CC BY
62
КРАТКИЕ СООБЕЩНИЯ
© ЕВТУХОВА Е.Н.
УДК 577.175.532.087:543.257.5
РАЗРАБОТКА ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЙ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЬДОСТЕРОНА В
МОДЕЛЬНОМ РАСТВОРЕ
Е.Н. Евтухова
Новосибирский государственный медицинский университет, ректор - д.м.н., проф. И.О. Маринкин; кафедра фармацевтической химии, зав. - Е.А.
Ивановская
Резюме. Разработана экспресс - методика количественного определения альдостерона методом инверсионной вольтамперометрии.
Экспериментальным путем были установлены состав и концентрация фонового раствора, потенциал и время электролиза, найдена оптимальная скорость развертки потенциала. В качестве рабочего электрода был использован стеклоуглеродный. Электродом сравнения служил хлорсеребряный электрод.
Ключевые слова: альдостерон, вольтамперометрия, экспресс - методика.
Евтухова Елена Николаевна - ведущий документовед отдела координации диссертационных советов по защите докторских и кандидатских диссертаций; соискатель кафедры фармацевтическая химия НГМУ; e-mail: ktyfl @mail.ru.
Альдостерон - главный минералокортикоид. Образуется в корковом слое надпочечников под контролем системы ренин-ангиотензин. Стимулирует транспорт натрия через почечные канальцы [1].
Определение уровня альдостерона имеет важное диагностическое значение для дифференциальной диагностики гипертензии, диагностики почечной
недостаточности, контроля за лечением сердечной недостаточности, а также при лечении препаратами, блокирующими адренергическую систему [1].
В настоящее время в диагностической практике для определения уровня альдостерона используют иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ и тонкослойную хроматографию. Основными недостатками данных методов являются: длительность проведения анализа, при учете результатов реакции все тест-системы иммуноферментного анализа невозможно привести к единому стандарту. Один и тот же образец может давать в разных тест-системах совершенно иной уровень окрашивания раствора субстрата. Труднодоступные и токсичные реактивы, такие как метанол, условия работы с радиоактивными изотопами (в случае радиоимунного анализа) и длительная пробоподготовка (применительно к тонкослойной хроматографии)[2].
Для объективного суждения о концентрации данного гормона необходимо создание экспресс-методики, что и явилось целью нашей работы.
Материалы и методы
В своей работе мы использовали вольтамперометрический метод анализа, учитывая его высокую чувствительность, селективность, экспрессность и простоту выполнения.
Экспериментальные данные были получены на полуавтоматическом анализаторе ТА-4 (НПП «Техноаналит», Томск) с программным обеспечением в комплекте с персональным компьютером. Источником информации служили поляризационные кривые.
Стандартный раствор альдостерона готовили из субстанции альдостерона предоставленной компанией «Sigma-aldrich» производства компании «Fluka» (Италия) методом сухой навески. В работе были использованы электроды: стеклоуглеродный - в качестве индикаторного и хлорсеребряный - в качестве электрода сравнения.
В эксперименте использовали кварцевую посуду, одноканальные дозаторы на 5 - 50 мкл, 10-1000 мкл, 1-10 мл со сменными наконечниками.
Деаэрирование анализируемого раствора в стадии электролитического накопления осуществляли газообразным азотом.
Результаты и обсуждение Первым этапом в процессе разработки методик является выбор рациональных условий обнаружения аналитического сигнала: состав и
концентрация фонового электролита, время электролиза, потенциал накопления, природа рабочего электрода, оценка степени влияния ряда органических и неорганических соединений, присутствие которых возможно в биологических объектах.
В качестве рабочего электрода был выбран стеклоуглеродный электрод, представляющий собой стеклянный полый стержень, в который запакована под вакуумом медная проволока с прикрепленным серебряным стержнем, выполняющим функции проводника и служащим для закрепления электрода в приборе. Рабочей поверхностью является стеклоуглеродная подложка, которая находится на рабочем конце электрода и помещается в датчик. Альдостерон легко адсорбируется на рабочей поверхности стеклоуглерода, это позволяет концентрировать его на электроактивном электроде.
Для увеличения электропроводности растворов альдостерона и обеспечения оптимальных условий проведения электродного процесса исследован ряд электролитов: гидроксидов натрия, калия; хлоридов натрия, кальция; фосфата и гидрофосфата натрия; нитратов натрия, алюминия, аммония. Исходя из полученных результатов, в качестве фонового электролита был выбран раствор алюминия нитрата, так как при его использовании на вольтамперограмме наблюдалась чёткая волна восстановления альдостерона. Кроме того, данный раствор обеспечивал широкую рабочую область и необходимую площадь для обработки сигнала [3].
Оптимальная концентрация раствора алюминия нитрата составила 0,1 моль/л. В более концентрированных растворах мы не наблюдали прироста величины волны вольтамперограммы от добавки стандартного раствора
альдостерона, тогда как более разбавленный раствор не обеспечивал необходимую площадь для обработки сигнала [3].
Диапазон возможных значений pH фонового электролита составил 3,0 - 4,0. В нейтральной среде при подобранных условиях сигнал альдостерона отсутствовал, а в щелочной - резко сужалась рабочая область и возрастала величина остаточного тока, при этом невозможно было зафиксировать высоту волны альдостерона. Результаты эксперимента показали, что оптимальным решением является электролиз без добавления дополнительных буферных растворов, что соответствует необходимым границам pH 3,0 - 4,0.
Аналитический сигнал регистрировали при значении потенциала 0,7 В (рис. l).
Рис. 1. Вольтамперограмма аналитического сигнала альдостерона в
модельном растворе. 1- линия фонового электролита; 2- линия пробы; 3- линия стандартного раствора.
