма на 99% совпадает с аналогичной последовательностью штамма Streptomyces tsukubaensis 9993 на всем протяжении, поддающемся достоверной расшифровке.
Влияние внесения синтетических адсорбирующих смол на биосинтез такролимуса штаммом Т 44-7.
Синтетические адсорбенты являются сверхсшитыми полимерами сферической формы, характеризующимися пористой структурой с площадью поверхности в диапазоне 500-1200 м2/г сухого вещества. Особенностью смол LPS 500 и НР21 является размер пор достаточный для того, чтобы пептиды, белки, полифенолы и иные соединения с
молекулярной массой 1000 и более могли быть подвергнуты адсорбционной хроматографической очистке. Дополнительно, LPS 500 демонстрирует великолепную эффективность разделения в хроматографической колонке, благодаря порам с радиусом 260 А.
Смолы амберлиты XAD4 и XAD7 - это гранулированные (0,05...0,12 мм) синтетические смолы, высокая механическая прочность которых обусловлена сильными поперечными связями. Смола XAD4 характеризуется размером пор 100 А и площадью поверхности 750 м2/г, в свою очередь XAD7 имеет размер пор 300-400 А и площадь поверхности 380 м2/г.
Помимо использования адсорбирующих смол для хроматографического разделения или выделения конкретных веществ после проведения ферментации, их так же используют непосредственно во время ферментации как добавку к среде. Это делается для того чтобы нерастворимые в воде соединения адсорбировались во время ферментации на смоле и уменьшали процесс самоингибирования [14].
В ходе эксперимента использовались адсорбирующие смолы 4 видов: LPS 500 (Sorbent Technologies, США), HP21 (Sorbent Technologies, США), XAD4 (Servachrom, Германия), XAD7 (Aldrich Chemical Company, США), смолы добавлялись ферментационную среду перед стерилизацией в концентрации 20 г/л. При культивировании со смолами LPS 500, НР21 и XAD7 наблюдалось покраснение как самой смолы, так и культуральной жидкости, чего не было при культивировании без использования абсорбирующих смол. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Влияние внесение адсорбирующих полимерных смол на биосинтез такролимуса
№ п/п Наименование смолы Содержание такролимуса, г/л
1 Без смолы (контроль) 0.22 ± 0.07
2 LPS 500 0.40± 0.1
3 HP21 0.33± 0.03
4 XAD4 0.29± 0.09
5 XAD7 0.38± 0.05
В дальнейших экспериментах адсорбирующая смола LPS 500 в концентрации 20 г/л использовалась в контрольной среде.
Влияние внесения различных источников белкового азота на биосинтез такролимуса штаммом Т 44 -7.
Перьевая мука, использующаяся в исходной ферментационной среде, является не только дешёвым, но и богатым источником белка (64-82% протеина). Несмотря на это, протеин из перьевой муки усваивается хуже, чем из других видов муки, а также она быстро прогоркает при хранении. Так же, как показали предыдущие опыты [14], применение перьевой муки в больших концентрациях ведёт к ингибированию синтеза такролимуса. Поэтому было проведено исследование по замене перьевой муки на другие источники белкового азота. Во время опыта оценивались биохимический состав, экономическая целесообразность и влияние компонента на продуцирующую способность штамма. В качестве альтернативных источников белкового азота были взяты следующие компоненты: соевая мука (полножировая), соевая мука (обезжиренная), хлопковая мука, гороховая мука в концентрации 10, 15, 20 г/л. Результаты эксперимента представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Влияние внесения различных видов муки на биосинтез такролимуса
№ п/п Источник белкового азота Концентрация, г/л Содержание такролимуса, г/л
1 Перьевая мука 10 (контроль) 0.40± 0.1
2 15 0.35± 0.04
3 20 0.23± 0.05
4 Соевая мука (полножировая) 10 0.35± 0.03
5 15 0.47± 0.09
6 20 0.40± 0.1
7 Соевая мука (обезжиренная) 10 следы
8 15 0.02± 0.01
9 20 0.03± 0.02
10 Хлопковая мука 10 0.42± 0.07
11 15 0.44± 0.02
12 20 0.35± 0.06
13 Гороховая мука 10 0.45± 0.05
14 15 0.54± 0.13
15 20 0.40± 0.09
Наилучший результат был достигнут при замене перьевой муки на гороховую муку в концентрации 15 г/л. В дальнейших экспериментах в контрольной среде использовали гороховую муку в данной концентрации.
Влияние внесения различных источников углеводов на биосинтез такролимуса штаммом Т 44-7. Декстрин -это полисахарид, получаемый путём термической обработки крахмалосодержащего сырья. Данное сырьё является богатым источником простых углеводов. В нашей работе мы использовали картофельный декстрин, кукурузный декстрин, рисовый декстрин и пшеничный декстрин в концентрации 60 г/л. Все они различаются по концентрации свободной глюкозы и по молекулярной массе декстринов. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.
Таблица 4 - Влияние внесения различных видов декстринов на биосинтез такролимуса
№ п/п Декстрин М.м. декстринов в конечном продукте, тыс Да Концентрация свободной глюкозы в конечном продукте, мас. % Содержание такролимуса, г/л
1 Рисовый 4-5 0.09 0.23± 0.09
2 Пшеничный 5-7 0.06 0.75± 0.15
3 Кукурузный (контроль) 3-5 0.3 0.54± 0.13
4 Картофельный 3-5 0.4 0.36± 0.07
Исходя из полученных результатов, можно предположить, что на биосинтез такролимуса большее влияние оказывает не столько концентрация свободной глюкозы в декстрине, сколько его молекулярная масса.
Обсуждение
Одной из самых острых проблем при производстве такролимуса является отсутствие технологий, которые обеспечивали бы высокий выход данного иммуносупресанта при проведении ферментации. Для решения данной проблемы применяются различные методы повышения уровня биосинтеза такролимуса. Так, например, известен способ повышения продуктивности штамма S. tsukubaensis TJ-01 [15] с помощью проведения 5-ти ступенчатого УФ-облучения протопластов исходного штамма. Полученный в данной работе штамм S. tsukubaensis TJ-P325 имел максимальную продуктивность 368.6±8.8 мг/л такролимуса. Далее авторы путём добавления в ферментационную среду соевого масла, лактата, пиколиновой кислоты и других предшественников такролимуса, смогли увеличить продуктивность штамма до 514.5±9.5 мг/л.
Авторам статьи [16] так же удалось увеличить продуктивность штамма S. tsukubaensis FERM BP-927 с помощью добавления в питательную среду предшественников такролимуса, таких как: пиколиновая кислота, пипеколиновая кислота NAD, никотиновая кислота. Таким образом, авторам удалось увеличить продуктивность штамма с 5 -6 мг/л такролимуса до 35-40 мг/л.
В другой работе [17] авторы статьи описывают метод, который позволил повысить продуктивность штамма Streptomyces sp. RM7011 в 5.2 раза (с 92.8 ± 0.7 мг/л до 498.1 мг/л такролимуса) путём получения гиперэкспрессии генов tcsABCD и добавления в питательную среду винил пентаноата.
Наивысший уровень биосинтеза такролимуса (980 мг/л), был достигнут авторами российского патента [18]. В данном патенте авторы описывают технологию получения субстанции такролимус путем культивирования штамма Streptomyces sp. BKM Ас-2618Д на среде следующего состава, г/л: растворимый крахмал - 75, кукурузный экстракт лиофилизированный - 15, сухие дрожжи - 20, СаСОЗ - 3, рН до автоклавирования 6.8-7.0. После автоклавирования среды, объемом 47 мл, вносят стерильные растворы: 2.5 мг сульфата марганца (0.05 г/л) в 1 мл дистиллированной воды и 1 г рамнозы (20 г/л) в 2 мл дистиллированной воды. Инокулят вносят в объеме 5%. На 3 сутки культивирования вносят сорбент - 2 г ХАД-7НР. Сорбент предварительно стерилизуют при 112°C, 30 мин. На 4-7 сутки биосинтеза в среду вносят крахмал - 2.9 г (5.8 г/л) в 3 мл воды. Биосинтез осуществляют при 25°C на роторной качалке при 220 об/мин в течение 10 суток. Этот метод является наиболее близким к описанному нами, но является более трудозатратны и менее продуктивным.