Потенциал и время электролиза являются определяющими факторами методики. Принимая во внимание тот факт, что потенциал электролиза (Еэ) должен способствовать максимально полному выделению определяемого вещества без мешающего влияния других ионов, экспериментальным путем было установлено оптимальное значение Еэ на основе стандартного раствора концентрацией l-l0" мг/мл. Полученная нами зависимость имела выраженный максимум при Еэ = 0,4 В. (рис. 2). При этом достигается максимальное значение величины аналитического сигнала и хорошая воспроизводимость для количественного определения альдостерона. Смещение потенциала электролиза в более отрицательную или положительную область приводило к уменьшению величины регистрируемого анодного тока и затрудняло обработку вольтамперограмм.
Условия определения: фон - 0,l Моль/л Al(NO3)2; k, - 60 сек.; Wj, - 90 мВ/с;
концентрация альдостерона в ячейке -110-7 мг/мл.
Рис. 2. Зависимость величины силы тока аналитического сигнала
альдостерона от потенциала электролиза.
Длительность процесса электролиза (tj) также была выбрана экспериментально на основе раствора стандартного образца с концентрацией 1-10 мг/мл.
Оптимальное время накопления альдостерона на электроде составило 60 с. При этом достигается максимальное значение величины тока растворения накопленных осадков с поверхности стеклоуглеродного электрода и хорошая воспроизводимость результатов его количественного определения. При увеличении времени накопления более 60 с происходит насыщение осадка на электроде, аналитический сигнал альдостерона искажается и затрудняется обработка полярограмм. При времени накопления менее 60 с величина тока растворения не достигает максимального значения, что снижает чувствительность определения исследуемого вещества
Условия определения: фон - 0,1 Моль/л Al(NO3)2; Еэ =0,4 В; Wр - 90 мВ/с; концентрация альдостерона в ячейке -110"7 мг/мл.
Рис. 3. Зависимость силы тока от времени электролиза.
Зависимость величины силы тока аналитического сигнала от концентрации альдостерона носит прямолинейный характер. Как видно из графика, прирост от добавки стандартного раствора наблюдается лишь до определенного значения, после чего, концентрация остается постоянной, достигнув максимального значения (рис. 4).
Концентрация альдостерона Сп -10"7 мг/мл Условия определения: фон - 0,1 Моль/л Al(NO3)2, Еэ = 0,4 В; k, - 60 сек.; Wр -90 мВ/с.
Рис. 4. Зависимость силы тока от концентрации альдостерона.
Экспериментально найденная оптимальная скорость развертки потенциала составила 90 мВ/с. Изменение скорости развертки потенциала в сторону увеличения или уменьшения заметно снижало высоту аналитического сигнала,
при этом уменьшалась и разрешающая способность метода, что затрудняло обработку полярограмм, увеличивало время анализа и не позволяло определять очень низкие концентрации альдостерона. Для определения альдостерона оптимальной оказалась квадратно-волновая скорость развертки потенциала, при которой наиболее четко просматривался аналитический сигнал.
Чувствительность предлагаемого вольтамперометрического способа определения альдостерона в модельном растворе составляет 10 -4 - 10-10 мг/мл.
С целью проверки воспроизводимости результатов определения альдостерона по разработанной методике был проведен тест «введено -найдено» для проб с концентрацией, 1 • 10-4, 1 • 10-7, 1 • 10-10 мг/мл, по десять проб для каждой (табл. l).
Таблица 1
Результаты теста «введено-найдено» количественного определения альдостерона в модельном растворе
Полученные в ходе исследования результаты подвергли статистической обработке, которая показала, что относительная погрешность измерения в модельном растворе составила 1,5%, что не превышает ошибку метода (табл. 2).
В ряду полученных результатов не было ни одного из 10 значений выходящих за пределы Х ± 2S; что свидетельствует о нормальном распределении полученных результатов [3].
Таблица 2
Расчет относительной ошибки метода (є)
Повышение значимости использования результатов лабораторных исследований для принятия ответственных клинических решений привлекает в последнее время все большее внимание исследователей-фармакологов, провизоров, клиницистов, лабораторных специалистов.
Разработанная методика адаптирована и может быть использована в лабораторной диагностике для определения уровня альдостерона в различных биологических объектах (сыворотке крови, моче, слюне).
THE DEVELOPMENT OF VOLTAMPEROMETRIC METHOD, MEASURING THE COUNT OF ALDOSTERON IN THE MODEL LIQUID
E.N. Evtukhova Novosibirsk State Medical University
Abstract. There was developed a new rapid method to measure the count of aldosteron, using the method of inversion voltamperometry. The composition and concentration of a base solution, the potential and time of catholysis have been experimentally established, also found the optimal speed of potential sweep. The carbon glass was used as a working electrode. A Silver chloride electrode served as an electrode comparison.
Keywords: aldosteron, voltamperometry, rapid method.
Литература
1. Камышников В. С. О чем говорят медицинские анализы. - М.: МЕДпресс-информ, 2005. - 176 с.
2. Кривенчук Н. А., Решетников Н. А. Современные методы лабораторной диагностики (ИФА, ПЦР). - Новосибирск: Изд-во ООО «Нонпарель», 2004. -90 с.
3. Пат. 2337361 Рос. Федерация. Вольтамперометрический способ
количественного определения альдостерона / Е.Н. Евтухова, Е.А. Ивановская, И.Е. Бадажкова и др.; Новосиб. гос. мед. университет - № 2007119751; опубл.: 27.10.2008, Бюл. № 30.- 3 с.