Выводы
В результате проведенного исследования был получен высокопродуктивный штамм-продуцент, подобран состав ферментационной среды и тип адсорбирующей смолы, обеспечившие конечный выход такролимуса на уровне 0.75±0.15 г/л. Полученные результаты будут использованы для дальнейшей селекционной работы, а также масштабирования технологии ферментации штамма Т 44-7, и могут представлять определенный интерес для дальнейшего промышленного производства данного иммуносупрессанта.
Список литературы/References
1. Ruzicka T. Tacrolimus: The drug for the turn of the millennium / T. Ruzicka, T. Assmann, B. Homey // Arch Dermatol. -1999. - №16. - P. 574—580.
2. Kino T. FK-506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces II. Immunosuppressive effect of FK-506 in vitro/ T. Kino, H. Hatanaka, S. Miyata, et al. // J Antibiotics. - 1987. - T.40. - P.1256-1265.
3. Sawada S. Novel immunosuppressive agent, FK506. In vitro effects on the cloned T cell activation/ S. Sawada, G. Suzuki, Y. Kawase, F. Takaku // J Immunol. - 1987. - T.139. - P. 1797-1803.
4. Клим Ф. Такролимус при трансплантации почки. Сообщение I / Ф. Клим // Нефрология. - 2007. - Т.11. - №2. -
C.8.
5. Sonthalia S. Comparative efficacy of tacrolimus 0.1% ointment and clobetasol propionate 0.05% ointment in oral lichen planus: a randomized double-blind trial / S. Sonthalia, A. Singal // J. Dermatol - 2012. - T.51(11). - P.1371.
6. Garg G. Clinical efficacy of tacrolimus in rosacea / G. Garg, G.P. Thami // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. - 2009. -T.23 (2). - P.239—40.
7. Kuldeep C. Randomized comparison of topical betamethasone valerate foam, intralesional triamcinolone acetonide and tacrolimus ointment in management of localized alopecia areata / C. Kuldeep, H. Singhal, A.K. Khare, A. Mittal, L.K. Gupta, A. Garg // J. Trichology. - 2011. - T.3(1). - P.20—4.
8. Evans A.V. The expanding role of topical tacrolimus in dermatology / A.V. Evans // Clin. Exp. Dermatol. - 2005. -T.30(2). - P.111—5.
9. Walker S.L. Use of 0.1% tacrolimus ointment in patients with various forms of lupus erythematosus / S.L. Walker, B. Kirby, R.J. Chalmers // Eur. J. Dermatol. - 2002. - T.12(4). - P.387—9.
10. Laino L. Palmoplantar pustular psoriasis: clinical and video thermographic evaluation before and after topical tacrolimus treatment / L. Laino, A. DiCarlo // Arch. Dermatol. - 2011. - T. 147(6). - P.760.
11. Lane D. J. Nucleic acid techniques in bacterial systematics: 16S/23S rRNA sequencing / D. J. Lane // Chichester, United Kingdom: John Wiley and Sons. - 1991. - P. 115-175.
12. Dzhavakhiya V.V., Glagoleva E.V., Popova E.D., Ovchinnikov A.I., Skryabin K.G., Shobolov D.L., Balabanyan V.Yu., Chernobrovkin M.G. Development of a New Amycolatopsis orientalis Strain for High-Yield Eremomycin Production/ V.V. Dzhavakhiya// Biotekhnologiya. - 2017. - No. 1. - P. 42-52.
13. Аксенова Е.Н. Методы обработки результатов измерений / Е.Н. Аксенова - М.: МИФИ, 2015. -10 c.
14. Глаголев В.И. Усовершенствование технологии биосинтеза такролимуса мутантным штаммов Streptomyces tsucubaensis T41-5 / В.И. Глаголев, Е.Д. Попова, А.И. Овчинников, В.В. Джавахия // III Международная конференция молодых учёных: биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов. - 2016. - C. 16.
15. Du W. Improved FK506 production by the precursors and product-tolerant mutant of Streptomyces tsukubaensis based on genome shuffling and dynamic fed-batch strategies / W. Du, D. Huang, M. Xia, J. Wen, M. Huang // J Ind Microbiol Biotechnol. - 2014. - T.41(7). - P.1131-43.
16. Turlo J. Enhancement of tacrolimus productivity in Streptomyces tsukubaensis by the use of novel precursors for biosynthesis / J. Turlo, W. Gajzlerska, M. Klimaszewska, M. Krol, M. Dawidowski, B. Gutkowska // Enzyme and Microbial Technology. - 2012. - T.51. - P.388- 395.
17. SangJoon M. Improvement of FK506 Production in the High-Yielding Strain Streptomyces sp. RM7011 by Engineering the Supply of Allylmalonyl-CoA Through a Combination of Genetic and Chemical Approach / M. SangJoon, L. Sung-Kwon, J. Ying-Yu, S. Joo-Won // J. Microbiol. Biotechnol. - 2016. - T.26(2). - P.233-240.
18. Пат. 2495937C1. Российская Федерация Способ получения такролимуса методом микробиологического синтеза Лобастова Т. Г., Гулевская С.А., Фокина В.В., Шутов А.А.; Николаева В.М., Донова М.В. 02.04.2012
Список литературы на английском языке / References in English
1. Ruzicka T. Tacrolimus: The drug for the turn of the millennium / T. Ruzicka, T. Assmann, B. Homey // Arch Dermatol. -1999. - №16. - P. 574—580.
2. Kino T. FK-506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces II. Immunosuppressive effect of FK-506 in vitro / T. Kino, H. Hatanaka, S. Miyata, et al. // J Antibiotics. - 1987. - T.40. - P. 1256-1265.
3. Sawada S. Novel immunosuppressive agent, FK506. In vitro effects on the cloned T cell activation / S. Sawada, G. Suzuki, Y. Kawase, F. Takaku // J Immunol. - 1987. - T.139. - P. 1797-1803.
4. Klim F. Takrolimus pri transplantacii pochki. Soobshchenie I [Tacrolimus in kidney transplantation. Report I] / F. Klim // Nefrologiya [Neurology] - 2007. - Т.11. - №2. - P.8. [In Russian]
5. Sonthalia S. Comparative efficacy of tacrolimus 0.1% ointment and clobetasol propionate 0.05% ointment in oral lichen planus: a randomized double-blind trial / S. Sonthalia, A. Singal // J. Dermatol - 2012. - T.51 (11). - P.1371.
6. Garg G. Clinical efficacy of tacrolimus in rosacea/ G. Garg, G.P. Thami // J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. - 2009. -T.23 (2). - P.239—40.
7. Kuldeep C. Randomized comparison of topical betamethasone valerate foam, intralesional triamcinolone acetonide and tacrolimus ointment in management of localized alopecia areata / C. Kuldeep, H. Singhal, A.K. Khare, A. Mittal, L.K. Gupta, A. Garg // J. Trichology. - 2011. - T.3 (1). - P.20—4.
8. Evans A.V. The expanding role of topical tacrolimus in dermatology / A.V. Evans // Clin. Exp. Dermatol. - 2005. -T.30 (2). - P.111—5.
9. Walker S.L. Use of 0.1% tacrolimus ointment in patients with various forms of lupus erythematosus / S.L. Walker, B. Kirby, R.J. Chalmers // Eur. J. Dermatol. - 2002. - T.12 (4). - P.387—9.
10. Laino L. Palmoplantar pustular psoriasis: clinical and video thermographic evaluation before and after topical tacrolimus treatment / L. Laino, A. DiCarlo // Arch. Dermatol. - 2011. - T.147 (6). - P.760.
11. Lane D. J. Nucleic acid techniques in bacterial systematics: 16S/23S rRNA sequencing / D. J. Lane // Chichester, United Kingdom: John Wiley and Sons. - 1991. - P. 115-175.
12. Dzhavakhiya V.V., Glagoleva E.V., Popova E.D., Ovchinnikov A.I., Skryabin K.G., Shobolov D.L., Balabanyan V.Yu., Chernobrovkin M.G. Development of a New Amycolatopsis orientalis Strain for High-Yield Eremomycin Production/ V.V. Dzhavakhiya// Biotekhnologiya. - 2017. - No. 1. - P. 42-52.
13. Aksenova E.N. Metody obrabotki rezul'tatov izmerenij [Methods of processing of measurement results] / E.N. Aksenova- M.: MIFI, 2015. -10 p. [In Russian]
14. Glagolev V.I. Usovershenstvovanie tekhnologii biosinteza takrolimusa mutantnym shtammov Streptomyces tsucubaensis T41-5 [Improvement of technology of biosynthesis of tacrolimus mutant strains of Streptomyces tsucubaensis T41-5] / V.I. Glagolev, E.D. Popova, A.I. Ovchinnikov, V.V. Dzhavahiya // III Mezhdunarodnaya konferenciya molodyh uchyonyh: biotekhnologov, molekulyarnyh biologov i virusologov [III International Conference of young scientists: biotechnologists, molecular biologists and virologists - Bulletin], - 2016. - P.16. [In Russian]
15. Du W. Improved FK506 production by the precursors and product-tolerant mutant of Streptomyces tsukubaensis based on genome shuffling and dynamic fed-batch strategies / W. Du, D. Huang, M. Xia, J. Wen, M. Huang // J Ind Microbiol Biotechnol. - 2014. - T.41 (7). - P.1131-43.
16. Turlo J. Enhancement of tacrolimus productivity in Streptomyces tsukubaensis by the use of novel precursors for biosynthesis / J. Turlo, W. Gajzlerska, M. Klimaszewska, M. Krol, M. Dawidowski, B. Gutkowska // Enzyme and Microbial Technology. - 2012. - T.51. - P.388- 395.
17. SangJoon M. Improvement of FK506 Production in the High-Yielding Strain Streptomyces sp. RM7011 by Engineering the Supply of Allylmalonyl-CoA Through a Combination of Genetic and Chemical Approach / M. SangJoon, L. Sung-Kwon, J. Ying-Yu, S. Joo-Won // J. Microbiol. Biotechnol. - 2016. - T.26 (2). - P.233-240.
18. Pat. 2495937C1. Rossijskaya Federaciya Sposob polucheniya takrolimusa metodom mikrobiologicheskogo sinteza [Method of obtaining of tacrolimus by microbiological synthesis method] Lobastova T. G., Gulevskaya S.A., Fokina V.V., SHutov A.A.; Nikolaeva V.M., Donova M.V. 02.04.2
DOI: https://doi.org/10.23670/IRJ.2017.65.131 Козлов С.Н.1, Марков Е.Ю.2, Николаев В.Б.3, Миронова Л.В.4, Миткеева С.К.5, Урбанович Л.Я.6
Научный сотрудник, 2старший научный сотрудник, доктор биологических наук, 3старший научный сотрудник,
кандидат медицинских наук, 4ведущий научный сотрудник, кандидат медицинских наук, 5лаборант, 6старший
научный сотрудник, доктор медицинских наук, Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора ЗИМОГРАФИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ ГИДРОЛАЗ VIBRIO CHOLERAE O1 И O139 СЕРОГРУПП С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕЦИФИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ
Аннотация
Цель работы. Зимографическая детекция гидролитических ферментов в субклеточных фракциях и супернатантах культуральной жидкости штаммов Vibrio cholerae О1 El Tor и V. cholerae О139 с использованием различных субстратов.
Материалы и методы. В работе исследовали препараты наружной мембраны, мочевинных экстрактов и супернатантов культуральной жидкости 16 штаммов V. cholerae El Tor О1 и О139 серогрупп разного происхождения. Гидролазы выявляли методом субстратного электрофореза в полиакриламидном геле и в реакции радиальной энзимодиффузии в агарозном геле с инкорпорированными растворимыми специфическими субстратами.
Результаты и выводы. В препаратах наружной мембраны, мочевинных экстрактов и супернатантов культуральной жидкости, полученных из большинства штаммов V. cholerae El Tor O1 и O139, зимографически выявлено наличие гидролаз, обладающих хитозаназной, липолитической, муциназной, лецитиназной, РНК-азной и протеазной активностью. Обнаружены количественные и качественные различия в спектре гидролаз и их активности у взятых в исследование препаратов. Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования зимографических методов для определения наличия, изучения состава и свойств ферментов холерного вибриона.
Ключевые слова: Vibrio cholerae, зимография, гидролитические ферменты.
Kozlov S.N.1, Markov E.Yu.2, Nikolaev V.B.3, Mironova L.V.4, Mitkeeva S.K.5, Urbanovich L.Ya.6
Scientist researcher, 2Senior scientist researcher, PhD in Biology, 3Senior scientist researcher, MD, 4Leading researcher, MD,
5Laboratory assistant, 6Senior scientist researcher, MD, Irkutsk Antiplague Research Institute of Rospotrebnadzor WINTERGRAPHICAL DETECTION OF HYDROLYSIS VIBRIO CHOLERAE O1 AND O139 OF SEROGROUPS
USING SPECIFIC SUBSTRATES
Abstract
Objectives. Wintergraphical detection of hydrolytic enzymes in subcellular fractions and supernatants of the culture fluid of strains of Vibrio cholerae O1 El Tor and V. cholerae O139 with the use of various substrates.
Methods and materials. The samples of the outer membrane, urea extracts and supernatants of the culture liquid of 16 strains of V. cholerae El Tor O1 and O139 serogroups of different origin were studied. The hydrolases were detected by substrate electrophoresis in a polyacrylamide gel and in the radial enzymodiffusion reaction in an agarose gel with incorporated soluble specific substrates.
Results and conclusions. In the samples of the outer membrane, urea extracts and supernatants of the culture liquid, obtained from most strains of V. cholerae El Tor O1 and O139, the presence of hydrolases with chitosanase, lipolytic, mucinase, lecithinase, RNA-tic and protease activity was shown in zoomorphology. Quantitative and qualitative differences in the spectrum of hydrolases and their activity in the samples taken into the study were found. The obtained data indicate the prospects of using the wintergraphical methods for determining the presence, studying the composition and properties of the enzymes of the cholera vibrio.
Keywords: Vibrio cholerae, wintergraphics, hydrolytic enzymes.
Проблема холеры остаётся актуальной в связи с продолжающимся её пандемическим распространением. Это свидетельствует о необходимости всестороннего изучения возбудителя заболевания, включая особенности его энзимома (части протеома, обладающего ферментативной активностью). Большой интерес вызывают гидролитические ферменты микроорганизма, играющие роль в проявлении патогенности нехолерогенных вибрионов, и дополнительных факторов, усиливающих вирулентность холерного вибриона [4], [5], [10]. Установлено участие некоторых гидролаз, таких как нуклеазы и хитиназы, в выживании холерного вибриона в объектах окружающей среды (ООС) и формировании биоплёнки [8, 9]. Интерес к гидролазам, как возможным факторам патогенности возбудителя, обусловлен и тем, что выявленные ферменты могут быть использованы в качестве компонентов субъединичной вакцины против холеры [1], а также для создания антибактериальных противоферментных препаратов [11]. Однако к настоящему времени гидролитические ферменты холерного вибриона O1 и O139 серогрупп изучены далеко не полностью, в литературе данных о уставе, активности ферментов, их субстратной специфичности и межштаммовых
